Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

El objetivo general de este procedimiento es inducir una diferenciación de neuronas dopaminérgicas altamente eficiente. In vitro. Esto se logra preparando primero un cultivo de adhesión de una sola célula de células madre pluripotentes P humanas.

En el segundo paso, el medio de cultivo celular se cambia a un medio de inducción de neuronas para inducir progenitores de la placa de suelo. A continuación, las neuronas dopaminérgicas se cultivan en medios de maduración. Y, finalmente, los progenitores de neuronas dopaminérgicas unicelulares se cultivan en placas de fibronectina laminadas de poli L ornitina y medios de maduración durante 30 días.

En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se puede utilizar para evaluar la expresión de importantes marcadores de neuronas dopaminérgicas. Esta técnica tiene una mayor ventaja sobre la neuroesfera existente en el protocolo de neuroácidos. Puede generar una población neuronal doble más homogénea con mayor eficiencia.

Cuatro días después del paso, aspire el medio de los cultivos celulares. Separe las células con un mililitro de Accutane por pocillo e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Durante la incubación, agregue un mililitro de gelatina a cada pocillo de una placa de seis pocillos y luego coloque la placa junto con las placas recubiertas de gel matri recién preparadas en la incubadora.

Cuando las células se hayan vuelto semiflotantes, pipetelas hacia arriba y hacia abajo varias veces para hacer una suspensión de una sola célula. A continuación, introduce las células en un tubo de 15 mililitros y centrífugalas durante tres minutos. A 258 Gs y temperatura ambiente, vuelva a suspender el pellet en la cantidad adecuada de medio de cultivo de células madre pluripotentes humanas suplementado con suero y agregue esta vivina hasta una concentración final de dos milimolares.

A continuación, incube las células en las placas recubiertas de gelatina en una proporción de uno a uno a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Para retirar los alimentadores de metanfetamina, transfiera las células a un nuevo tubo de 15 mililitros. Diluirlos en medio de células madre pluripotentes humanas, suplementado con suero, y contarlos después de girar las células nuevamente, vuelva a suspender las células en MT.SR un medio con thias Ivan a una concentración de 180, 000 células por mililitro.

A continuación, aspire el matrigel de las placas recubiertas y dispense dos mililitros de células por pocillo. 48 horas. Después de reenchapar las células en las placas de matrigel.

Aspire el medio de cada pocillo y lave las celdas una vez con PBS. A continuación, añada dos mililitros de diferenciación KSR, medio suplementado con SB 4 31, 50 42 y L DN 1 9 3 1 8 9 a las células cambiando el medio cada día de D cero a D 20 como se indica en la tabla el día 20, aspire el medio de diferenciación y separe las células con un mililitro de 37 grados Celsius por pocillo a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Durante la incubación, caliente las placas de poli L orina laminina de fibronectina en la incubadora.

Luego, después de Resus, suspendiendo las células separadas en una suspensión de una sola célula, diluya las células en medios neurobasales. Después de contar, gire las células hacia abajo y vuelva a suspender el pellet en B 27, medio de diferenciación a una concentración de 1 millón de células por mililitro. A continuación, aspire la fibronectina de las placas de fibronectina de poliol orina laminina.

Lávelos dos veces con PBS y transfiera 400 microlitros de células a cada uno. Bueno, finalmente cambie el medio después de las primeras 24 horas, y luego cada dos días hasta el punto final experimental para eliminar las células muertas no adheridas. Como se ilustra en estas imágenes, los cultivos de células madre pluripotentes humanas de células individuales replateadas se expandirán como grupos durante las primeras 48 horas de diferenciación, alcanzando aproximadamente el 70% de confluencia.

Después de la diferenciación, las células logran la confluencia completa en tan solo tres o cuatro días. Para el día 20, las células diferenciadas se adhieren y crecen como pequeños grupos. Durante los siguientes cinco días, aparecen axones y neuritas mucho más intensos y morfológicamente intactos dentro de los grupos, formando algunas conexiones entre los grupos.

Después de 11 días de diferenciación, las células madre pluripotentes humanas se pueden convertir de manera eficiente en precursores de la placa de suelo. Como se demuestra en estas imágenes, casi todas las células expresan el precursor de la placa del suelo, los marcadores celulares anidan en y el zorro A dos y más. El 90% de las células expresan Corin O OTX dos y LM X uno A. Después de una mayor diferenciación, las células precursoras de la placa de suelo se especializan en neuronas dopaminérgicas que expresan TUJ uno y TH. Estas neuronas dopaminérgicas son de una identidad nueve, ya que expresan GK dos y son negativas para calbindina. Los experimentos de inmunotinción también demuestran que no hay astrocitos GFAP y muy pocas neuronas GABAérgicas, lo que indica que la diferenciación es exclusivamente específica para el linaje de las neuronas dopaminérgicas.

Al probar este procedimiento, es importante mantener la consistencia en el cultivo celular diario y asegurarse de que el medio esté recién preparado con los ingredientes correctos.