Un método de inmunofluorescencia para la caracterización de las células del esófago de Barrett

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los efectos del tratamiento farmacológico sobre la estructura celular y la localización de proteínas en las células BE. Esto se logra incubando las células BE cultivadas en los cubreobjetos de vidrio con un fármaco elegido en condiciones estándar de cultivo celular. Como segundo paso, incubar las células tratadas con un fijador, que preserva la estructura y localización de la proteína.

A continuación, se incuban secuencialmente células BE fijas con anticuerpos primarios y secundarios marcados con fluorescencia para visualizar los cambios en la proteína diana seleccionada mediante microscopía de fluorescencia. Se obtienen resultados que muestran cómo el tratamiento farmacológico de las células BE altera la localización de proteínas y la estructura celular basándose en la visualización de la tinción inmunofluorescente. Aunque este método puede proporcionar información sobre el esófago de Barrett, también se puede aplicar a otros sistemas, como el cáncer y las células normales. Comience este procedimiento colocando los cubreobjetos de 18 milímetros en una placa de Petri de vidrio y áctelos en autoclave.

A continuación, transfiera los cubreobjetos del autoclave a una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos utilizando una pipeta de vidrio estéril conectada a un tubo de vacío. Después de ese lavado, la cubierta se desliza con PBS y medios estériles. A continuación, tripsina.

Las células inmortalizadas cuentan las células utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro y posteriormente diluyen las células en medios de cultivo a una concentración de 20.000 a 40.000 células por mililitro. A continuación, coloque un mililitro de células en cada pocillo que contenga un cubreobjetos. Para un recuento total de células de 20.000 a 40.000 células por pocillo, utilice una punta de pipeta estéril para empujar suavemente el cubreobjetos hasta el fondo del pocillo para asegurarse de que las celdas se adhieran al cubreobjetos.

Para tratar las células BE, diluya el fármaco seleccionado en medios a 37 grados Celsius hasta la concentración deseada, mezcle bien invirtiendo el tubo repetidamente o utilizando un mezclador de vórtice. Comenzar el tratamiento 24 horas después del asentamiento inicial de las células BE para permitir la adhesión de las células a la cubierta. Desliza ahora las placas de muestra preetiquetadas para el fármaco y el vehículo tratadas con una pluma de laboratorio para distinguir entre la comparación y el control. Tratar un cubreobjetos adicional de células de be con un 0,1% de vehículo diluido en el medio de cultivo.

Después, coloque las células en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 98% de humedad. Ahora, después del tiempo de incubación deseado del tratamiento farmacológico, aspire el medio y lave los deslizamientos de la cubierta rápidamente con un XPBS a temperatura ambiente. A continuación, aspire el PBS y añada un mililitro de PBS que contenga un 4% de PFA a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, aspire el 4%P-F-A-P-B-S Lave los cubrecubiertos tres veces durante cinco minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente. Guarde las hojas de cubierta durante una semana en PBS y 0.1% PFA a cuatro grados Celsius si lo desea. Para permear los ojos a las células PFA fijadas con el fin de permitir que el anticuerpo acceda a las dianas intracelulares, incubar las células con cloruro de amonio 50 milimolares diluido en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Luego lávelos con PBS a temperatura ambiente una vez durante cinco minutos. Esto reducirá el fondo para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos a las proteínas celulares. Incubar las células BE durante 30 minutos en 100 a 300 microlitros de PBS que contienen 0,1% de troponina y 0,5% de BSA.

A continuación, prepare una placa cuadrada de bioensayo cubriendo el fondo de la cámara con toallas de papel húmedas y colocando una capa de perfume encima. Marque el perfume con un bolígrafo de laboratorio para identificar los cubreobjetos. Transfiera suavemente las células de deslizamiento de la cubierta hacia arriba sobre el param con pinzas y una aguja de jeringa.

Ahora diluya el anticuerpo primario en PBS que contenga 0,5% de BSA y 0,1% de saponina, borre suavemente la solución de bloqueo. Con un pañuelo de laboratorio, agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpo primario e incube las células durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente.

Lave los portaobjetos tres veces con PBS que contiene 0,5 % de BSA y 0,1 % de troponina durante cinco minutos cada vez a temperatura ambiente. A continuación, diluir el anticuerpo secundario conjugado con una marca fluorescente en PBS que contenga 0,5 % de BSA y 0,1 % de ponente. Agregue 100 microlitros de anticuerpo diluido a cada cubreobjetos e incube las células durante dos horas a temperatura ambiente.

Lave las hojas de cubierta tres veces, cinco minutos cada vez en PBS que contenga 0.5% de BSA y 0.1% de troponina. Retire el tampón de lavado y agregue de 100 a 300 microlitros de PBS a los cubreobjetos. Levante suavemente el cubreobjetos con pinzas y seque el PBS con un pañuelo de papel de laboratorio o una toalla de papel.

A continuación, añada 15 microlitros de un medio de montaje Antifa adecuado que contenga DPI al cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos invertido en un portaobjetos de vidrio para microscopio con las células hacia abajo. Posteriormente, coloque los portaobjetos en una carpeta de portaobjetos y manténgalos alejados de la luz directa durante la noche a temperatura ambiente para permitir que el medio Antifa se cure.

Una vez que el medio Antifa se ha endurecido, los portaobjetos se pueden almacenar a cuatro grados centígrados o a menos 20 grados centígrados hasta la visualización microscópica. En este paso, retire los portaobjetos de almacenamiento a menos 20 grados centígrados o cuatro grados centígrados y deje que se calienten a temperatura ambiente. Encienda el microscopio y la lámpara de arco de mercurio.

Coloque un portaobjetos de microscopio con el cubreobjetos hacia el objetivo en la platina del microscopio. A continuación, seleccione el filtro DAPI y abra el obturador. Enfoca el objetivo mientras miras a través de los oculares hasta que aparezca la imagen.

Dado que todas las células se han teñido con dpi, los núcleos deben observarse fácilmente. Recolección de imágenes utilizando software de procesamiento de imágenes adecuado en esta figura, los cubreobjetos con CPC y CPD se trataron con vehículo o un micromolar del inhibidor de SRC. SKI 6 0 6 durante 24 horas se fijaron y teñieron las células.

De acuerdo con el protocolo descrito, la beta catenina indicada en verde se visualizó utilizando un anticuerpo específico y un anticuerpo secundario acoplado a LOR 4 88, mientras que el núcleo se tiñó con DPI indicado en azul. Nótese el cambio en la ubicación de la beta-catenina del núcleo a la membrana celular. Después del tratamiento con SKI 6 0 6.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo teñir inmunofluorescentemente el esófago de Barrett para investigar la localización de proteínas o la estructura celular.