Name: 协议生物膜形成的流光在微流体器件与微柱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习使用微流控芯片与微柱阵列研究Pseudomonas fluorescens生物膜形成的方法。该方案通过荧光显微镜实时捕捉细菌流丝的时间演化过程，为理解多孔介质中的生物膜动态提供可视化工具。

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作者谨此感谢卡尔加里大学生物科学系的 Howard Ceri 教授提供细菌菌株。A. Kumar 感谢自然科学与工程研究理事会（NSERC）提供的支持。T. Thundat 感谢加拿大卓越研究讲席（CERC）计划提供的经费支持。作者还感谢 Zahra Nikakhtari 女士在视频拍摄方面提供的帮助。

请按照下述顺序执行实验方案。第1步介绍了用于构建微流控平台的微加工工艺。第2步描述了细菌培养方案（图2），第3步涉及实验装置的组装（图3）。最后，第4步详细说明了实际的实验操作步骤。
1. 芯片制备流程
注意：必须遵循以下所述操作的适当安全规程。详情请咨询机构安全官员。
<ol>
	<li>使用合适的软件设计掩模（例如，L-Edit）。通道设计包含一条主微通道，宽度为625 μm。通道的中央区域设有直径为50 μm、间距为25 μm的微柱阵列（见补充文件）。</li>
	<li>将此设计打印在玻璃（5&#34; × 5&#34; 苏打石灰玻璃），厚度为0.09&#34; 并使用掩膜技术在其表面涂覆一层约70 nm厚的铬（Cr）层，以制备光刻掩模。用AZ400K显影液显影1分钟，随后用铬蚀刻液蚀刻铬层约1分钟。使用丙酮剥离光刻胶，并用冷王水（H2SO4 和 H2O2 3:1 的比例</li>
	<li>光刻技术
	<ol>
		<li>清洁标准4&#34; 用 piranha 溶液对硅片进行化学处理 20 分钟。</li>
		<li>用去离子水冲洗晶圆并将其干燥。</li>
		<li>将晶圆置于加热板上加热（200 °C，15 分钟）。</li>
		<li>在硅片上涂覆光刻胶。此处，将正性光刻胶AZ4620以2,000 rpm的转速旋涂于硅片上，持续25秒，得到厚度为12.5 μm的涂层。</li>
		<li>将晶圆置于热板上漂浮加热90秒，通过软烘去除所有溶剂&#160;在氮气流中于100 °C下进行，然后在相同温度下保持真空60秒。</li>
		<li>将晶圆置于暗盒中静置24小时以进行脱水。</li>
		<li>将晶圆暴露于紫外光下，以将设计好的图案转移到光刻胶上。</li>
		<li>将晶圆浸入光刻胶显影液（AZ400K）中显影240秒，然后用异丙醇冲洗晶圆，并置于氮气气流中吹干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ICP-DRIE（电感耦合等离子体-深反应离子刻蚀）工艺
	<ol>
		<li>进行DRIE刻蚀。根据器件所需的最终深度选择合适的刻蚀深度（本研究中为50 μm）。光刻胶在此过程中用作掩模层。</li>
		<li>用丙酮去除残留的光刻胶并清洗晶圆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS（聚二甲基硅氧烷）浇铸
	<ol>
		<li>使用三氯甲基硅烷（TCMS）对硅胶母模进行硅烷化处理。取2至3滴三氯甲基硅烷滴入样品瓶中，置于干燥器内硅胶母模旁。静置2至3小时，完成硅烷化过程。</li>
		<li>在另一个容器中，按10:1的质量比将Sylgard 184硅胶基质与固化剂混合，以制备PDMS。将PDMS置于真空条件下脱气（约2小时）。</li>
		<li>将硅胶母模放入支架中，然后将PDMS倒入硅胶母模上以制备PDMS印章。此过程中需确保PDMS中无气泡产生。</li>
		<li>在 80 °C 下固化 PDMS 2 小时。</li>
		<li>从母模上剥离PDMS印章，然后将PDMS印章切割成独立的微芯片。最后，使用打孔器钻出进样口和出样口的孔洞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS与玻璃的键合
	<ol>
		<li>将盖玻片和PDMS印章置于氧气等离子体中处理30秒。将PDMS印章与盖玻片键合。</li>
		<li>为实现PDMS印章与盖玻片之间的适当密封，将装置置于70 °C烘箱中退火10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细菌培养
注意：步骤 2-4 必须遵循适当的生物安全规程。具体细节请咨询机构安全负责人。
<ol>
	<li>制备 LB 琼脂平板
	<ol>
		<li>将 20 g Luria-Bertani（LB）琼脂（Miller）粉末和 500 ml&#160;超纯水加入 1 L 三角瓶中。搅拌至粉末完全溶解。</li>
		<li>在 15 psi、121 °C 条件下高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>将三角瓶置于生物安全柜中的台面或水浴中，冷却至 50–55 °C。</li>
		<li>加入四环素抗生素，使其终浓度为 50 μg/ml。轻轻旋转混匀。</li>
		<li>将混合液倒入培养皿中，每皿填充至 1/2 至 2/3 满。</li>
		<li>如有气泡形成，可用火焰短暂灼烧以消除气泡。凝固后的气泡会影响细菌涂布的均匀性。</li>
		<li>将平板在室温下静置过夜，使其冷却凝固。</li>
		<li>冷却后，将平板放回包装袋中，密封袋口，贴上标签（注明抗生素种类和日期），并于 4 °C 保存。 
		注意：应使用锡箔纸包裹平板库存，因为光照会使多种抗生素失活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 液体培养基的制备
	<ol>
		<li>将 20 g Luria-Bertani（LB）液体培养基（Miller）粉末和 1 L&#160;超纯水加入一个&#160;三角瓶中。搅拌至粉末完全溶解。</li>
		<li>在 15 psi、121 °C 条件下高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>将三角瓶置于生物安全柜中的台面或水浴中，冷却至 50–55 °C。</li>
		<li>加入四环素抗生素，使其终浓度为 50 μg/ml。轻轻旋转混匀。</li>
		<li>冷却后，将已标记的瓶子置于 4 °C 保存。 
		注意：应使用锡箔纸包裹瓶子，因为光照会使多种抗生素失活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 LB 琼脂平板上培养细菌（本方案使用 Pseudomonas fluorescens）
	<ol>
		<li>从冰箱（-80 °C）中取出细菌保藏株，并置于冰上。</li>
		<li>将 -80 °C 保存的细菌保藏株和一块 LB 琼脂平板放入生物安全柜中。</li>
		<li>用接种环将细菌菌株以“之”字形划线接种于 LB 琼脂平板上。盖好平板后，在 30 °C 下培养过夜。最后将平板于 4 °C 冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备细菌溶液（S1）
	<ol>
		<li>向已灭菌的三角瓶中加入 50 ml LB 液体培养基。此操作应在生物安全柜内进行。</li>
		<li>从 LB 琼脂平板上挑取单个细菌菌落，转移至三角瓶中。此操作也应在生物安全柜内进行。</li>
		<li>将三角瓶置于摇床培养箱中，在 30 °C、150 rpm 条件下振荡培养适当时间（4 小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备稀释细菌溶液（S2）
	<ol>
		<li>向已灭菌的塑料离心管中加入 5 ml LB 液体培养基。</li>
		<li>将 S1 与 LB 液体培养基混合进行稀释，随后涡旋振荡混匀。稀释至所需光密度（在 600 nm 处测得的 OD = 0.1）。 
		注意：生物膜实验通常采用此范围内的 OD 值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 准备实验装置
<ol>
	<li>使用镊子将柔性塑料管（内径 0.20&#34;）连接至微流控芯片的进样口和出样口。这些进样口和出样口此前已在微流控芯片的 PDMS 部分钻孔制备（步骤 1.5.5）。本研究中，微流控芯片包含两个进样口和一个出样口。</li>
	<li>用细菌溶液（S2 溶液）填充注射器，并彻底排除注射器内的所有气泡。</li>
	<li>将注射器针头（30 G 0.5&#34; 平头针）连接至进样管，然后将出样管连接至废液容器。</li>
</ol>
4. 运行实验
<ol>
	<li>将注射器连接至注射器针头。</li>
	<li>将注射器放置并固定在注射泵上。然后将微芯片置于光学显微镜下，使用所需放大倍数的物镜镜头例如，40倍）。用活细胞培养装置覆盖微流控芯片，以维持细菌生长所需的恒定温度环境（30 °C） P. fluorescens).</li>
	<li>将泵设置为所需的流速（例如 10 μl/hr），并启动液体泵送。</li>
	<li>一旦将细菌引入腔室，生物膜的形成也随之开始。生物膜的形成与成熟通常需要数小时甚至数天的时间。通过显微镜观察并拍摄生物膜生长过程的图像。</li>
</ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
<li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li>
<li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li>
<li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li>
<li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contam+Hydrol%22%5BJournal%5D)">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li>
<li>Neethirajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeethirajan%2C+S+%22Encylopedia+of+Nanotechnology%22">Encylopedia of Nanotechnology</a>. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).</li>
<li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li>
<li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1312.6056%22%5BJournal%5D)">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li>
<li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media%3A+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们展示了一种简单的微流控装置，可模拟多孔介质，用于研究复杂生境中生物膜的发育过程。实验结果取决于若干关键步骤，其中包括装置的几何结构。虽然柱状结构的几何形状可以变化，但必须提供足够的孔隙空间以支持丝状生物膜（streamers）的形成。此外，Valiei 等.1 已证明，丝状生物膜的形成仅发生在特定的流速范围内。当流速低于某一阈值时，生物膜可能不会变形形成丝状结构；而当流速超过另一个较高的阈值时，生物膜可能发生断裂，从而抑制丝状结构的形成。另一个可能影响实验的问题是气体气泡可能被困在微柱阵列中。通常需要先提高流速以清除这些气泡，然后再逐步将流速降低至目标值。
此类微流控平台具有多种优势且局限性较少。该平台使我们能够使用较小的培养体积，并具有整合用户自定义特征的灵活性。例如，通过改变微柱阵列的几何参数，可以模拟不同的多孔结构。甚至可以利用微流控平台制造出模拟真实多孔介质随机结构的装置18。此外，可在单个装置上集成多个此类通道，从而收集大量相关数据，用于精确的统计分析。然而，微流控系统通常仅能模拟多孔介质的二维结构。能够模...

最近，我们在一种模拟多孔介质的微流控装置中展示了细菌生物膜的形成动态1细菌生物膜本质上是由胞外聚合物（EPS）包裹的、在表面聚集形成的细菌群落。2-4这些细菌薄膜几乎可以在所有可想象的生态位中形成，从光滑表面到多孔介质中更为复杂的生境皆可。Valiei 等.1 使用带有微柱阵列的微流控装置模拟多孔介质结构，并研究了在该装置中生物膜形成随流体流速的变化情况。他们发现，在特定流动条件下，不同微柱之间开始出现被称为“流苏状生物膜”（streamers）的丝状生物膜结构。这些流苏状结构可一端或两端固定于固体表面，其余部分则悬浮于液体中。流苏状生物膜通常在初始生物膜层形成后开始出现，其形成过程可主导此类复杂生境中生物膜的长期演化。近期，多位研究人员已对流苏状生物膜的形成动力学进行了研究。Yazdi 等.5 表明射流可在源自振荡气泡的涡流中形成。在另一项实验中，Rusconi 等.6 研究了通道曲率和通道几何形状对流线体形成的影响。他们发现，流线体可在微通道的弯曲段形成，且流线体的形态与微生物的运动性相关。近期研究表明，流线体在多种自然和人工场景中可能产生广泛影响，因其可作为多孔界面中成熟结构形成的前体，导致生物医学系统中生物膜的快速且灾难性增殖，并引发显著的流体-结构相互作用。 等等1,7-9.
生物膜纤丝常在多孔介质等复杂生境中形成。研究生物膜在多孔介质环境中的生长规律，对于诸多环境与工业过程（如生物废水处理）具有重要意义10，维持井筒完整性在诸如 CO2 捕获11 以及土壤孔隙的堵塞12在多孔介质等复杂环境中观察生物膜的形成往往具有挑战性，原因在于多孔介质的不透明性。在这些情况下，基于微流控技术的多孔介质平台可展现出显著优势，因其能够实现对生物膜形成过程的实时观察和 在&#160;原位 监测。微流控技术的另一优势在于，能够在单一的生物微流控平台上构建多个生物反应器，并同时实现在线监测和/或传感器的集成。微流控系统能够在同一装置中灵活地开展多项实验室实验，并具备收集大量相关数据以进行精确统计分析的能力，这是其重要的优势之一。13,14.
在上述讨论的背景下，理解多孔介质环境中流式放电（streamer）形成的动力学过程将对多个应用领域具有重要意义。在本研究中，我们建立了用于研究模拟多孔介质装置中流式放电形成的实验方案。文中描述了微流控平台的制备过程、细胞培养及实验所必需的步骤。在实验中，我们采用了荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的野生型细菌菌株。P. fluorescens 天然存在于土壤中，在维持土壤生态方面起着关键作用15。所使用的细菌菌株经过基因工程改造，能够持续表达绿色荧光蛋白（GFP）。

<table><tbody><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>将 40 g 溶于 1 L 纯化水中</td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>将 20 g 溶于 1 L 纯化水中</td></tr><tr><td>生物安全罩</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>无菌 100 mm × 15 mm 聚苯乙烯培养皿</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 摇床培养箱系列</td></tr><tr><td>50 ml 无菌离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>聚丙烯，无 RNase/DNase</td></tr><tr><td>四环素碱基</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &amp;#956;g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅胶</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>弹性体基料和固化剂</td></tr><tr><td>正性光刻胶（AZ4620）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料管</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

微流控芯片中微柱结构内生物膜流束形成的实验方案

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

多种细菌具有附着于表面并以称为生物膜的薄膜形式定植的能力。在多孔介质中生长的生物膜与多种工业和环境过程相关，例如废水处理和CO2封存。我们采用革兰氏阴性需氧细菌Pseudomonas fluorescens，在模拟多孔介质的微流控装置中研究生物膜的形成。该微流控装置包含一系列微柱阵列，通过软光刻技术制备而成。随后，在有流动条件下研究了这些装置中的生物膜形成过程，我们在此装置中观察到了丝状生物膜（即流线状生物膜）的形成。本文提供了微流控装置的制备与组装的详细方案，以及细菌培养的实验流程。同时给出了使用该微流控装置进行实验的详细操作步骤及代表性结果。

采用上述微加工工艺，构建了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置。图1展示了该PDMS装置的扫描电子显微镜（SEM）图像。图1a显示了装置的入口区域，设计为叉状入口，以均衡装置内的压力头。进一步的SEM成像还表明，微柱的侧壁几乎呈垂直状态（图1b）。将培养的细菌溶液（图2）稀释后，调节其光密度至0.1。我们研究了输入流速对微流控装置中生物膜形成的影响。当以0.8 μl/hr的低流速将P. fluorescens注入装置时，细菌在装置壁面发生附着并形成生物膜。即使经过较长时间（>20小时），也仅观察到贴壁生长的生物膜，未见其他类型的细菌结构。随后，在8 μl/hr的流速下重复相同实验。在此情况下，稀释后的细菌培养液注入数分钟后即开始形成生物膜。然而数小时后，在装置中部区域观察到有丝状结构在微柱之间延伸（图4）。这些丝状结构可通过其中不动的细菌得以识别。此类结构被称为“流缕”（streamers），即仅在一端或两端附着于表面的丝状生物膜，其余部分通...

本文讨论了在模拟多孔介质的微流控装置中研究生物膜形成的实验方案。该微流控装置包含一组微柱阵列，并在此装置中研究了荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的生物膜形成过程。

多种细菌具有附着于表面并以称为生物膜的薄膜形式定植的能力。生长在……的生物膜

本实验的总体目标是演示在带有微柱结构的微流控装置中形成细菌流线（bacterial streamers）的过程。首先通过制备微流控芯片来实现该目标。实验的第二步是培养待测细菌，此处为荧光假单胞菌（pseudomonas fluorescence）。最后的步骤是组装实验装置，将细菌注入微流控芯片，并收集数据。最终，结果可以通过荧光显微镜图像展示流光随时间的演化过程。对该方法的可视化演示至关重要，因为各个步骤较难掌握。由于该实验具有跨学科性质，本实验步骤需要采用深反应离子刻蚀的硅晶圆。晶圆上的光刻胶应被清洗干净。首先对母模进行疏水处理。向小瓶中加入两到三滴三氯乙烯，并将其与模具一同放入干燥器中，模具需倒置放置在旁边。两到三小时后，模具将完成硅烷化处理。在硅烷化过程中，准备PDMS混合物，将184型硅胶基础剂与固化剂按10:1的比例混合。然后在真空条件下对PDMS脱气约两个小时。将硅化晶圆转移至支架上，将PDMS倾倒于其表面，确保不产生气泡。在80摄氏度下使PDMS在晶圆上固化两小时。利用尺寸合适的硅模具制备A-P-D-M-S印章。固化完成后，在切割刀的辅助下剥离PDMS印章，然后使用切割刀将印章切割成微流控芯片。现在，使用打孔器在印章的入口和出口位置钻孔。下一步是将印章与玻璃键合。将24毫米的盖玻片和PDMS印章暴露于氧气等离子体中处理30秒。暴露后，将盖玻片贴附到PDMS印章的底面，即可形成键合。将组装好的样品置于70摄氏度的烘箱中加热10分钟。为完成本方案的流程，请使用超纯水制备LB平板，并在50至55摄氏度时加入终浓度为50微克/毫升的四环素。倒平板时，可用火焰灼烧去除气泡。冷却凝固后的平板应标注日期，并用锡箔纸包裹后于4°C保存。同时，准备好用超纯水配制并添加50 µg/mL四环素的LB液体培养基。将肉汤在 4°C 条件下保存，并用锡箔纸包裹。现在将保存在 -80°C 的荧光假单胞菌菌种在 LB 平板上划线，以锯齿形模式划线后，于 30°C 黑暗条件下过夜培养。次日，从平板上挑取一个菌落，接种至装有新鲜配制 S1 培养基的锥形瓶中，在 30°C、150 RPM 振荡条件下过夜培养。孵育结束后测定培养物的光密度。然后制备 S2 溶液。向一个塑料离心管中加入 5 毫升 LB 培养基，再加入适量的 S1 溶液，使 600 纳米处的光密度（OD）达到 0.1，这在生物膜实验中是典型值。首先，使用镊子设置实验。将内径为 0.20 英寸的塑料管连接到已准备好的芯片的入口和出口。这些管子必须具有柔韧性且足够长，此处约为 20 英寸。然后用 S2 溶液填充注射器。安装 30 号钝头针头并去除气泡。防止气泡进入通道是关键步骤，尤其是在实验持续时间较长的情况下。气泡可能会损坏细菌形成的柔软结构。然后将注射器连接到进样管路，并将出样管路连接至废液容器。接着将注射器安装到注射泵上，并将泵设置为所需的流速，例如每小时8 µL，同时将显微镜配备的细胞培养腔室调节至孵育温度。使用40倍物镜观察微流控芯片。现在启动泵。当细菌被引入腔室时，生物膜的形成也随之开始。生物膜将经历数小时至数天的形成与成熟过程，需拍摄图像以追踪其进展。使用SEMA制备的微流控芯片进行成像，该芯片设计有叉状入口，以均衡装置内的压力差。还可以观察到，柱状结构的侧壁几乎呈垂直状。为了观察生物膜的形成，以每小时八微升（8 µL/h）的速度将荧光物质注入装置中。在稀释的细菌培养液注入数分钟后，生物膜的形成即开始。然而，数小时后，在微柱之间中段附近观察到丝状结构的出现。虚线椭圆标示出正在形成的流束，这些流束一端锚定在其中一个微柱的极区。在两个微柱之间的对角线上也观察到了流束。由于细胞分裂以及浮游细菌的加入，菌丝的厚度随时间增加。同时，菌丝随时间增殖，占据装置内的较大体积，导致成熟生物膜的形成，进而可能堵塞装置。对流体通过该装置的力学模拟显示，菌丝最初沿流线方向排列。此外，在初始阶段，生物膜丝状结构会在流速最高的位置开始形成。观看本视频后，您应能充分理解生物膜丝状结构在微流控环境中如何形成并发展演化。请务必注意，操作细菌可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取生物安全防护等预防措施。

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生物工程

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