Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

El objetivo general de este procedimiento es operar un citómetro de flujo miniaturizado a bordo de un vuelo parabólico con gravedad reducida, utilizando la preparación de componentes y procedimientos en vuelo que potencialmente podrían adaptarse a otras configuraciones. Esto se logra primero seleccionando cuidadosamente componentes comerciales y fabricados a medida, fáciles de usar y seguros en condiciones de gravedad reducida. El segundo paso consiste en ensamblar los componentes dentro de un banco de pruebas para vuelo parabólico que contiene elementos adicionales para contención, visualización, automatización y facilitación de múltiples demostraciones.

A continuación, el equipo se prepara para llevar a cabo experimentos exitosos durante el vuelo mediante una planificación minuciosa, el desarrollo de protocolos y la capacitación. El paso final consiste en demostraciones multifacéticas durante el vuelo. En última instancia, las pruebas en vuelo parabólico se utilizan para mostrar las posibles aplicaciones espaciales de la tecnología y para identificar los efectos de los cambios de gravedad en estado de ingravidez y de las vibraciones sobre el rendimiento.

Aunque este método puede aplicarse a la citometría de flujo y tecnologías relacionadas, también puede aplicarse parcialmente a otros tipos de pruebas diagnósticas individuales en gravedad reducida, particularmente a cualquier procedimiento con múltiples demostraciones o protocolos desencadenantes. Por eso decidimos realizar este video para JO sobre pruebas en vuelo parabólico, porque cuando estábamos preparándonos para nuestros vuelos parabólicos con nasa, esencialmente no existían muchos videos ni siquiera literatura que describiera cómo prepararse de la mejor manera para los experimentos. En realidad tuvimos que esforzarnos mucho para hablar con las personas adecuadas en distintas áreas de la nasa y obtener esa información aquí.

En este caso, queremos poder compartir esta información con la audiencia de JoVE para que también puedan prepararse adecuadamente para estos vuelos. La construcción de un sistema sencillo de citometría de flujo para usar en condiciones de gravedad reducida requiere múltiples componentes prototipo de fluidos, ópticos y electrónicos. Comience por preparar un sistema de presión con necesidades mínimas de peso y energía para impulsar el sistema.

La fluídica conecta una bomba de aire miniaturizada a un sensor de presión diferencial. A continuación, ensamble un recipiente de fuente de fluido que pueda cargarse sin atrapar burbujas de aire. Un vial de plástico rígido con un diafragma de caucho elástico, una tapa firmemente sellable y un tubo de entrada de aire en la base del vial.

Selle la conexión del tubo de aire de entrada utilizando adhesivo óptico. Coloque una abrazadera de diapositiva temporal sobre el tubo de salida del casquillo para evitar la expulsión de líquido durante y después de la inserción del casquillo. Para cargar el vial, expanda el diafragma con una jeringa conectada a la entrada de aire.

Vierta el líquido hasta el tope e inserte la tapa en ángulo para que no quede aire atrapado debajo. Retire brevemente la abrazadera del tubo para cebado del tubo de salida y liberar la presión de colapso ejercida por el diafragma. Asegúrese de que la bomba presurice el vial sin fugas de aire ni de líquido.

Comprimir el diafragma para impulsar el flujo de fluido hacia fuera a través del tubo de salida del tapón. El tercer componente necesario es un recipiente para residuos líquidos que recoja los desechos sin generar una presión inversa que pueda comprometer el flujo. Utilice un vial pegado dentro de otro vial, diseñado para contención doble.

Tape las ampollas con una ventana de esponja de foam asegurada que atrapa los líquidos flotantes, pero permite la igualación de la presión del aire con el entorno de la cabina para crear un cargador de muestras para su uso en máquinas de gravedad reducida, y ensamble un diseño de abrazadera con resorte y rieles guía de manera que sujete de forma confiable el capilar con funda entre dos anillos tóricos (O-rings) en la línea de fluido. Asegúrese de que, en ausencia de un capilar, los resortes presionen los anillos tóricos entre sí para completar la línea de fluido y permitir el cebado sin fugas. Diseñe un mezclador microscópico que no dependa de subcomponentes mecánicos con alimentación eléctrica para funcionar.

Utilizando el método de prototipo rápido de polimetil metacrilato, se selecciona y fabrica un micromezclador en espiral con vórtice de dos entradas para detectar partículas individuales en flujo. Monte un bloque óptico miniatura del tamaño de la palma de la mano, fabricado a medida, en una placa de banco óptico mediante componentes optomecánicos disponibles comercialmente. El paso final en el ensamblaje del prototipo consiste en diseñar la electrónica y el software para el control del dispositivo y la adquisición de datos.

Por comodidad y prototipado temprano, utilice piezas soldadas a mano conectadas a tarjetas comerciales de adquisición de datos, código y programa, y un software personalizado para operar los dispositivos del sistema y sincronizar todos los datos. Retire la batería del portátil y configure el equipo para que funcione únicamente a través del cable de alimentación. Por razones de seguridad durante los vuelos de gravedad reducida, el esquema eléctrico para alimentar todos los dispositivos debe incluir un mecanismo para apagado electrónico rápido y completo.

En vuelo. Se conecta una sola regleta con un único botón de encendido y apagado al panel de distribución de energía de la aeronave; para un rendimiento exitoso en vuelo, se debe considerar el espacio total disponible y cómo se dividirá entre el espacio del equipo experimental y el espacio para el usuario alrededor del equipo. El espacio total disponible está limitado a un área más pequeña que la proporcionada para una demostración similar en tierra.

Determine qué componentes son más adecuadamente accesibles desde una posición agachado en el suelo o de pie. También es importante considerar qué componentes se beneficiarán más de la protección obtenida dentro de una estructura de soporte. La estructura de soporte del sistema aquí es un bastidor vertical de equipo que puede resistir las aceleraciones durante el vuelo y puede fijarse de forma segura a la aeronave prevista.

Los componentes asignados al piso de la cabina se distribuyeron en distintos niveles dentro del rack: un nivel superior para colocar la computadora portátil, un nivel intermedio para alojar los subcomponentes del prototipo y un nivel inferior para guardar toallitas adicionales, guantes y un recipiente para desechos varios. Para asegurar y contener el prototipo, así como para observar las muestras, es necesario fabricar o adaptar diversos componentes que no forman parte del prototipo. Estos incluyen una caja acrílica personalizada para albergar la electrónica y una caja acrílica con orificios para los brazos, también personalizada, que proporciona un espacio cúbico en el cual realizar una demostración del cargador sin riesgo de contaminar la cabina de vuelo.

Para grabar una demostración del perno mezclador microscópico, coloque un microscopio estereoscópico en la placa de montaje equipada con un soporte personalizado de chip de acrílico y una cámara CCD. Para permitir una demostración segura del bloque óptico, utilice una caja opaca personalizada de acrílico para bloquear la luz ambiental y controlar los riesgos del láser. Algunas estrategias de diseño sencillas pueden eliminar la necesidad de tubos manuales, ajustes en pleno funcionamiento u otras acciones que requieran una destreza considerable.

Por ejemplo, para presurizar múltiples archivos fuente simultáneamente, utilice una máquina personalizada para presurizar un colector compuesto por un cilindro hueco, adaptado a una aguja de entrada y múltiples tubos de salida para controlar la dirección del flujo de fluido. Mediante la computadora, ensamble un panel de válvulas solenoides de tres vías. Controlado por interruptores MOSFET en tándem conectados a una tarjeta DAQ.

Las válvulas solenoides de tres vías tienen un puerto común que siempre está conectado al puerto de apagado predeterminado o al puerto de encendido. El cambio al estado de encendido se activa con una señal de cinco voltios. Programó el software para avanzar a través de las demostraciones mediante intervenciones de un solo botón, como un clic único en la computadora portátil para cambiar los estados de la válvula o modificar la presión de accionamiento de la bomba.

Esto evita la necesidad de ajustes manuales de los tubos que podrían provocar fugas al medio ambiente y pérdida de tiempo experimental en un entorno caótico. La demostración del cargador de muestras incluye la carga de una muestra y el transporte de la muestra hacia el bloque óptico o OB para su detección. El montaje utiliza dos válvulas, una antes y otra después del cargador.

Durante la carga, ambas válvulas se configuran en posición de apagado para evitar el movimiento del fluido mientras se utiliza el cargador; al encender las válvulas, se abre la vía de fluido X que se extiende desde el vial de solución salina hasta el vial de desecho, permitiendo que la bomba impulse la muestra para su análisis. La demostración del bloque óptico incluye la detección secuencial de tres tipos diferentes de muestras sin necesidad de cambiar manualmente las conexiones de los tubos; la solución salina puede limpiar el sistema entre muestras. La demostración del micro mezclador incluye segmentos de mezcla de sangre y solución salina, así como de colorantes azul y amarillo.

El sistema utiliza dos válvulas para dirigir la presión hacia los viales de sangre y suero salino o hacia los viales de colorante, de modo que solo una demostración de mezcla esté activa a la vez. Una válvula adicional permite la inyección de burbujas de aire en el chip de mezcla de sangre y suero salino. El sistema debe prepararse para soportar fuerzas repentinas, vibraciones o colisiones de pasajeros durante el vuelo.

Para la estabilización del alineamiento, aplique un epoxi de secado rápido a los componentes alineados que puedan desajustarse fácilmente, especialmente los componentes ópticos. Aplique también epoxi de grado industrial sobre el epoxi de secado rápido para asegurar otros componentes según sea necesario, incluyendo la fijación de la cámara CCD al microscopio I para pruebas de perturbación física. Agite la estructura de soporte con todos los componentes colocados.

Verifique la funcionalidad individual de cada componente tras someter el equipo a la perturbación, especialmente los componentes ópticos alineados preparados para eventos inesperados durante el vuelo, incluyendo el nivelado repentino del avión en medio de un experimento o la aparición súbita de fuerzas sobre el equipo. Proteja a los pasajeros flotantes añadiendo acolchado al bastidor. Los vértices capacitan a múltiples personas como operadores principales para manejar con pericia el dispositivo durante el vuelo.

Es impredecible quién se enfermará durante los vuelos parabólicos y un usuario determinado puede no verse afectado en un vuelo y enfermarse en otro. Verifique el equipo después del transporte al lugar del vuelo, realice las reparaciones necesarias y configure las conexiones de los tubos antes de cargarlo en la aeronave. En cada día de vuelo, prepare y conecte los viales de muestra correspondientes a las demostraciones del día.

Prepárese para posibles largos intervalos entre la preparación y el experimento, así como para altas temperaturas ambientales, dependiendo de la ubicación del vuelo. Evite el mareo durante el vuelo tomando los medicamentos proporcionados, como escopolamina con anfetamina, y utilice varias parábolas iniciales para adaptarse a las transiciones de gravedad levantándose lentamente en paralelo con el suelo y acostándose completamente durante los periodos de alta gravedad. Una vez en la posición de vuelo, los operadores del equipo deben tener suficiente espacio cuando se acerquen a la zona aérea designada para las parábolas, lo que les permita acostarse durante los intervalos de alta gravedad y permitir el acceso a las correas para las piernas una vez que comiencen las parábolas.

No aplique fuerzas intensas sobre el cuerpo durante la gravedad reducida, ya que esto podría hacer que el cuerpo ascienda demasiado rápido y de forma algo peligrosa para realizar la demostración del cargador de muestras. Cuando el avión entre en gravedad reducida, utilice la jeringa de muestra para colocar una gota de la mezcla de colorante con cuentas de conteo sobre la punta de un dedo. Para simular una muestra de punción digital, use un material de consumo capilar para recoger la muestra del dedo y cargarla en el cargador capilar.

Lleve la muestra al sistema óptico para su detección. Realice la demostración del mezclador microfluídico montada debajo del microscopio. Mezcle sangre y solución salina en una proporción uno a uno a 1.52345 y seis PSI durante al menos dos parábolas cada una.

Grabación de datos de video sincronizados con otras lecturas. Aquí se muestra metraje real en vuelo de una demostración de mezclado. Inyecte aire en la entrada de suero salino para comprobar si la arquitectura del canal atrapará una burbuja que podría impedir una mezcla óptima. Mezcle.

Los colorantes alimentarios azul y amarillo a 1,52345 y seis PSI durante al menos dos parábolas cada uno. Nuevamente, los datos sincronizados registrados aquí son resultados representativos de dos demostraciones de micromezcladores, tal como se observó mediante una cámara CCD acoplada al panel del microscopio estéreo. El panel A muestra la mezcla de colorantes azul y amarillo en condiciones de microgravedad, y el panel B muestra la mezcla de sangre y solución salina en condiciones de gravedad lunar.

La mezcla se puede evaluar visualmente en cualquier punto del espiral, así como en el canal de salida, en una demostración de detección óptica por bloqueo de células blancas marcadas con fluorescencia durante un vuelo en microgravedad. Las métricas críticas de rendimiento para los datos de citometría de flujo incluyen el coeficiente de variación de las intensidades máximas, las relaciones señal-ruido, las tasas de conteo máximas y la eficiencia de detección, como se muestra aquí. La detección óptica por bloqueo parece relativamente inalterada por la transición desde aproximadamente 1,5 G hasta casi cero G y continúa durante la transición de regreso a 1,5 g.

La detección de microesferas fluorescentes de conteo agregadas a una muestra cargada, tras demostrar el cargador en gravedad lunar, indica que la muestra fue cargada con éxito y alcanzó el bloque óptico para su detección. Tras ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo realizar pruebas del dispositivo y reducir la gravedad a bordo de un vuelo parabólico, y particularmente qué tipos de procedimientos son factibles; una planificación cuidadosa, la selección de componentes y la implementación de pruebas ayudan a garantizar un alto rendimiento en su experiencia.