Name: التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: تعلم تقنية تشكيل البؤر لتقييم القدرة الورمية للجينات باستخدام خلايا فيبروبلاست الفئران NIH 3T3. تُعد هذه الطريقة أداة قيمة في أبحاث السرطان لتحديد الجينات المسببة للتحول الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من خلال منحة من جديد مبتكر برنامج جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة في (ED). وأيد AA في جزء من الجوائز البكالوريوس من المعهد الوطني للسرطان ومؤسسة العلوم الوطنية.

1. جعل النواقل الفيروسية تسلسل الترميز لهذا الجين من الفائدة، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية، تندس في pBABEpuro بالطرق التقليدية الاستنساخ (PCR التضخيم، والهضم تقييد وربط). هناك أربعة مواقع قيود على ناقلات حيث يمكن إدخال DNA: إنزيم BamHI، SnaBI، EcoRI وسالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ترنسفكأيشن الصف بلازميد DNA من خلايا المختصة باستخدام QIAGEN بلازميد ميدي عدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل NanoDrop2000. </li></ol> 2. الارتجاعي الإنتاج سيتم استخدام خط الخلية التعبئة والتغليف بلات-E لإنتاج الفيروس الارتجاعي ecotropic التي سيلقي [كدنا] التي تهم خلايا NIH 3T3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء الثقافات بلات-E من خلايا مجمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بسرعة خلايا بلات-E في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة ببطء 9 مل من بلات-E المتوسطة (دوlbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + البنسلين والستربتوميسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من بلات-E متوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة حتى تكون 80-90٪ متموجة (حوالي 2 أيام). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا عن طريق الإصبع والتنصت، وإضافة 10 مل من بلات-E المتوسطة، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا مع 10 مل من بلات-E المتوسطة والبذور منها في أطباق جديدة في 1: 4-1: 6 التخفيفات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلات-E البذر وترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 2 × 10 6خلايا لكل 10 سم صحن الثقافة باستخدام بلات-E وسيط وبدون أي المضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا O / N في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، ونقل 300 ميكرولتر من غروب-MEM إلى 1.5 مل microfuge أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 27 ميكرولتر من polyethylenimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن فعالة من حيث التكلفة 12، إلى أنبوب استعداد مع غروب-MEM. المزيج بلطف بواسطة الإصبع التنصت واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9 ميكروغرام من DNA البلازميد ترنسفكأيشن الصف في أنبوب غروب-MEM / PEI، مزيج من قبل vortexing بلطف، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DNA / PEI قطرة من الحكمة معقدة في طبق بلات-E، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، نضح في المتوسط ​​تحتوي على كاشف ترنسفكأيشن وإضافة 10 مل من جديد بلات-E متوسطة (بدون المضادات الحيوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى الخلايا الحاضنة. </li></ol></li></ol> 3. خلايا NIH 3T3 والعدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء المعاهد الوطنية للصحة3T3 الثقافات والبذر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بسرعة خلايا NIH 3T3 في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى أنبوب 15 مل. إضافة ببطء 9 مل من NIH 3T3 المتوسطة (DMEM + 10٪ FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا مع 10 مل من NIH 3T3 المتوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. من المهم جدا أن الخلايا NIH 3T3 يتم الاحتفاظ دائما underconfluent (50-60٪)، كما تردد التحول التلقائي (وبالتالي مستويات القاعدية من تشكيل بؤر) يزيد مرة واحدة تصل إلى ثقافة confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 3 × 10 5 خلايا لكل 10 سم طبق واحتضان O / N للعدوى في اليوم التالي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد طاف فيروسات من الطبق بلات-E باستخدام 10 مل حقنة واحدة، وتصفية عليه من خلال 0.45 ميكرون حجم المسام النايلون مرشح غشاء، وتحويلها إلى 15 ملأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من جديد بلات-E المتوسطة للخلايا (بدون المضادات الحيوية)، وإعادتها إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من الطبق خلية NIH 3T3 للإصابة، وإضافة 5 مل من العادية المتوسطة NIH 3T3 و 5 مل من التي تحتوي على فيروس تصفيتها طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة polybrene إلى الطبق بتركيز 6 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.5 لجولة ثانية من العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس مع منتظم المتوسطة NIH 3T3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا NIH 3T3 لتنمو لمدة 2-3 أسابيع، لتحل محل المتوسطة حسب الضرورة. تحقق من التعبير عن بروتين الاهتمام من جانب التقليدي الكهربائي البروتين وطخة مناعية على لست] خلية كاملة من لوحات طبق الأصل. </li></ol></li></ol> 4. تلطيخ والكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريستال البنفسجي تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة NIH 3T3 ووضع الأطباقعلى الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأطباق مرتين مع PBS الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا مع الميثانول الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أطباق من الجليد، ونضح الميثانول، وإضافة 3 مل من 0.5٪ محلول الكريستال البنفسجي المحرز في 25٪ الميثانول (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأطباق لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل الكريستال البنفسجي وشطف بعناية الطبق مع ميلي-Q H 2 O حتى يأتي لا لون ثماره في الشطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأطباق لتجف O / N على الفوق (كشف). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بؤر الكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الأطباق جافة، استخدام مسطرة لقياس مجموعات الملونة على نحو مظلم من الخلايا على طبق من ذهب. الاعتماد فقط تلك التي هي أكبر من 5 ملم في القطر بأنها &quot;بؤر&quot;. سجل عدد من البؤر وحساب المتوسطات وأهمية مقارنة مع الضوابط. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يوفر FFA طريقة سريعة وسهلة لتقييم التحول الخبيث في المختبر. فمن قابلة للفحص عدد كبير نسبيا من الجينات المرشحة، والمتطلبات التقنية المتواضعة جعلها فعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من الجينات يمكن coexpressed (يشار إليها أحيانا باسم &quot;التعاون&quot; فحص) لتقييم إمكانات مكون للأورام الدمج. مزايا هذا الاختبار تعتمد على تقنية لها مباشرة، وسهولة القياس الكمي والقصير نسبيا بدوره حول الوقت. ويجب التأكيد على ذلك، ومع ذلك، أنه لا تشكل القيود المفروضة على جميع ...

الخلايا السرطانية يمكن تمييزها عن نظيراتها العادية من قبل مجموعة واسعة من التعديلات، من أنماط التعبير الجيني لepigenomics إلى تغيرات شكلية والتكاثري. ومن بين هذه الأخيرة، وخفض الاعتماد على المصل، وفقدان الاتصال (الكثافة) تثبيط، واقتناء الانتشار مرسى مستقل، وفي نهاية المطاف، القدرة على تكوين الأورام عند حقنه في الحيوانات، مؤشرات قابلة للقياس مفيدة التحول الخبيث 3. عدة في المختبر والمقايسات فيفو تم وضعها من أجل التحول الخلوي. في المختبر فحوصات تهدف إلى تحديد وقياس التغيرات في التشكل الثقافة (التركيز تشكيل فحص)، وديناميات الثقافة (معدل النمو والكثافة التشبع)، وعامل النمو (النمو في انخفاض المصل) أو مرسى (النمو في أجار لينة) المتطلبات. لا يزال المعيار الذهبي لتحديد طبيعة الخبيثة من نوع الخلية تشكيل الورم (xenografts) في حيوانات التجارب. ومع ذلك، رانه يكلف وطول من الدراسات في الجسم الحي لا تجعل لهم دائما مبررا كخطوة أولى التحقق من صحة أو فحص الجينات المسرطنة مرشح. على الرغم من عدم الفحص في المختبر يوفر تقييم واضح للإمكانات أنكجنيك من الجين، فإنها توفر نظرة ثاقبة إمكانات أنكجنيك التي قد تضييق المستقبل في الدراسات المجراة. واحد من أكثر الأنظمة المستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانات أنكجنيك في المختبر هو التركيز تشكيل الفحص 2. ويعتمد هذا الأسلوب على استخدام NIH 3T3 الخلايا الليفية الماوس، خط خلية غير حولت الذي يظهر تثبيط اتصال قوية. overexpression من على النتائج الجين الورمي في فقدان النمو التي تعتمد على كثافة. الخلايا تحولت يمكن بعد ذلك تنمو في طبقات متعددة، وتشكيل &quot;بؤر&quot;، تصور بسهولة ضد أحادي الطبقة الخلفية للخلايا غير متحول. تشكيل التركيز الفحص، ثم، يقيس قدرة الجين الورمي مرشح للحث على التحول الخبيث، كما يتضح من فقدان الاتصال inhibition باعتباره النمط الظاهري للقياس. وقد استخدم FFA لتقييم التحول من overexpression من تحركات البروتينات (على سبيل المثال، SRC 4، BRAF 5)، عوامل النسخ (على سبيل المثال، N-MYC 6) مستقبلات، إلى جانب G-البروتين (على سبيل المثال، P2RY8 7) وGTPases (على سبيل المثال ورأس 1)، وغيرها. السهولة النسبية لهذا الاختبار يجعلها خيارا جيدا من شأنها أن توفر إجابة واضحة وسريعة بصريا ما إذا كان overexpression من الجينات يكفي لتحويل NIH 3T3 خلايا فأر الليفية في المختبر. وFFA الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم بلات-E خط الخلية التعبئة والتغليف 8، والذي يوفر البروتينات الفيروسية التعبئة والتغليف، وفيروسات ناقلات pBABEpuro 9 (Addgene بلازميد 1764) لإنتاج الفيروس الارتجاعي. بعد ترنسفكأيشن مع بناء pBABEpuro التي تحتوي على الجينات في المصالح، فإن خط الخلية بلات-E تنتج الارتجاعي ecotropic التي يمكن استخدامها لتصيب خلايا NIH 3T3. تيطريقة الفيروسي له من توصيل الجينات هو أكثر فعالية من الأساليب ترنسفكأيشن الكيميائية التقليدية، وأنه يوفر وسيلة للتعبير عن هذا الجين على نحو مستدام 10. مرة واحدة دمجها في جينوم الخلايا NIH 3T3، والدافع overexpression من هذا الجين من الفائدة من جانب يكرر محطة الطويلة الفيروسية (LTR) المروج 11. ويمكن استخدام هذا التعبير المستمر لتحديد ما إذا كانت الجينات في المصالح والنشاط أنكجنيك، مقاسا تشكيل بؤر، على خلايا NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro vector</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>ناقلات الاستنساخ</td></tr><tr><td>Platinum-E خط خلايا التعبئة والتغليف الفيروسي القهقر ، Ecotropic</td><td>Cell Biolabs، Inc.</td>خط خلية <td>RV-101</td><td>للإنتاج الفيروسي</td></tr><tr><td>NIH 3T3 Cell Line الفئران</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>خط الخلية لفحص تكوين التركيز</td></tr><tr><td>10 مل BD Luer-Lok طرف حقنة</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>كاشف الإنتاج الفيروسي</td></tr><tr><td>0.45 & mu ؛ م Puradisc حقنة مرشح</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>كاشف الإنتاج الفيروسي</td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td> <td>Polysciences، Inc.</td><td>23966-2</td><td>كاشف تعداء الخلية</td></tr><tr><td>عدوى البوليبرين / كاشف التعداء</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>كاشف تعداء الخلية</td></tr><tr><td>كريستال البنفسجي</td><td>فيشر العلمي</td><td>C581-25</td><td>كاشف وصمة عار الخلية</td></tr><tr><td>بلازميد بلس ميدي كيت</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>تنقية البلازميد</td></tr><tr><td>أطباق زراعة الأنسجة الصقر</td> BD <td>Biosciences</td><td>353003</td><td>مستلزمات زراعة الخلايا</td></tr>وسط <tr><td>النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>وسائط زراعة الخلايا</td></tr><tr><td>0.05٪ Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>مستلزمات زراعة الخلايا</td></tr><tr><td>Opti-MEM I مصل مخفض متوسط</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>وسائط زراعة الخلايا</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>وسائط زراعة الخلايا</td></tr></tbody></table>

التركيز تشكيل: a الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

عادة ما يرتبط التحول الخبيث للخلايا بزيادة التكاثر ، وفقدان تثبيط الاتصال ، واكتساب إمكانات النمو المستقلة عن المرسى ، والقدرة على تكوين أورام فيالتجارب 1. في خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 ، من المعروف أن مسار نقل إشارة Ras يؤدي إلى العديد من هذه الأحداث ، وهو ما يعرف باسم تحويل Ras. قد يؤدي إدخال جين مفرط التعبير في خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 إلى تعزيز التحول المورفولوجي وفقدان تثبيط الاتصال ، مما قد يساعد في تحديد إمكانات الأورام لهذا الجين ذي الأهمية. الاختبار الذي يوفر طريقة مباشرة لتقييم جانب واحد من إمكانات التحويل للجين الورمي هو مقايسة تكوين التركيز (FFA) 2. عندما تنقسم خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 بشكل طبيعي في الثقافة ، فإنها تفعل ذلك حتى تصل إلى طبقة أحادية التقاء. ومع ذلك ، في وجود جين ورمي مفرط التعبير عنه ، يمكن أن تبدأ هذه الخلايا في النمو في بؤر1 كثيفة متعددة الطبقات يمكن تصورها وقياسها كميا عن طريق تلطيخ البنفسجي البلوري أو Hema 3. في هذه المقالة نصف بروتوكول FFA مع نقل الفيروسات القهقرية للجين محل الاهتمام إلى خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 ، وكيفية تحديد عدد البؤر من خلال التلوين. يوفر نقل الفيروسات القهقرية طريقة أكثر كفاءة لتوصيل الجينات من التعدي ، ويوفر استخدام الفيروس القهقري للفئران الصديق للبيئة تحكما في السلامة البيولوجية عند العمل مع الجينات المسرطنة البشرية المحتملة.

MXD3 هو عامل النسخ الأساسي سحاب الحلزون حلقة حلزون ليسين (bHLHZ) الذي هو عضو من MYC / MAX / شبكة MAD. وهي عضو غير نمطية للأسرة MAD 13-15، وأفيد أن تشارك في التسرطن 16،17. بالمقارنة مع pBABEpuro (المراقبة السلبية) وMYC (مراقبة إيجابية)، كانت أطباق NIH 3T3 حيث تم overexpressed MXD3 أقل بكثير البؤر (الشكل 1A). وقد تم جمع البيانات في الشكل 1B من تجارب متعددة لتحديد أهمية. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direc...

توفر الفحص التركيز تشكيل طريقة واضحة لتقييم إمكانات تحويل من الجين الورمي مرشح.

التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء مقايسة تكوين البؤر في خطوط خلايا أرومة الليف الفأرية، باستخدام فيروس قهقري لتحديد القدرة المسرطنة لجين ما. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استنساخ تسلسل الجين المستهدف في ناقل فيروس قهقري. وتتمثل الخطوة الثانية في إنتاج جسيمات فيروس قهقرية باستخدام الناقل الفيروسي وخلايا التغليف PLA e.بعد ذلك، يُستخدم الفيروس القهقري لإصابة خلايا NIH 3T3 الليفية الفأرية من أجل تقييم القدرة التحويلية للجين المستهدف. وتتمثل الخطوة النهائية في السماح لخلايا NIH 3T3 بالانقسام لمدة تتراوح بين أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، يتبع ذلك الصبغ بصبغة البنفسج البلوري (crystal violet) لتقدير عدد البؤر المتكونة. وفي النهاية، يُستخدم مقايسة تكوين البؤر لإظهار ما إذا كان الإفراط في تعبير الجين المستهدف كافياً لتحفيز النمو المستقل عن الكثافة في الخلايا الليفية الفأرية.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا السرطان، مثل فحص القدرة المسرطنة لجين ما. للبدء، قم بتحضير الناقل الفيروسي كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، قم بإنشاء مزارع plat E من خلايا مجمدة عن طريق إذابة خلايا plat E سريعاً في حمام مائي عند 37 degree Celsius، ثم نقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.أضف تسعة ملليلتر من وسط PLA E ببطء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 180 ×g لمدة خمس دقائق، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا باستخدام 10 ملليلتر من وسط plat E، وانقلها إلى طبق زراعة قطر 10 سنتيمتر.بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا في حضانة عند درجة حرارة 37 °C ونسبة 5%CO2 حتى تصل نسبة تلاقي الخلايا إلى ما بين 80 و 90%Confluent. يتم إجراء تقسيم الخلايا عن طريق شفط الوسط أولاً، ثم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS قبل إضافة 2 mL من 0.05%tripsin EDTA والتحضين لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم فصل الخلايا عن طريق النقر بالأصابع. بعد ذلك، يتم إضافة 10 mL من وسط plat E ونقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 15 mL.قم بطرد الأنبوب مركزياً كما سبق، ثم أعد تعليق الخلايا باستخدام 10 milliliters من وسط plat E. بعد ذلك، ازرع 2 million خلية لكل طبق استزراع بمقاس 10 centimeter باستخدام وسط plat E الخالي من أي مضادات حيوية، واترك الخلايا لتحضن طوال الليل. وفي اليوم التالي، انقل 300 microliters من optimum إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 milliliter.أضف 27 µL من البولي إيثيلين أمين إلى الأنبوب المُجهز بـ Optum. اخلط المزيج برفق عن طريق النقر بالأصابع واتركه للحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 9 µg من الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) من الدرجة المستخدمة في عفن الخلايا (transfection grade) إلى الأنبوب، واخلط المزيج برفق باستخدام جهاز الـ vortex، ثم اتركه للحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.ثم أضف الخليط قطرة تلو الأخرى في طبق plat E قبل التحضين طوال الليل. وفي اليوم التالي، اشفط الوسط الذي يحتوي على كاشف عفن الخلايا (transfection reagent) وأضف 10 milliliters من وسط plat E الطازج قبل إعادة الخلايا إلى الحاضنة لإنشاء مستنبتات NIH three T three. أولاً، قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degree Celsius وانقلها إلى أنبوب سعة 15 milliliter.أضف ببطء تسعة ملليلترات من وسط NIH 3T3 إلى الخلايا، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 180 ×g لمدة خمس دقائق وتخلص من الرائق. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا باستخدام 10 ملليلترات من وسط NIH 3T3، وانقلها إلى طبق زراعة بقطر 10 سنتيمتر. حضن الخلايا في حاضنة عند 37 °C وبنسبة 5% CO2، مع الحفاظ عليها دون الوصول إلى حالة التلاقي الكامل لزيادة معدل التحول التلقائي.بمجرد أن تصل المزرعة إلى مرحلة التلاقي، وبمجرد نموها، يتم استزراع 3 × 10⁵ من خلايا 3T3 في طبق قطر 10 سنتيمتر، وتحضينها طوال الليل من أجل العدوى في اليوم التالي. في اليوم التالي، يتم جمع المادة الطافية للفيروس القهقري من طبق Plat E باستخدام سرنجة بلاستيكية سعة 10 ملليلتر، وتصفيتها عبر مرشح غشائي من النايلون بمسامية 0.45 ميكرون، ونقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر. يتم إضافة 10 ملليلتر من وسط Plat E الطازج إلى الخلايا قبل إعادتها إلى الحاضنة.بعد ذلك، اسحب الوسط من طبق خلايا NIH 3T3 المراد إصابتها، ثم أضف 5 mL من وسط NIH 3T3 العادي، و5 mL من الرائق المرشح المحتوي على الفيروس. بعد ذلك، أضف polybrene إلى الطبق بتركيز 6 µg/mL.قم بتحضين الخلايا طوال الليل قبل تكرار خطوات العدوى لجولة ثانية من العدوى. بعد العدوى، استبدل الوسط الذي يحتوي على الفيروس بوسط IH 3T3 العادي. اترك خلايا IH 3T3 لتنمو لمدة يومين إلى ثلاثة أيام، مع استبدال الوسط حسب الضرورة، وذلك تمهيداً للصبغ بصبغة البنفسج البلوري (crystal violet).قم بشفط وسط NIH three T three وضع الأطباق على الثلج. اغسل الأطباق مرتين باستخدام PBS بارد جداً. قم بتثبيت الخلايا باستخدام ميثانول بارد جداً لمدة 10 minutes.بعد ذلك، أخرج الأطباق من الثلج واسحب الميثانول. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول crystal violet بتركيز 0.5% المحضر في ميثانول بتركيز 25%، واترك الأطباق لتحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، اسحب محلول crystal violet واغسل الطبق بعناية بماء Milli Q حتى يختفي اللون تماماً من غسول الشطف.اترك الأطباق لتجف دون غطاء طوال الليل على سطح المختبر. وبمجرد جفاف الأطباق، استخدم مسطرة لقياس البؤر وعدّ تلك التي يتجاوز قطرها 5 mm وتسجيلها. إن MXD3 هو عامل نسخ من نوع helix loop helix leucine zipper أساسي، وهو عضو غير نمطي في عائلة MAD، وقد أُفيد بمشاركته في التسرطن عند مقارنته بالمجموعة الضابطة السالبة والمجموعة الضابطة الموجبة.أظهرت أطباق NIH 3T3 التي تم فيها التعبير المفرط عن MXD3 عدداً أقل بكثير من البؤر. تم جمع البيانات من تجارب متعددة لتحديد الدلالة الإحصائية، ولوحظت الاتجاهات ذاتها من هذا المقايسة. تشير النتائج إلى أن MXD3 لا يعمل كجين ورمي عقب هذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسة تكوين البؤر باستخدام تركيبات جينية، والنمو في أجار طري للتكاثر، وتحليل الدورة الخلوية، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية لتقييم دور جين معين في نشوء وتطور الأورام.

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

يصف هذا الفيديو مقايسة تكوين مستعمرة أجار ناعمة لاختبار تأثيرات مثبط إنزيم PADI و BB-Cl-amidine على أورام سرطان الثدي في المختبر. يتيح هذا الاختبار أيضا التقييم الكمي لإمكانات تحول الخلية في سياق الاضطرابات الجينية.

مقايسة تكوين مستعمرة أجار الناعمة: طريقة لاختبار تأثيرات المركبات الجديدة على تكاثر الخلايا السرطانية

يصف هذا الفيديو مقايسة تكوين المستعمرة ، والتي تساعد في تحديد قدرة خلايا سرطان الرئة على التكاثر إلى أجل غير مسمى وتشكيل مستعمرات فردية. يمكننا تحليل تأثير عامل مضاد للسرطان على الخلايا المكونة للمستعمرة من خلال تحليل التغيرات في عدد و / أو حجم المستعمرات الناتجة.

مقايسة تكوين المستعمرة: تقييم فعالية العوامل المضادة للسرطان على خلايا سرطان الرئة المكونة للمستعمرات

يصف هذا الفيديو بروتوكول وحدة تكوين المستعمرة القائمة على ميثيل السليلوز أو مقايسة CFU ، والتي تساعد في تحديد وحساب عدد المستعمرات التي تشكلها خلايا سرطان الدم استجابة للعلاج بالمركبات المضادة للسرطان.

مقايسة CFU المستندة إلى ميثيل السليلوز: طريقة لتحديد تأثير المركبات المضادة للسرطان على تكوين المستعمرة في خلايا سرطان الدم

التوصل إلى فهم مستوى النظم من العمليات الخلوية هو هدف بيولوجيا الخلية في العصر الحديث. نحن هنا وصف استراتيجيات للصحفيين وسيفيراز المتنوعة من مختلف وظيفة الخلوية نقطة نهاية لاستجواب وظائف الجينات باستخدام الجينوم على نطاق والمكتبات رني.

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة هي طريقة تستخدم لتأكيد النمو المستقل عن الارتساء الخلوي في المختبر. الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح طريقة صارمة للكشف عن الإمكانات السرطانية للخلايا المحولة والتأثيرات المثبطة للبروتينات للورم على الخلايا المحولة.

تشكيل مستعمرة الفحص لينة آجار

يعد تحديد أهداف الأدوية الجديدة التي تنتقل من الاختبارات قبل السريرية إلى التجارب البشرية أولوية علمية. تحقيقا لهذه الغاية ، نصف هنا نهج الجينوم الوظيفي لفحص تأثير استنفاد الجينات على كرويات خط الخلايا السرطانية ، والتي تصمم بشكل أكثر ملاءمة السرطانات البشرية في الجسم الحي.

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

قمنا بتطوير بروتوكول جديد لدراسة الديناميات السكانية غير المتجانسة في الاستجابة للاضطرابات. تصف هذه المخطوطة منصة تعتمد على التصوير تنتج مجموعات بيانات كمية لتوصيف في وقت واحد من المظاهر الخلوية متعددة من السكان غير المتجانسة بطريقة قوية.

التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

هنا، يمكننا وصف بروتوكولات المصادقة الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 كهدف المخدرات في سرطان الدم باستخدام الماوس الوراثية وأنسنة في المختبر والمجراه في نماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.

أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للاستنساخ لعزل الخلايا الأولية لالروماتيزم الفأر، وتشكيل الأورام وعلاجها، وزرع الطعوم بدءاً من ثقافات الأورام.

اشتقاق الأورام والعلاج من الخلايا السرطانية الأولية المعزولة من الساركوما الروماتيزمية الماوس

المجالات المضطربة في جوهرها مهمة لوظيفة عامل النسخ الإنصهاري. لاستهداف هذه البروتينات علاجيا، هناك حاجة إلى فهم أكثر تفصيلا للآليات التنظيمية المستخدمة من قبل هذه المجالات. هنا ، نستخدم transcriptomics لرسم خريطة السمات الهيكلية الهامة للمجال EWS المضطربة في جوهرها في ساركوما يوينغ.

رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي

يوفر هذا البروتوكول التجريبي طريقة مستقرة وفعالة من حيث التكلفة وكفاءة تجمع بين إزالة الحمض النووي الريبي (lncRNA) واختبارات تكوين المستعمرات لقياس تأثير ال lncRNA على تكاثر خلايا الساركوما العظمية.

اختبار تكوين المستعمرة الذي يكشف عن القدرة التكاثرية لخلايا ساركوما العظمية التي تسقط بواسطة LncRNA

تعلم تقنية تشكيل البؤر لتقييم القدرة الورمية للجينات باستخدام خلايا فيبروبلاست الفئران NIH 3T3. تُعد هذه الطريقة أداة قيمة في أبحاث السرطان لتحديد الجينات المسببة للتحول الخلوي.

التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

استكشف المزيد من الفيديوهات