Name: Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprende a diferenciar neuronas dopaminérgicas A9 de células madre pluripotentes humanas mediante cultivo en medio de inducción neuronal. Este protocolo optimizado permite modelar la enfermedad de Parkinson y explorar terapias de reemplazo celular.

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Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Renee Reijo Pera por su ayuda durante el desarrollo de este protocolo y durante la preparación de este manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo del laboratorio compartido del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (CL-00518).

1 Preparación de Medios de Cultivo <ol><li> Preparar fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) medio combinando lo siguiente: 445 ml de DMEM, 50 ml de suero bovino fetal (FBS), y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución madre. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 14 días. </li><li> Preparar medio de cultivo HPSC combinando lo siguiente que contiene suero: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de suero de reemplazo knockout (KSR), 5 ml 100x solución no esencial solución de aminoácidos de stock, 5 ml 100x penicilina / ampicilina de stock, 5 ml 100x mercaptoetanol solución madre, y 10 ng / ml de bFGF. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días. </li><li> Preparar medio libre de suero mTeSR1 combinando lo siguiente: 400 ml mTeSR1 medio basal, 100 ml 5x suplemento, y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga medio a 4 ° C durante no más de 10 días. </li><li> Preparar 10x colagenasa solución IV existencia: pésense 0,5 g potencia colagenasa IV, ydisolver con 50 ml de DMEM / F12 y esterilizar filtro. Hacer alícuotas y almacenarlos a -20 ° C durante meses. </li><li> Prepare la solución de gelatina al 0,1%: Pesar 0,5 g de gelatina (de piel bovina, tipo B) de potencia y se disuelven con agua desionizada. Mantenga autoclave solución esterilizada a temperatura ambiente durante semanas. </li><li> Preparar medio de diferenciación KSR combinando lo siguiente: 410 ml de DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x solución no esenciales de aminoácidos de stock, 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución madre, 5 ml 100x solución madre mercaptoetanol. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días. NOTA: KSR varía de un lote a otro, lo que puede afectar a la eficiencia de la diferenciación. Por tanto, es mejor probar varios lotes de KSR para encontrar el mejor para la diferenciación. </li><li> Preparar medio de diferenciación N2 mediante la combinación de lo siguiente: 98 ml de DMEM, 1 ml suplemento N2 100x y 100x 1 ml de penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga el filtro de medio esterilizado en 4° C durante no más de 10 días. </li><li> Preparar medio de diferenciación B27 mediante la combinación de lo siguiente: medio neurobasal 480 ml, 10 ml 50x suplemento B27, 5 ml 100x solución madre glutamax, y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días. </li></ol> 2. Cultura de hESCs y hiPSCs sobre células alimentadoras MEF Los H9 hESCs se obtuvieron de Research Institute WiCell hiPSCs y se establecieron en el laboratorio Reijo Pera través de la transducción mediada por retrovirus de Yamanaka factores de OCT3 / 4, Sox2, Klf4 y c-MYC 18. <ol><li> Al menos un día antes de la aprobación de células, preparar algunos platos de gelatina mediante la adición de 1 ml de 0,1% de gelatina al 1 pocillo de placas de 6 pocillos, y las placas se incuban a 37 ° C durante al menos 30 min. </li><li> Después de la incubación, aspirado de gelatina a partir de las placas, y las semillas de la irradiación inactivada MEF células en las placas a una densidad de 1,6 x 10 5 células/ Pocillo en medio MEF usando un hemocitómetro para contar las células. NOTA: Opcionalmente preparar alimentadores MEF tan pronto como 3 días antes de la aprobación de la célula. </li><li> Células Passage un día después de enchapado alimentadores MEF: medianas aspirado desde hPSCs, añadir 1 mg / ml de colagenasa IV a las células en 1 ml / pocillo, y se incuban las células a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Durante esta incubación, lavar alimentadores MEF una vez con PBS, y luego agregar agua tibia (37 ° C) medio de cultivo que contiene suero HPSC a 1,5 ml / pocillo. </li><li> Después de 1 hora, toque en la placa de cultivo de un par de veces, así que la mayoría de las colonias indiferenciadas se desprenda de las placas, mientras que las colonias diferenciadas permanecen unidos. Recoger cuidadosamente las colonias flotantes, y transferirlos al tubo de 15 ml. </li><li> Lave suavemente la placa una vez con agua caliente (37 ° C) DMEM / F12 y transferir DMEM / F12 en el mismo tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar los tubos a 179 xg durante 3 min. </li><li> Aspirar medio de los tubos, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Añadir guerramedio de cultivo m HPSC, pipetear las células arriba y abajo varias veces para romper en pequeños grupos y mezclar bien. </li><li> Transferir las células sobre nuevos alimentadores MEF en 1: 3-1: 6 relación. </li><li> Cambie el medio todos los días y el paso de las células cada 5-6 días. </li></ol> 3. Preparación de las células para la diferenciación <ol><li> Al menos un día antes de la preparación de las células, preparar algunos platos de Matrigel (típicamente 3 pocillos de una placa de 6 pocillos). Diluir el Matrigel con frío (4 ° C) DMEM / F12 a las 1:40 y se añade 1 ml de Matrigel por pocillo de placas de 6 pocillos. Incubar las placas Matrigel a 4 ° C durante la noche. NOTA: Se puede sellar placas Matrigel con Parafilm y almacenarlos a 4 ° C durante todo el tiempo de una semana. </li><li> Usar células (ver paso 2) 4 días después del pasaje. Retire todas las colonias diferenciadas de las placas. Aspirar medio de la placa de cultivo, añadir 1 ml accutase por pocillo, y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Durante la incubación, preparar algunos gelmérica placas mediante la adición de 1 ml de gelatina al 1 pocillo de placas de 6 pocillos. Coloque estos platos y los Matrigel placas preparadas un día antes en la incubadora. </li><li> Después de la incubación de 5 min o cuando las células se han convertido en semi-flotante, las células de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para hacerlos en células individuales. </li><li> Recoger las células individuales en tubos de 15 ml y centrifugar a 258 xg durante 3 min. </li><li> Resuspender las células con cantidad apropiada de suero que contiene medio de cultivo HPSC, y añadir Thiazovivin a la concentración final de 2 mM. </li><li> Células de transferencia sobre placas recubiertas con gelatina en 1: 1, e incubar las células a 37 ° C durante 30 min para eliminar los alimentadores del MEF. </li><li> Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml, añadir el suero que contiene medio apropiado HPSC y contar las células con un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar las células a 258 xg durante 3 min. </li><li> Durante centrífuga, añadir Thiazovivin apropiarse medio mTeSR1 para hacer una concentración de 2 mM. </li><li> Después de centrifugación, unaespirar el medio y añadir medio mTeSR1 apropiado con Thiazovivin modo que hay 1,8 x 10 5 células / ml de medio. </li><li> Saque las placas Matrigel de la incubadora, aspirar el Matrigel y añadir 2 ml de las células mixtas en 1 pocillo de las placas de 6 pocillos. NOTA: La densidad celular debe ser de 3,6 x 10 4 células / cm 2 de superficie. </li><li> Vuelva a poner las placas de nuevo a la incubadora, y dejar que las células se adhieren durante 24 horas. </li><li> 24 horas después de la siembra de las células, aspirar medio de edad y añadir 2 ml nuevo medio mTeSR1 por pozo y dejar que las células crezcan durante otras 24 horas antes de iniciar la diferenciación. </li></ol> Diferenciación Celular <ol><li> Iniciar diferenciación 48 horas después de resiembra las células en placas Matrigel. </li><li> Aspirar el medio de cultivo de la placa, lavar las células una vez con PBS, y añadir 2 ml del siguiente medio de diferenciación por pozo: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 mM SB431542 y 100 nM LDN-193189. Marcar este día como D0 de diferenciación. </li><li> Cambie medio todos los días de D0 a D20. NOTA: Se puede preparar el medio para el uso no más de 2 días a la vez. </li><li> Utilice el siguiente medio para D1 y D2: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, 2 M purmorphamine, y 50 ng / ml FGF8b. </li><li> Utilice el siguiente medio para D3 y D4: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, 2 M purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, y 3 M CHIR99021. </li><li> Utilice el siguiente medio de D5 y D6: 75% medio de diferenciación KSR más el 25% medio de diferenciación N2 suplementado con 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, purmorphamine 2 M, 50 ng / ml FGF8b, y 3 M CHIR99021. </li><li> Utilice el siguiente medio de D7 y D8: 50% medio de diferenciación KSR más el 50% medio de diferenciación N2 complementado con 100 nM LDN-193189 y 3 M CHIR99021.</li><li> Utilice el siguiente medio de D9 y D10: 25% medio de diferenciación KSR más el 75% medio de diferenciación N2 complementado con 100 nM LDN-193189 y 3 M CHIR99021. </li><li> Utilice el siguiente medio para D11 y D12: B27 diferenciación medio suplementado con 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml de GDNF, 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM y 0,1 mM cAMP. </li><li> Utilice el siguiente medio para el resto de la diferenciación: medio de diferenciación B27 suplementado con 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml de GDNF, 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM y 0,1 mM cAMP. </li><li> A eso de D16 de la diferenciación, preparar algunos platos / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Diluir poli-L-ornitina solución madre con el frío (4 ° C) PBS a 15 mg / ml, añadir 1 ml a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche. </li><li> Aspirar la solución de poli-L-ornitina, lavar las placas 3 veces con agua estéril y luego secar al aire las placas. </li><li> Diluir la laminina de stock sollución de frío (4 ° C) PBS a 1 mg / ml, añadir 1 ml a un pocillo de placas de 6 pocillos, e incubar las placas a 37 ° C durante la noche. </li><li> Aspirar la solución de laminina, lavar las placas 3 veces con agua estéril y luego secar al aire las placas. </li><li> Diluir la solución de fibronectina de stock de frío (4 ° C) PBS a 2 mg / ml, añadir 1 ml a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche. </li><li> Placas sello con Parafilm y colocarlos a 4 ° C durante hasta dos semanas. </li><li> Después de 20 días de diferenciación, replate las células a las placas / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Medio de diferenciación Aspirar, añadir 1 ml caliente (37 ° C) Accutase a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Durante la incubación, colocar las placas / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina en la incubadora. </li><li> Después de la incubación de 5 min o cuando las células se han convertido en semi-flotantes, suavemente las células de pipeta hacia arriba y abajo varias veces aconvertirlas en células individuales. </li><li> Recoger las células individuales en tubos de 15 ml cónicos, y añadir la cantidad apropiada de medio neurobasal para el recuento celular, que variará dependiendo de expansión (después de 11 días de diferenciación, las células pueden expandirse 15-20 veces). Contar las células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar las células a 258 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células con medio de diferenciación B27 de manera que la concentración de células es de 1 x 10 6 células / ml de medio. </li><li> Aspirar fibronectina de las placas, lavar dos veces con PBS, y añadir 2 ml de células a 1 pocillo de placas de 6 pocillos. NOTA: La densidad celular para replating debe ser de 2 x 10 5 células / cm 2 de superficie. </li><li> Cambie medio 24 horas más tarde para eliminar las células muertas sin ataduras. </li><li> Cambio de medio cada dos días hasta los puntos de tiempo deseados para un experimento dado. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Células madre pluripotentes humanos (incluyendo tanto hESCs y hiPSCs) pueden diferenciarse in vitro para generar la mayoría, si no todos, los tipos de células de nuestro cuerpo incluyendo las neuronas DA, que se ha demostrado en estudios previos 19. Aquí, basado en el conocimiento del desarrollo de neuronas dopaminérgicas embrionarias 20 y protocolos publicados de otros laboratorios 14,15, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la generación de neuronas DA de hESCs y h...

Dopaminérgico (DA), las neuronas se pueden encontrar en varias regiones del cerebro, incluyendo el cerebro medio, el hipotálamo, la retina y bulbos olfativos. Las neuronas A9 de DA en la substantia nigra pars compacta (SNpc) controlar el comportamiento y el movimiento mediante la proyección en el cuerpo estriado en el cerebro anterior y formando el sistema motor extrapiramidal. La degeneración de las neuronas DA A9 conduce a la enfermedad de Parkinson (PD), que es el segundo trastorno neurodegenerativo más común humano y actualmente incurable. Terapia de reemplazo celular es una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de la EP 1, por lo tanto, ha habido un gran interés en la obtención de las neuronas DA A9 a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y el células recientes de origen humano madre pluripotentes (hiPSCs). Muchas investigaciones han tratado de derivar neuronas DA A9 de hPSCs utilizando diversos métodos. Los primeros informes de todas las neuronas DA generados a través de una neuraletapa progenitor roseta. Por co-cultivo con MS5 2 o PA6 3-5 células estromales con o sin factores de crecimiento externo para 2-4 semanas, L. Studer y colegas y otros tres grupos inducidos con éxito hESCs para producir rosetas neuronales. A continuación, enriquecidos estas rosetas por la disección mecánica o digestión enzimática para su posterior diferenciación. En otros informes, los investigadores generaron rosetas neuronales a través del cuerpo embrioide (EB) la diferenciación de la cultura 6.9 flotantes. Más tarde, los investigadores establecieron un método de diferenciación monocapa basada 10,11, donde se sembraron hESCs y hiPSCs en matriz extracelular, añadieron diferentes factores de crecimiento en el cultivo para inducir la diferenciación de hPSCs a las neuronas DA, que imita el desarrollo in vivo de las neuronas DA en embrionario . Aunque todos estos estudios obtuvieron tirosina hidroxilasa (TH) células que expresaban con algunas características de las neuronas DA, todo el proceso de diferenciación es que consume tiempo y trabajo,generalmente ineficientes, y más importante, la identidad A9 de estas neuronas no se demostró en la mayoría de los estudios, excepto el uno con LMX1A expresión ectópica 12. Recientemente, una nueva placa de piso (FP) basada en protocolo se desarrolló 13-16, en el que los precursores de PF con potencial de neuronas DA se generaron por primera vez por la activación de la erizo sónico y las vías canónicas de señalización Wnt durante la etapa temprana de la diferenciación, y luego estas células de PF se especificaron aún más a las neuronas DA. Aunque este protocolo es más eficiente, todavía hay algunos problemas; por ejemplo, todo el proceso de diferenciación toma mucho tiempo (al menos 35 días) y es alimentador celular dependiente 15, o es dependiente de EB 16 o la identidad A9 no se demostró 14. Aquí, a partir del conocimiento de in vivo el desarrollo de las neuronas DA embrionario y resultados publicados de otros investigadores, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la efciente generación de neuronas DA de ambos hESCs y hiPSCs. Se generó por primera vez las células precursoras FP por la activación de la señalización de Wnt canónica con la pequeña molécula de CHIR99021 y sonic hedgehog de señalización con moléculas pequeñas SAG y purmorphamine. Estas células expresan FP FOXA2, LMX1A, CORIN, OTX2 y Nestin. A continuación, especificamos estas células FP a las neuronas DA con factores de crecimiento incluyendo BDNF, GDNF, etc. Las neuronas DA generados son del tipo de células A9 ya que son positivos para GIRK2 mientras negativo para Calbindin 17. Este protocolo es de células de alimentación o EB independiente, altamente eficiente y reproducible. El uso de este protocolo, se puede derivar neuronas DA en menos de 4 semanas a partir de hESCs o hiPSCs de las personas normales para el estudio de trasplante de células, o de hiPSCs de los pacientes con EP para el modelado in vitro de la EP o probar agentes terapéuticos potenciales para la EP.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/ampicilina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido no esencial</td><td>Life Tecnologías</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento reducido matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R& D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Sistemas</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R& D Sistemas</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R& D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti NESTIN humano para ratones</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td>dilución 1/1.000</td></tr><tr><td>Conejo anti humano Anticuerpo OTX2</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2.000 dilución</td></tr><tr><td>Cabra anti humano Anticuerpo FOXA2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2400</td><td>dilución 1/200</td></tr><tr><td>conejo anti humano anti anticuerpo LMX1a</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>dilución 1/1.000</td></tr><tr><td>conejo anti humano anti anti humano anti</td> conejo <td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>dilución 1/500</td></tr><tr><td>pollo anti humano anti anti humano anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>dilución 1/500</td></tr><tr><td>ratón anti humano anti ratón anti anti humano</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/,2000 dilución</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti humano GIRK2 para conejos</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>dilución 1/300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti humano contra Calbindin para conejos</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>Dilución 1/400</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

dirigida dopaminérgica neurona la diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia negra pars compacta (también conocidas como neuronas A9 DA) son el tipo de célula específica que se pierde en la enfermedad de Parkinson (EP). Existe un gran interés en derivar neuronas A9 DA a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) para la terapia de reemplazo de células regenerativas para la EP. Durante el desarrollo neuronal, las neuronas A9 DA se originan a partir de los precursores de la placa de suelo (FP) ubicados en la línea media ventral del sistema nervioso central. Aquí, optimizamos las condiciones de cultivo para la diferenciación escalonada de hPSCs a neuronas DA A9, que imita el desarrollo de neuronas DA embrionarias. En nuestro protocolo, primero describimos la generación eficiente de células precursoras de FP a partir de hPSCs utilizando un método de molécula pequeña, y luego convertimos las células FP en neuronas A9 DA, que podrían mantenerse in vitro durante varios meses. Este protocolo eficiente, repetible y controlable funciona bien en células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) de personas normales y pacientes con EP, en las que se podrían derivar neuronas A9 DA para realizar el modelado de enfermedades in vitro y el cribado de fármacos y la terapia de trasplante de células in vivo para la EP.

Una visión general del protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1. La eficiencia del protocolo de diferenciación que aquí se presenta se basa en el estado de las células de partida. Por lo tanto, es crítico para asegurarse de que, primero uno elimina todas las colonias diferenciadas antes de disociarse hPSCs en células individuales para la diferenciación, y segundo, uno agota la mayoría, si no todas, las células alimentadoras MEF mediante la incubación de las células en placas recubiertas con...

Nosotros, basándonos en el conocimiento de la biología del desarrollo y la investigación publicada, desarrollamos un protocolo optimizado para generar de manera eficiente neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo A9 a partir de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas humanas, que serían útiles para el modelado de enfermedades y la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson.

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir una diferenciación altamente eficiente de neuronas dopaminérgicas in vitro. Esto se logra primero preparando un cultivo de adhesión de células individuales a partir de células madre pluripotentes humanas.En el segundo paso, el medio de cultivo celular se cambia a medio de inducción neuronal para inducir precursores de la placa del suelo. A continuación, las neuronas dopaminérgicas se cultivan en medio de maduración. Y finalmente, los precursores de neuronas dopaminérgicas individuales se cultivan en placas de laminina fibronectina con poli-L-ornitina, y en medio de maduración durante 30 días.En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia puede utilizarse para evaluar la expresión de marcadores importantes de neuronas dopaminérgicas. Esta técnica tiene una ventaja mayor frente al protocolo existente de esferas neurales con ácido neurológico. Puede generar una población neural doble más homogénea con mayor eficiencia.Cuatro días después del pase, aspire el medio de los cultivos celulares. Desprenda las células con un mililitro de Accutase por pocillo e incúbelas a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Durante la incubación, agregue un mililitro de gelatina a cada pocillo de una placa de seis pocillos y luego coloque la placa junto con placas recién preparadas recubiertas con Matrigel en el incubador.Cuando las células se hayan vuelto semisuspendidas, pipetéelas hacia arriba y hacia abajo varias veces para obtener una suspensión de células individuales. Luego, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrifúgelas durante tres minutos a 258 G y temperatura ambiente. Resuspenda el sedimento en la cantidad adecuada de medio de cultivo para células madre pluripotentes humanas suplementado con suero y agregue thi vivin hasta una concentración final de 2 milimolares.A continuación, incubar las células en placas recubiertas con gelatina en una proporción uno a uno a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para eliminar los alimentadores de metotrexato, transferir luego las células a un nuevo tubo de 15 mililitros. Diluir las células en medio de células madre pluripotentes humanas, suplementado con suero, y contarlas tras centrifugar nuevamente las células; resuspender las células en medio MT.SR uno con thias Iván hasta una concentración de 180.000 células por mililitro.Luego aspire el matrigel de las placas recubiertas y distribuya dos mililitros de células por pocillo. 48 horas. Después de resembrar las células en las placas de matrigel.Aspire el medio de cada pocillo y lave las células una vez con PBS. A continuación, agregue dos mililitros de medio de diferenciación KSR, suplementado con SB 4 31, 50 42 y L DN 1 9 3 1 8 9 a las células, cambiando el medio cada día desde el día cero hasta el día 20. Según se indica en la tabla, al día 20 aspire el medio de diferenciación y desprenda las células con un mililitro de acutus a 37 grados Celsius por pocillo, incubando a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Durante la incubación, caliente las placas de poli-L-ornitina, laminina y fibronectina en el incubador.Luego, tras la resuspensión, suspenda las células desprendidas en una suspensión de células individuales y diluya las células en medio neurobasal. Después de contarlas, centrifugue las células y resuspenda el precipitado en medio de diferenciación B 27 a una concentración de un millón de células por mililitro. A continuación, aspire la fibronectina de las placas de poliol orina laminina fibronectina.Lávese dos veces con PBS y transfiera 400 microlitros de células a cada uno. Finalmente, cambie el medio después de las primeras 24 horas y luego cada dos días hasta el punto final del experimento para eliminar cualquier célula muerta no adherida. Como se ilustra en estas imágenes, los cultivos de células madre pluripotentes humanas de célula única replatadas se expandirán en cúmulos durante las primeras 48 horas de diferenciación, alcanzando aproximadamente una confluencia del 70 %.Después de la diferenciación, las células alcanzan la confluencia completa en tan solo tres o cuatro días. Al día 20, las células diferenciadas se adhieren y crecen como pequeños agregados. Durante los siguientes cinco días, aparecen axones y neuritas mucho más intensos y morfológicamente intactos dentro de los agregados, formando algunas conexiones entre ellos.Después de 11 días de diferenciación, las células madre pluripotentes humanas pueden convertirse eficientemente en precursores de la placa basal. Como se muestra en estas imágenes, casi todas las células expresan los marcadores celulares de precursores de la placa basal, como NESTIN y FOXA2, y más del 90 % de las células expresan CORIN, OTX2 y LMX1A. Tras una diferenciación adicional, las células precursoras de la placa basal se especializan en neuronas dopaminérgicas que expresan TUJ1 y TH. Estas neuronas dopaminérgicas presentan una identidad de tipo 9, ya que expresan EN1 y son negativas para calbindina. Experimentos de inmunotinción también demuestran que no hay astrocitos GFAP positivos y muy pocas neuronas GABAérgicas, lo que indica que la diferenciación es exclusivamente específica para la línea de neuronas dopaminérgicas.Al probar este procedimiento, es importante mantener la consistencia en el cultivo celular diario y asegurarse de que el medio se prepare fresco con los ingredientes correctos.

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Este video muestra la generación de células progenitoras neurales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) transgénicas y no transgénicas. Las hPSCs se diferencian en células progenitoras neurales utilizando un medio de diferenciación neuronal. Mientras que en las células no transgénicas se induce la diferenciación utilizando moléculas pequeñas, las hPSC transgénicas se diferencian mediante la adición de un antibiótico que induce el promotor de un factor de transcripción...

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas transgénicas y no transgénicas en células progenitoras neurales

Este video demuestra el proceso de inducir células madre pluripotentes humanas para diferenciarse en neuronas transfectándolas con lentivirus modificados genéticamente que llevan un gen de factor de transcripción neurogénico bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina, seguido de un tratamiento con un derivado de tetraciclina y un medio de maduración.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en neuronas utilizando lentivirus modificados

Este video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) en neuronas dopaminérgicas, para proporcionar un modelo para el estudio de la enfermedad de Parkinson. Las hESCs se cultivan en un medio de inducción neural en una placa de micropocillos para formar neuroesferas 3D. A continuación, se cultivan en un medio de inducción neuronal para promover la diferenciación en neuronas progenitoras dopaminérgicas. La maduración final de las neuronas se produce en un inserto de...

Generación de organoides neuronales dopaminérgicos a partir de células madre embrionarias humanas

Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Modificamos e implementar un protocolo previamente publicado que describe la diferenciación rápida, reproducible y eficiente de los inducidos por el hombre células madre pluripotentes (hiPSCs) en neuronas corticales excitatorios 12. Específicamente, nuestra modificación permite el control de la densidad celular neuronal y su uso en matrices de micro-electrodos para medir las propiedades electrofisiológicas en el nivel de red.

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Mostramos la automatización de cultivos de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y diferenciaciones neuronales compatibles con imágenes y análisis automatizados.

Producción automatizada de neuronas corticales y dopaminérgicas derivadas de células madre no inducidas por humanos con monitoreo integrado de células vivas

Aprende a diferenciar neuronas dopaminérgicas A9 de células madre pluripotentes humanas mediante cultivo en medio de inducción neuronal. Este protocolo optimizado permite modelar la enfermedad de Parkinson y explorar terapias de reemplazo celular.

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

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