Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar los raros intermedios de reprogramación de los cultivos de fibroblastos embrionarios de ratón en reprogramación. Esto se logra derivando primero fibroblastos embrionarios de ratón a partir de embriones E 13.5 de una cepa de ratón reprogramable. En el segundo paso, los fibroblastos embrionarios de ratón de paso bajo se siembran en medios de células madre pluripotentes inducidas o IPS suplementados con doxiciclina para iniciar el proceso de reprogramación.

A continuación, las células se recolectan en puntos de tiempo seleccionados durante la reprogramación y se marcan con anticuerpos contra marcadores específicos de la superficie celular. En última instancia, los raros intermedios de reprogramación pueden ser aislados por hechos para un análisis experimental posterior. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes es que se pueden realizar estudios mecanicistas sobre los raros intermedios de reprogramación en ausencia de células refractarias al proceso de reprogramación, que constituyen la mayor parte de la población Para generar embriones de ratón, fibroblastos o mes, se comienza transfiriendo un cuerno uterino embrionario de 13,5 días a una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros que contiene 10 mililitros de PBS estéril.

Luego, use tijeras esterilizadas de grado quirúrgico para cortar el cuerno en pedazos individuales, cada uno con un embrión. A continuación, bajo un microscopio de disección en una campana de cultivo de tejidos, utilice pinzas esterilizadas para extraer cuidadosamente la envoltura uterina y la membrana embrionaria adicional que rodea a cada embrión y transfiera cada embrión desnudado a platos individuales de 10 centímetros con 10 mililitros de PBS fresco. A continuación, proceda a extraer la cabeza, las extremidades, la cola y los órganos internos de cada embrión con fórceps.

Congele las cabezas en tubos individuales de 1,5 mililitros para el genotipado según sea necesario. Transfiera cada torso a nuevas placas individuales de 10 centímetros y use dos cuchillas quirúrgicas para picar cada embrión durante dos minutos. Digiera los trozos de tejido en 200 microlitros de tripsina EDTA durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente, seguidos de dos minutos adicionales de picado.

A continuación, inactive la prueba con dos mililitros de medio de metanfetamina y transfiera la suspensión de células a un tubo de 15 mililitros utilizando una pipeta de 1000 microlitros. Disocie mecánicamente el tejido con un pipeteo suave y luego transfiera la solución celular a un plato de 10 centímetros recubierto de gelatina. Agregue 10 mililitros adicionales de medio de metanfetamina al cultivo.

Después de 24 a 48 horas, la placa debe cubrirse densamente con MEFs para reprogramar los MEF, primero descongelar un cultivo de metanfetamina congelada de paso bajo en un baño de agua a 37 grados Celsius y luego transferir el contenido a un tubo que contenga 10 mililitros de medios de metanfetamina precalentados. Después de centrifugar las células, vuelva a suspender el pellet en 12 mililitros de medio de metanfetamina fresco y transfiera la suspensión celular a un recipiente de cultivo T 75 recubierto de gelatina. Después de un período de recuperación de 24 a 48 horas, lave los MEF con PBS y luego separe las celdas con tres mililitros de tripsina EDTA durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, detenga la digestión enzimática con cinco mililitros de metanfetamina y disocie aún más las células mezclándolas suavemente con una pipeta de 10 mililitros. A continuación, reprograme los mets sembrando las células en nuevos matraces de gelatina T 75 recubiertos a 6,7 veces 10 por tercera célula por centímetro cuadrado en 12 mililitros de medios IPSC que contengan dos microgramos por mililitro de doxiciclina durante los primeros seis días. Reemplace el medio cada dos días con medios IPSE suplementados con doxiciclina fresca, recolectando los intermedios de reprogramación en los puntos de tiempo requeridos mediante el desprendimiento de tripsina EDTA, como se acaba de demostrar para cada suspensión intermedia cosechada.

Lave las células en PBS. A continuación, resus. Suspenda los gránulos en los medios de fax para el etiquetado de anticuerpos y el establecimiento de cultivos IPSC completamente reprogramados.

Cultive las células en medios IPSC libres de doxiciclina durante otros cuatro a siete días para etiquetar las células reprogramadas. Etiquete los intermedios cosechados con los anticuerpos apropiados de interés. Después de 10 minutos, golpee suavemente los tubos para volver a suspender las células y luego colóquelos en hielo durante 10 minutos más.

Después de la segunda incubación, lave las células en 10 mililitros de PBS frío por tubo. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en un volumen adecuado de medios de etiquetado complementados con un pinzón P tamaño siete en hielo. Después de 20 minutos, lave las células en otros 10 de PBS frío y vuelva a suspender los gránulos de células en un medio de marcado suplementado con yoduro de propidio.

Filtre los grumos de células pasando la suspensión a través de un colador de 70 micrómetros y luego transfiera las células a los tubos de fax correspondientes apropiados en hielo. Para los controles de compensación. Resus suspende un vial criogénico de células IPS mantenidas en MES irradiadas en 800 microlitros de tampón de marcaje.

Reservando 200 microlitros de celdas para el control de control sin etiquetar. A continuación, divida la suspensión celular restante entre tres tubos de 15 mililitros para los controles de un solo color y etiquete las muestras como se acaba de demostrar para analizar los intermedios mediante citometría de flujo. Comience por establecer una puerta en el diagrama de dispersión de avance a lado para excluir los residuos.

A continuación, utilice la altura de dispersión directa frente al área de dispersión directa para excluir los agregados y el canal PI frente a la dispersión directa. Para compuerta en las células vivas PI negativas. Utilice las celdas sin etiquetar para ajustar los voltajes para el azul del Pacífico FITC y PSI de siete canales.

Posicionando idealmente la población celular en el extremo inferior del canal respectivo. A continuación, configure las puertas con las celdas de control sin etiquetar para subfraccionar los cultivos de reprogramación en el día tres, seis y nueve. Poblaciones de SSEA: una célula TH 1.2 negativa para SSEA, una célula negativa TH 1.2 negativa y los intermedios de reprogramación, una célula TH 1.2 negativa para SSEA.

A continuación, subdivida aún más la fracción negativa de SSEA del día nueve, TH 1,2 positivo con la gráfica SSEA uno frente a EPAM. Uso de las puertas de extracción de control sin etiquetar alrededor de las celdas EPAM positivas y las celdas EPAM negativas, como se muestra aquí. Finalmente, recoja las células en uno o dos mililitros de medios celulares IPS.

Tras la inducción de la doxiciclina, los mitos de reprogramación sufren distintos cambios morfológicos alrededor del sexto día. Comienzan a surgir parches tempranos como colonias que continúan creciendo en tamaño a medida que se cultivan más. Un buen experimento de reprogramación dará como resultado más de 500 colonias por T 75 inicialmente sembradas con cinco veces 10 a la quinta celda, y los cultivos IPS establecidos poseerán colonias características en forma de cúpula y estarán en su mayoría desprovistos de células diferenciadas.

Los cambios morfológicos y moleculares durante la reprogramación se reflejan en cambios en la expresión de la superficie celular del muslo 1.2 SSEA uno y, en última instancia, epca. Mientras que los MES son predominantemente positivos para el muslo 1.2 y negativos para los otros marcadores, al tercer día, una gran proporción de células han comenzado a regular a la baja la expresión del muslo 1.2, y un subconjunto muy pequeño se ha convertido en SSEA uno positivo. El intermedio de reprogramación real para este punto de tiempo en los días seis y nueve, un mayor porcentaje de células positivas para SSEA uno, generalmente muy por encima del 10%, se puede detectar alrededor del día 12.

Se puede detectar un subconjunto de células SSEA one positivas que también son positivas. Para epca. Los cultivos celulares IPS establecidos de buena fe serán muy positivos.

Para SSEA one y EPCA Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo debe utilizar mapas de paso bajo que hayan sido correctamente genotipados de antemano.