Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

El objetivo general de este procedimiento es inducir una diferenciación altamente eficiente de neuronas dopaminérgicas in vitro. Esto se logra primero preparando un cultivo de adhesión de células individuales a partir de células madre pluripotentes humanas.

En el segundo paso, el medio de cultivo celular se cambia a medio de inducción neuronal para inducir precursores de la placa del suelo. A continuación, las neuronas dopaminérgicas se cultivan en medio de maduración. Y finalmente, los precursores de neuronas dopaminérgicas individuales se cultivan en placas de laminina fibronectina con poli-L-ornitina, y en medio de maduración durante 30 días.

En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia puede utilizarse para evaluar la expresión de marcadores importantes de neuronas dopaminérgicas. Esta técnica tiene una ventaja mayor frente al protocolo existente de esferas neurales con ácido neurológico. Puede generar una población neural doble más homogénea con mayor eficiencia.

Cuatro días después del pase, aspire el medio de los cultivos celulares. Desprenda las células con un mililitro de Accutase por pocillo e incúbelas a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Durante la incubación, agregue un mililitro de gelatina a cada pocillo de una placa de seis pocillos y luego coloque la placa junto con placas recién preparadas recubiertas con Matrigel en el incubador.

Cuando las células se hayan vuelto semisuspendidas, pipetéelas hacia arriba y hacia abajo varias veces para obtener una suspensión de células individuales. Luego, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrifúgelas durante tres minutos a 258 G y temperatura ambiente. Resuspenda el sedimento en la cantidad adecuada de medio de cultivo para células madre pluripotentes humanas suplementado con suero y agregue thi vivin hasta una concentración final de 2 milimolares.

A continuación, incubar las células en placas recubiertas con gelatina en una proporción uno a uno a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para eliminar los alimentadores de metotrexato, transferir luego las células a un nuevo tubo de 15 mililitros. Diluir las células en medio de células madre pluripotentes humanas, suplementado con suero, y contarlas tras centrifugar nuevamente las células; resuspender las células en medio MT.SR uno con thias Iván hasta una concentración de 180.000 células por mililitro.

Luego aspire el matrigel de las placas recubiertas y distribuya dos mililitros de células por pocillo. 48 horas. Después de resembrar las células en las placas de matrigel.

Aspire el medio de cada pocillo y lave las células una vez con PBS. A continuación, agregue dos mililitros de medio de diferenciación KSR, suplementado con SB 4 31, 50 42 y L DN 1 9 3 1 8 9 a las células, cambiando el medio cada día desde el día cero hasta el día 20. Según se indica en la tabla, al día 20 aspire el medio de diferenciación y desprenda las células con un mililitro de acutus a 37 grados Celsius por pocillo, incubando a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Durante la incubación, caliente las placas de poli-L-ornitina, laminina y fibronectina en el incubador.

Luego, tras la resuspensión, suspenda las células desprendidas en una suspensión de células individuales y diluya las células en medio neurobasal. Después de contarlas, centrifugue las células y resuspenda el precipitado en medio de diferenciación B 27 a una concentración de un millón de células por mililitro. A continuación, aspire la fibronectina de las placas de poliol orina laminina fibronectina.

Lávese dos veces con PBS y transfiera 400 microlitros de células a cada uno. Finalmente, cambie el medio después de las primeras 24 horas y luego cada dos días hasta el punto final del experimento para eliminar cualquier célula muerta no adherida. Como se ilustra en estas imágenes, los cultivos de células madre pluripotentes humanas de célula única replatadas se expandirán en cúmulos durante las primeras 48 horas de diferenciación, alcanzando aproximadamente una confluencia del 70 %.

Después de la diferenciación, las células alcanzan la confluencia completa en tan solo tres o cuatro días. Al día 20, las células diferenciadas se adhieren y crecen como pequeños agregados. Durante los siguientes cinco días, aparecen axones y neuritas mucho más intensos y morfológicamente intactos dentro de los agregados, formando algunas conexiones entre ellos.

Después de 11 días de diferenciación, las células madre pluripotentes humanas pueden convertirse eficientemente en precursores de la placa basal. Como se muestra en estas imágenes, casi todas las células expresan los marcadores celulares de precursores de la placa basal, como NESTIN y FOXA2, y más del 90 % de las células expresan CORIN, OTX2 y LMX1A. Tras una diferenciación adicional, las células precursoras de la placa basal se especializan en neuronas dopaminérgicas que expresan TUJ1 y TH. Estas neuronas dopaminérgicas presentan una identidad de tipo 9, ya que expresan EN1 y son negativas para calbindina. Experimentos de inmunotinción también demuestran que no hay astrocitos GFAP positivos y muy pocas neuronas GABAérgicas, lo que indica que la diferenciación es exclusivamente específica para la línea de neuronas dopaminérgicas.

Al probar este procedimiento, es importante mantener la consistencia en el cultivo celular diario y asegurarse de que el medio se prepare fresco con los ingredientes correctos.