Name: Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a concentrar adenovirus en muestras de agua mediante filtración con celulosa de vidrio y técnica de concentración secundaria sea light. Este método optimiza la recuperación viral con volúmenes pequeños.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Nicholas J. Ashbolt y al Dr. G. Shay Fout por su revisión del manuscrito.

1. Preparación de Cristalería y alojamientos de los filtros <ol style="margin-left: 40px;"><li> A menos que se indique lo contrario, esterilizar todos los artículos de vidrio, soportes y soluciones de filtrado a 121 ° C durante 15 minutos. Para asegurar la esterilidad, cubrir todas las aberturas o las superficies expuestas, ya sea con papel de aluminio o papel cinta asegurado antes de la esterilización. </li><li> Montar aparato de filtración uniendo carcasa del filtro (47 mm de diámetro) a 1 L matraz Erlenmeyer de brazo lateral. Recoger filtros necesarios: filtros de disco electropositivos / electronegativo 47 mm de diámetro. </li><li> Preparar 1 L de extracto de carne 1,5% (floculación, produce partículas de flóculo cuando el pH de la solución se redujo a 3,5, o no floculante, lo que no hace agregada a pH 3,5), con 0,05 M de glicina, disolviendo 15 g de extracto de carne de vacuno en 1 L de agua desionizada y la adición de 3,75 g de glicina. NOTA: extractos de carne no floculantes requerirán la adición de celita antes de la concentración terciaria. </li><li> Añadir elución polyph sodio aditivoosphate al extracto de carne de vacuno en una concentración de 0,1%. </li><li> Añadir una solución de ácido clorhídrico 1 M, gota a gota, a la mezcla de extracto de carne, solución de pH a pH deseado. Extracto de carne Autoclave durante 15-30 minutos a 121 ° C. </li><li> Mide 0,1 g de fino, medio, o celita partícula grande (para usar con sólo el extracto de carne no floculantes). </li><li> Preparar vacío / aspiración uniendo tubos compatible con erlenmeyer brazo lateral ya la toma de vacío. </li></ol> 2. Preparación de Soluciones y virus Stock <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar 1 L de HCl 1 M. </li><li> Preparar 1 l de 1 M NaOH. </li><li> Prepare la solución de PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 1,47 mM K 2 PO 4 y 4,3 mM NaH 2 PO 4). <ol><li> Ajustar el pH de 1x PBS a 9,0 utilizando 1 M NaOH. </li></ol></li><li> Preparar y diluir de virus a 10 4 -10 5 número más probable (NMP) ml -1 mezclando 1 ml de virus de reserva con 9 ml de PBS (pH7), como se describió previamente 8,13. Conservar a -80 ° C en alícuotas de 1 ml. <ol><li> Esterilizar virus de stock de filtrado jeringa (0,22 m de tamaño de poro) para eliminar los contaminantes potenciales. </li></ol></li><li> Sin cloro del agua corriente <ol><li> Medida 1 L de agua del grifo estéril usando un cilindro graduado estéril y verter en un vaso de precipitados de 2 l que contenía una barra de agitación magnética. </li><li> Añadir 0,7 g de tiosulfato de sodio y mezclar hasta que se disuelven los gránulos. Ajustar el pH del agua del grifo para 7-7,5 si es necesario el uso de HCl 1 M o solución de NaOH 1M. </li><li> Pico virus Deshielo (1 ml) y se añade todo el volumen de pico a 1 l de agua del grifo estéril sin cloro. Mezclar durante 10 min. </li><li> Preparar un blanco método (el agua del grifo sin cloro y sin adenovirus) con cada experimento y el proceso de la misma manera que la muestra de púas. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de Millipore Filtro Aparato <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retirar la cobertura estéril sobre la carcasa del filtro. Asegurarajuste adecuado entre la carcasa del filtro tazón superior y pantalla de filtro inferior para evitar fugas de la muestra durante la filtración. </li><li> Retirar la cobertura estéril de 1 frasco L Erlenmeyer. Asegúrese de que el corcho de la unidad de filtro se ajusta perfectamente en la abertura superior de erlenmeyer, creando un buen sello. </li><li> Retire el tazón superior de la unidad de filtro de malla del filtro inferior y colocar 47 mm disco de filtro electropositivo de lleno sobre la pantalla con pinzas estériles. Adjuntar filtro tazón vivienda a la pantalla inferior y ajustar en su lugar girando en sentido antihorario. </li></ol> 4. Pulse de filtración de agua (Concentración Primaria) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Medir 100 ml de virus se dispararon el agua del grifo usando estéril probeta. </li><li> Vierta 100 ml de virus se dispararon el agua del grifo en la carcasa del filtro que contiene o bien un filtro de 47 mm de vidrio plisado / celulosa o un filtro de disco de fibra nano-alúmina / vidrio. </li><li> Deje que el agua pase lentamente a través del filtro. Aplicar vacío suave para eliminar los residuos restantes oagua del grifo f de la superficie del filtro. </li><li> Si se utiliza el tratamiento con tripsina, añadir 5 ml de tripsina al 0,25% para filtrar superficie e incubar durante 5 minutos. </li><li> Lavar la tripsina de la superficie del filtro utilizando 50 ml de agua desionizada estéril. </li></ol> 5. La elución Virus del filtro <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retire la carcasa del filtro de 2 L frasco Erlenmeyer, y el lugar en frasco de 250 ml brazo lateral. </li><li> Medir 100 ml de extracto de carne utilizando cilindro graduado. Vierta lentamente 100 ml de extracto de carne en caja del filtro. </li><li> Permitir extracto de carne para verter a través del filtro, capturando extracto de carne en una pequeña (250 ml) matraz Erlenmeyer. Aplicar vacío para tirar a través de extracto de carne residual del filtro. </li></ol> 6. Celite Concentración Secundaria <ol style="margin-left: 40px;"><li> Frascos de transferencia que contiene los virus eluidas a una placa de agitación. Añadir estéril barra de agitación magnética y colocar en placa de agitación, mezcla para crear ligero vórtice. </li><li> Añadir 0,1 g de celitepolvo a 100 ml de extracto de carne y permitir de celite para dispersar. Coloque la sonda de pH estéril en extracto de carne. </li><li> Añadir gota a gota HCl 1 M de extracto de carne para alcanzar un pH de 4,0. Permita mezclar lentamente durante 10 min. </li><li> Coloque 47 mm pre-filtro en la carcasa del filtro (como se describió anteriormente) usando un matraz Erlenmeyer de 2 l. </li><li> Verter 100 ml de extracto de carne de vacuno / de la mezcla de celite sobre pre-filtro. Permita que el extracto de carne vierta a través. Aplicar ligero vacío para salir adelante extracto de carne residual del filtro. </li><li> Coloque el metal clip de tubo en el extremo del tubo de salida del filtro. Adjuntar estéril 15 ml tubo de recogida de polipropileno para clip de tubo de metal. Coloque la carcasa del filtro de nuevo en erlenmeyer. </li><li> Añadir 5 ml de tampón 1x PBS, pH 9,0 sobre celite recogida en pre-filtro. </li><li> Permita PBS gotee a través de pre-filtro. Aplicar ligero vacío para salir adelante PBS residual en 15 ml tubo de recogida. </li></ol> 7. Orgánica floculación Concentración Secundaria <ol style="margin-left: 40px;"><li>La transferencia de los vasos que contienen el virus se eluyó a una placa de agitación. Añadir una barra de agitación magnética estéril a 100 ml de extracto de carne y mezclar para crear ligero vórtice. </li><li> Coloque la sonda de pH estéril en extracto de carne. </li><li> Añadir 1 M de HCl gota a gota a extracto de carne y ajustar el pH a 3,5. Mezclar durante 30 min. </li><li> Verter el eluato en 250 ml tubos cónicos de centrífuga y centrifugar a 2500 xg durante 15 min a 4 ºC. </li><li> Verter el sobrenadante con cuidado de no de no perturbar el sedimento. Resuspender el precipitado en 5 ml de 1x PBS, pH 9. </li><li> Centrifugar la suspensión a 4.000 xg durante 10 min a 4 ºC. Verter el sobrenadante y desechar el sedimento. </li><li> Ajustar el pH a 7-7,5, esterilizar por filtración a través de filtro de jeringa de 0,22 micras y congelación a -80 ° C. </li></ol> 8. Viral Nucleic Acid Extracción <ol style="margin-left: 40px;"><li> Extraer ácidos nucleicos virales utilizando un kit comercial apropiado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 9. AdV 40/41 qPCR <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilice cebadores y sondas, así como la mezcla de reacción y perfiles de ciclo térmico según lo publicado 8,13. NOTA: límite estimado de detección del ensayo es de aproximadamente 5 unidades qPCR por reacción. </li><li> Añadir componentes de las mezclas de amplificación de PCR en concentraciones como sigue: Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, 4,5 mM de MgCl 2, mM dNTPs 10, 10 mM cebadores y sonda 1 M y 0,5 l de polimerasa de manera que los volúmenes finales de 45 l se puede añadir al número apropiado de pozos dentro de una placa de 96 pocillos de reacción PCR. </li><li> Cargar 45 l de mezcla de amplificación PCR a cada pocillo apropiado de una de 96 pocillos, la placa de PCR reacción rápida. </li><li> Añadir 5 l de ADN extraído de la muestra a los pocillos apropiados de la placa de PCR. </li><li> Cubra la placa con junta de la tapa resistente al calor, girar la placa para mover cualquier gota a fondo de pozos de la placa de PCR. </li><li> Establecer ciclos de amplificación por PCR como follOWS: 95 ° C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. </li></ol> 10. Análisis de datos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Analizar mediciones por triplicado de las diluciones en serie de 5 veces de las muestras que abarcan 1: 5 a 1: 625 dilución gama con el fin de determinar el número más probable (MPN) de las partículas virales, como se describió previamente 8,13. </li><li> Analizar diluciones en serie de 5 veces de los picos experimentales de adenovirus que abarcan 1: 5 a 1: 15.625 rango de dilución para determinar el número más probable (MPN) de las partículas virales. </li><li> El uso de la calculadora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), ajustar la calculadora para tener en cuenta el tipo de dilución (1: 5 ó 1:10), el número de diluciones realizado, y el número de replicar muestras en serie de dilución. </li><li> Realizar log 10 transformación de los datos, seguido por la normalización a una unidad de volumen (por ejemplo, 1 ml, 100 ml, etc. </em&gt;). Calcular recuperaciones para experimento dado dividiendo la cantidad de partículas virales presentes en la muestra se concentra con el número de partículas virales presentes en los picos experimentales. </li><li> Evaluar el efecto de las diferentes variables experimentales (por ejemplo, diferentes tipos de celite, se rangos de pH, diferentes tipos de filtros y diferentes técnicas de concentración secundarios) sobre recuperaciones AdV mediante la realización de pruebas estadísticas paramétricas o no paramétricas (por ejemplo, prueba t pareada, uno o dos -Way ANOVA) dependiendo de la distribución de los datos y el diseño experimental. </li></ol>

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Filtros electropositivos son útiles en la concentración de virus del agua; sin embargo, estos filtros pueden diferir en su estructura y composición, que a su vez podría alterar su eficacia. Para agravar este problema, las estructuras de la cápside y cargos varían entre las cepas de virus que requieren ser adaptados técnicas de concentración para asegurar una recuperación óptima 15. A través de simples modificaciones de las técnicas de concentración existentes (por ejemplo, los filtros electropositivo...

Virus entéricos humanos son agentes causantes importantes de enfermedades de origen hídrico 1-3, pero generalmente están presentes en números bajos en aguas ambientales contaminadas, por lo que su detección difícil sin concentración. Los procedimientos utilizados para concentrar virus incluyen típicamente una etapa de filtración, seguido de elución de filtro, y la concentración secundaria del eluato filtro. Un procedimiento de filtración común se basa en la utilización de membranas cargadas tales como filtros electropositivos (recientemente revisado en 4,5). Estos filtros se basan en la captura de los virus en suspensión en el agua utilizando interacciones electrostáticas entre la superficie del filtro (con carga positiva) y partículas de virus específicos (con carga negativa). Dos filtros electropositivos que están disponibles comercialmente se basan en esta tecnología, los filtros de vidrio / celulosa y fibra nano-alúmina / vidrio. Los costes de filtro de vidrio / celulosa son hasta 10 veces mayor que la de la fibra nano-alúmina / vidrio, que limitan el uso del vidrio / cefiltros llulose para la vigilancia del virus de rutina. Estudios recientes han concluido diferencias son nominales entre estos dos filtros en la recuperación de los enterovirus desde 6,7 del agua ambiente, lo que justifica el uso de una alternativa de filtro más barato. Otras opciones de filtro, como los filtros electronegativos y de lana de vidrio se han estudiado, sin embargo, o bien requieren el tratamiento previo de las fuentes de agua (filtros electronegativos) o no están disponibles en el mercado (filtros de lana de vidrio). El desarrollo de procedimientos de concentración de virus se ha centrado principalmente en la optimización de las técnicas de concentración primaria (filtros) con el fin de mejorar la recuperación de virus de agua. Sin embargo, los procedimientos de concentración secundarios, que reducen el volumen de eluyente típicamente de 1 L a mililitro volúmenes, también pueden tener un impacto significativo en las recuperaciones de virus 8. Concentración secundaria de virus entéricos típicamente se basa en un agente floculante, tales como algunos tipos de extracto de carne (floccu orgánicamento) o floculación de la leche desnatada 9-12 para eliminar las partículas de virus de las superficies del filtro. Recientemente, otro procedimiento de concentración secundaria utilizando extracto de carne junto con la adición de celita (partículas finas) ha mostrado ser prometedor para la recuperación de adenovirus, enterovirus y norovirus 8,13,14. Obras de concentración Celite bajo principios similares a la del método de floculación orgánica en que las partículas de virus se unen a y se liberan de partículas (floc o de celite) alterando el pH de la solución en suspensión. Las comparaciones entre estas dos técnicas de concentración secundarias han sido evaluadas en la recuperación de adenovirus (ADV) de pinchos tipos 40 y 41 8. Este estudio concluyó que las dos técnicas de concentración secundarias fueron estadísticamente similares en la recuperación de adenovirus. Sin embargo, el método de floculación orgánica requiere una 30 min. de incubación a pH 3,5, mientras que la técnica de celite requiere una incubación más corto (10 min) a pH 4,0. El flocculat orgánicaion también requiere el uso de equipo de laboratorio caro (centrifugadoras) para recoger las partículas de flóculos durante la concentración terciaria, la técnica de celite en contraste utiliza sólo el equipo de laboratorio básico (filtración a vacío) para separar partículas de Celite de la suspensión. Ciertas combinaciones de filtros y técnicas de elución secundarias también pueden afectar a las recuperaciones de virus. Un estudio concluyó que ciertas combinaciones de (filtros electropositivos) primarias y secundarias técnicas de concentración (Celite o floculación orgánica) tuvieron un impacto significativo de la recuperación del adenovirus 13. Estos hallazgos sugieren que se requiere la optimización a fin de recuperar de manera óptima virus diana a partir de una matriz de agua dado al utilizar estas técnicas. La optimización es una pérdida de tiempo y arduo proceso de muchos investigadores evitan activamente desde numerosas variables serán evaluados (tipo de filtro / marca, solución de elución de pH, celita / floculación orgánica). Para este study, se desarrolló un procedimiento para identificar las condiciones óptimas para la concentración de virus a partir de agua usando cepas de adenovirus humano de púas 40 y 41. Presumiblemente, ya que cada tipo virus muestra una morfología de la cápside único y carga específica de la cápside, pueden necesitar ser optimizado para cada virus protocolos de concentración apuntar a fin de alcanzar la recuperación viral óptima. Este estudio proporciona un enfoque para AdV 40 y 41 de concentración por: 1) la evaluación de la recuperación de virus en el agua del grifo, usando discos de filtro electropositivos seguido por 2) evaluación de un método de floculación orgánica establecido frente a la técnica de celite como una concentración secundaria, y 3) evaluación de tampones de elución para la concentración terciaria.

<table><tbody><tr><td>Adenovirus 40 culata</td><td>ATCC</td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus 41 culata</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>Tiosulfato de sodio</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 mm</td><td>Argónido</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 mm</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>AP-20 Prefiltro 47 mm</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>AP2004700</tr><tr><td>Glicina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Polifosfato de Sodio</td><td>Acros Organics</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Clorhídrico</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>BBL Extracto de Carne</td><td>BD Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>Difco Extracto de Carne de Vacuno</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 Sistema de PCR en tiempo real</td><td>ABI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Carcasa de filtro de acero inoxidable</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de ADN sanguíneo</td><td>XX2004720 Qiagen&nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr>Calculadora <td></td><td></td><td>de MPN de la EPA</td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del agua

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

La concentración de virus a pequeña escala (volúmenes de muestra de 1 a 10 L, aquí simulada con muestras de agua enriquecidas de 100 ml) es una forma eficiente y rentable de identificar los parámetros óptimos para la concentración de virus. Los virus pueden concentrarse a partir de agua mediante filtración (electropositiva, electronegativa, lana de vidrio o exclusión de tamaño), seguida de una concentración secundaria con extracto de carne de vacuno para liberar los virus de las superficies del filtro y, por último, una concentración terciaria que da como resultado un concentrado de virus de 5-30 ml de volumen. Con el fin de identificar los procedimientos de concentración óptima, se evaluaron dos filtros electropositivos diferentes (un filtro de vidrio/celulosa [1MDS] y un filtro de nano-alúmina/vidrio [NanoCeram]), así como diferentes técnicas de concentración secundaria; La técnica de Celita donde se evaluaron tres tamaños de partícula de Celita diferentes (fina, mediana y grande) siguió comparando esta técnica con la del método de floculación orgánica establecido. También se evaluaron varios aditivos de elución por su capacidad para mejorar la liberación de partículas de adenovirus (AdV) de las superficies de los filtros. La élite de partículas finas recuperó niveles de AdV40 y 41 similares a los del método de floculación orgánica establecido cuando se agregaron picos virales durante la concentración secundaria. El filtro de vidrio/celulosa recuperó niveles más altos de AdV40 y 41, en comparación con los de un filtro de nano-alúmina/fibra de vidrio. Aunque no fue estadísticamente significativo, la adición de un eluyente de extracto de carne de vacuno modificado con polifosfato de sodio al 0,1% recuperó un 10% más de partículas de AdV en comparación con el extracto de carne de vacuno no modificado.

<html> Selección de Celite Tres tipos diferentes de celita fueron probados antes de la selección de la mejor variante de realización. Celites con bien a las partículas de tamaño mediano producen los más altos recuperaciones de adenovirus. El uso de celites más grandes resultó en menores recuperaciones tanto para AdV40 y 41 (rango de 32% -100%) (Figura 1). Promedio de recuperaciones de adenovirus 40 eran 144% ± 52% (muy bien), 115% ± 28% (medio) y 82% ± 53% celites (grande) de...

Se desarrolló un enfoque para identificar las condiciones óptimas de concentración viral para muestras de agua de pequeño volumen utilizando picos de adenovirus humano. Las técnicas descritas aquí se utilizan para identificar parámetros de concentración para otros objetivos virales y se aplican a la experimentación de concentración viral a gran escala.

Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

El objetivo general del siguiente experimento es optimizar la recuperación de virus a partir del agua mediante una técnica a pequeña escala originalmente diseñada para optimizar la concentración de virus. Se encontró que un filtro de celulosa de vidrio era el mejor filtro electropositivo para concentrar adenovirus a partir del agua. Para la elución secundaria, una técnica de concentración secundaria con celite resultó ser la más eficaz para eluir adenovirus de las superficies del filtro. La técnica resultante permite recuperar la mayor cantidad de adenovirus a partir de agua del grifo, basándose en los porcentajes de recuperación más altos observados entre todas las combinaciones de filtros y eluciones evaluadas.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la concentración volumétrica a gran escala es que utiliza volúmenes de muestra más pequeños, lo que permite evaluar rápidamente y con facilidad una gran variedad de variables de concentración. Al prepararse para este protocolo, tenga todas las soluciones requeridas listas, incluida la solución viral filtrada de 0,22 micrones a 10-100.000 MPN por mililitro. Comience midiendo un litro de agua del grifo estéril. Trasváselo a un vaso de precipitados de dos litros con una barra magnética de agitación. Mientras agita el agua, añada 0,7 gramos de tiosulfato de sodio y deje que se disuelva completamente. A continuación, ajuste el pH a un valor entre 7 y 7,5 agregando gota a gota soluciones stock de ácido o base 1 molar. Luego, agregue el virus al agua. Incorpore un mililitro completo de la solución de virus preparada. Cubra el matraz con una envoltura estéril y deje que el virus se mezcle con el agua durante 10 minutos.Mientras tanto, prepare el filtro Millipore. Primero, desenróllelo de su envoltorio y asegúrese de que quede bien ajustado entre la copa superior y la malla inferior. A continuación, verifique que el material de corcho del filtro encaje firmemente en el borde de un matraz de un litro con salida lateral. Ahora retire la copa superior del filtro y, con pinzas, coloque un disco de filtro electropositivo de 47 milímetros exactamente en el centro de la malla filtrante. Luego vuelva a colocar la copa y fíjela mediante un giro en sentido antihorario.Mida 100 mililitros de agua del grifo enriquecida utilizando un cilindro estéril. Luego transfiera el agua al alojamiento del filtro preparado sobre el matraz de dos litros. El disco electropositivo del filtro puede ser de vidrio-celulosa plegado o de fibra de vidrio nanoalúmina. Se puede utilizar un vacío suave para hacer pasar el agua residual a través del filtro.Ahora, traslade el alojamiento del filtro a un matraz de brazo lateral de 250 mililitros. Mida 100 mililitros de extracto de carne y viértalos lentamente sobre el filtro. Permita que el extracto pase lentamente y utilice un vacío suave para extraer el residuo.Luego continúe con cualquiera de las dos opciones de concentración secundaria. Para concentrar el virus utilizando celite, transfiera el contenido del matraz de 250 mililitros, que contiene el virus, a una placa agitadora. Con una barra magnética, cree un pequeño vórtice. A continuación, agregue 0,1 gramos de polvo de celite a 100 mililitros de extracto de carne. Deje que el celite se disperse y prepárese para ajustar el pH de la solución. Mediante adiciones gota a gota de ácido clorhídrico 0,1 molar, reduzca el pH a 4,0.Luego, deje que la solución se mezcle durante 10 minutos. Mientras se mezcla, coloque su prefiltro de 47 mililitros en un matraz de dos litros. A continuación, vierta 100 mililitros de la mezcla de extracto de carne y celite a través del prefiltro. Puede utilizarse un ligero vacío para finalizar. A continuación, coloque una pinza metálica para tubo en el extremo del pico de un soporte de filtro. Al fijar la pinza, acople un tubo colector estéril de 15 mililitros de polipropileno y luego vuelva a armar el filtro sobre el matraz. Ahora, eluya el virus de las partículas de Celite en cinco mililitros de PBS 1X a pH 9. Permita que la mayor parte del PBS gotee por gravedad hacia el tubo de 15 mililitros y extraiga el residuo mediante un ligero vacío. Para concentrar el virus mediante floculación orgánica, transfiera el contenido del matraz de 250 mililitros que contiene el virus a una placa agitadora. Utilizando una barra imantada, cree un pequeño vórtice. Ajuste el pH de la solución a 3,5 mediante adiciones gota a gota de ácido clorhídrico 1 M. Luego, deje agitar la mezcla durante media hora. Posteriormente, transfiera la solución a un tubo cónico estéril de centrífuga de 250 mililitros. Centrifugue la solución a 2.500 g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, tenga cuidado de no perturbar el precipitado al manipular los tubos. Decante cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el precipitado en cinco mililitros de PBS pH 9. Asegúrese de que el precipitado se haya disuelto completamente. Luego, centrifugue la suspensión a 4.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Ahora, recoja el sobrenadante, que contiene el virus concentrado. El precipitado puede descartarse.Al optimizar este protocolo, se compararon tres tipos de celite. El celite de mayor tamaño produjo recuperaciones más bajas tanto de ADV 40 como de ADV 41.Se probó la elución del filtro a un pH entre 7,5 y 12 para determinar cuál sería el más eficaz para recolectar partículas de ADV a partir de los filtros. La recuperación más alta se obtuvo con un filtro de celulosa vítrea combinado con extracto de carne a pH 10 y con celite. El resultado fue el mismo con ADV 40 y ADV 41.El extracto de carne a pH 10 resultó ser superior a la floculación orgánica.El método optimizado se comparó con la adición de un punto 25 % de tripsina y con la suplementación del extracto de carne con 0,1 % de polifosfato de sodio. Ninguno de los tratamientos mejoró significativamente la recuperación del ADV. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 45 minutos si se lleva a cabo correctamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.

Lentivirus de producción

La tasa de rotación de los virus en los sistemas marinos y de agua dulce puede ser estimado por una reducción de la recurrencia y la técnica. Los datos permiten a los investigadores a deducir las tasas de mortalidad microbiana mediada por el virus en los sistemas acuáticos.

Estimación de las tasas de producción de virus en los sistemas acuáticos

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