Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua
3 de febrero de 2015
Se desarrolló un enfoque para identificar las condiciones óptimas de concentración viral para muestras de agua de pequeño volumen utilizando picos de adenovirus humano. Las técnicas descritas aquí se utilizan para identificar parámetros de concentración para otros objetivos virales y se aplican a la experimentación de concentración viral a gran escala.
El objetivo general del siguiente experimento es optimizar la recuperación de virus a partir del agua mediante una técnica a pequeña escala originalmente diseñada para optimizar la concentración de virus. Se encontró que un filtro de celulosa de vidrio era el mejor filtro electropositivo para concentrar adenovirus a partir del agua. Para la elución secundaria, una técnica de concentración secundaria con celite resultó ser la más eficaz para eluir adenovirus de las superficies del filtro. La técnica resultante permite recuperar la mayor cantidad de adenovirus a partir de agua del grifo, basándose en los porcentajes de recuperación más altos observados entre todas las combinaciones de filtros y eluciones evaluadas.
La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la concentración volumétrica a gran escala es que utiliza volúmenes de muestra más pequeños, lo que permite evaluar rápidamente y con facilidad una gran variedad de variables de concentración.
Al prepararse para este protocolo, tenga todas las soluciones requeridas listas, incluida la solución viral filtrada de 0,22 micrones a 10-100.000 MPN por mililitro.
Comience midiendo un litro de agua del grifo estéril. Trasváselo a un vaso de precipitados de dos litros con una barra magnética de agitación. Mientras agita el agua, añada 0,7 gramos de tiosulfato de sodio y deje que se disuelva completamente. A continuación, ajuste el pH a un valor entre 7 y 7,5 agregando gota a gota soluciones stock de ácido o base 1 molar. Luego, agregue el virus al agua. Incorpore un mililitro completo de la solución de virus preparada. Cubra el matraz con una envoltura estéril y deje que el virus se mezcle con el agua durante 10 minutos.
Mientras tanto, prepare el filtro Millipore. Primero, desenróllelo de su envoltorio y asegúrese de que quede bien ajustado entre la copa superior y la malla inferior. A continuación, verifique que el material de corcho del filtro encaje firmemente en el borde de un matraz de un litro con salida lateral. Ahora retire la copa superior del filtro y, con pinzas, coloque un disco de filtro electropositivo de 47 milímetros exactamente en el centro de la malla filtrante. Luego vuelva a colocar la copa y fíjela mediante un giro en sentido antihorario.
Mida 100 mililitros de agua del grifo enriquecida utilizando un cilindro estéril. Luego transfiera el agua al alojamiento del filtro preparado sobre el matraz de dos litros. El disco electropositivo del filtro puede ser de vidrio-celulosa plegado o de fibra de vidrio nanoalúmina. Se puede utilizar un vacío suave para hacer pasar el agua residual a través del filtro.
Ahora, traslade el alojamiento del filtro a un matraz de brazo lateral de 250 mililitros. Mida 100 mililitros de extracto de carne y viértalos lentamente sobre el filtro. Permita que el extracto pase lentamente y utilice un vacío suave para extraer el residuo.
Luego continúe con cualquiera de las dos opciones de concentración secundaria.
Para concentrar el virus utilizando celite, transfiera el contenido del matraz de 250 mililitros, que contiene el virus, a una placa agitadora. Con una barra magnética, cree un pequeño vórtice. A continuación, agregue 0,1 gramos de polvo de celite a 100 mililitros de extracto de carne. Deje que el celite se disperse y prepárese para ajustar el pH de la solución. Mediante adiciones gota a gota de ácido clorhídrico 0,1 molar, reduzca el pH a 4,0.
Luego, deje que la solución se mezcle durante 10 minutos. Mientras se mezcla, coloque su prefiltro de 47 mililitros en un matraz de dos litros. A continuación, vierta 100 mililitros de la mezcla de extracto de carne y celite a través del prefiltro. Puede utilizarse un ligero vacío para finalizar.
A continuación, coloque una pinza metálica para tubo en el extremo del pico de un soporte de filtro. Al fijar la pinza, acople un tubo colector estéril de 15 mililitros de polipropileno y luego vuelva a armar el filtro sobre el matraz.
Ahora, eluya el virus de las partículas de Celite en cinco mililitros de PBS 1X a pH 9. Permita que la mayor parte del PBS gotee por gravedad hacia el tubo de 15 mililitros y extraiga el residuo mediante un ligero vacío. Para concentrar el virus mediante floculación orgánica, transfiera el contenido del matraz de 250 mililitros que contiene el virus a una placa agitadora. Utilizando una barra imantada, cree un pequeño vórtice. Ajuste el pH de la solución a 3,5 mediante adiciones gota a gota de ácido clorhídrico 1 M. Luego, deje agitar la mezcla durante media hora. Posteriormente, transfiera la solución a un tubo cónico estéril de centrífuga de 250 mililitros. Centrifugue la solución a 2.500 g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, tenga cuidado de no perturbar el precipitado al manipular los tubos. Decante cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el precipitado en cinco mililitros de PBS pH 9. Asegúrese de que el precipitado se haya disuelto completamente. Luego, centrifugue la suspensión a 4.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Ahora, recoja el sobrenadante, que contiene el virus concentrado. El precipitado puede descartarse.
Al optimizar este protocolo, se compararon tres tipos de celite. El celite de mayor tamaño produjo recuperaciones más bajas tanto de ADV 40 como de ADV 41.
Se probó la elución del filtro a un pH entre 7,5 y 12 para determinar cuál sería el más eficaz para recolectar partículas de ADV a partir de los filtros. La recuperación más alta se obtuvo con un filtro de celulosa vítrea combinado con extracto de carne a pH 10 y con celite. El resultado fue el mismo con ADV 40 y ADV 41.
El extracto de carne a pH 10 resultó ser superior a la floculación orgánica.
El método optimizado se comparó con la adición de un punto 25 % de tripsina y con la suplementación del extracto de carne con 0,1 % de polifosfato de sodio. Ninguno de los tratamientos mejoró significativamente la recuperación del ADV.
Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 45 minutos si se lleva a cabo correctamente.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para optimizar la recuperación de virus a partir de muestras de agua de pequeño volumen, centrándose específicamente en el adenovirus humano. El enfoque utiliza un filtro de celulosa de vidrio y una técnica de concentración secundaria para mejorar las tasas de recuperación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Ciencias ambientales
- Calidad del agua
Antecedentes
- La concentración de virus a partir de muestras de agua es fundamental para la vigilancia ambiental.
- Los métodos existentes a menudo requieren grandes volúmenes de muestra, lo que limita su eficiencia.
- La optimización de las técnicas de recuperación puede mejorar la detección y el análisis de patógenos virales.
- El adenovirus humano sirve como modelo para probar métodos de concentración.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica para identificar condiciones óptimas de concentración viral.
- Evaluar diversas combinaciones de filtros y elución para la recuperación de adenovirus.
- Facilitar la evaluación rápida de variables de concentración utilizando volúmenes pequeños de muestra.
Métodos Utilizados
- Uso de un filtro de celulosa de vidrio para la concentración de adenovirus.
- Aplicación de una técnica secundaria de concentración con luz marina para la elución.
- Comparación de diferentes combinaciones de filtros y elución.
- Evaluación de las tasas de recuperación a partir de muestras de agua del grifo.
Resultados principales
- El filtro de celulosa de vidrio demostró las tasas más altas de recuperación para el adenovirus.
- La técnica secundaria de concentración Sea Light eluyó eficazmente el virus.
- Volutmenes pequeños de muestra permitieron una evaluación rápida de múltiples parámetros de concentración.
- El método superó a las técnicas tradicionales de concentración de volúmenes grandes.
Conclusiones
- Esta técnica proporciona un medio más eficiente para recuperar virus a partir de muestras de agua.
- Permite la prueba rápida de diversas condiciones de concentración.
- El enfoque puede adaptarse para otros objetivos virales además del adenovirus.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La optimización del aislamiento de virus a partir de muestras de agua de pequeño volumen permite la detección rápida de parámetros de concentración, lo que apoya el desarrollo inicial de ensayos en virología ambiental. El método ofrece un enfoque escalable y rentable para evaluar combinaciones de filtros y elución, reduciendo el consumo de recursos en los flujos de trabajo de detección de patógenos en fases preclínicas. Al identificar las condiciones óptimas para la concentración de adenovirus, la técnica mejora la confianza predictiva en aplicaciones posteriores de detección.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la eficiencia de recuperación viral en diferentes tipos de filtros y condiciones de elución para apoyar la validación de objetivos en la detección de patógenos ambientales.
- Valor operativo: Utiliza volúmenes pequeños de muestra (1-10 L simulados con 100 mL) para probar rápidamente múltiples variables, acelerando la generación de hipótesis para la optimización de la concentración de virus.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de recuperación (porcentaje de recuperación de AdV40 y AdV41) para informar la estandarización y reproducibilidad de ensayos en plataformas de detección viral.
- Valor operativo: Prepara sistemas biológicos validados (virus concentrado en 5-30 mL) para aplicaciones posteriores, como ensayos de infectividad o análisis genómico.
- Valor estratégico: Facilita la preparación para cribado al permitir la comparación rápida de filtros electropositivos (vidrio/celulosa frente a nanoalúmina/vidrio) y técnicas secundarias de concentración (celite frente a floculación orgánica).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Utiliza el adenovirus humano como un modelo relevante para evaluar el rendimiento de métodos de concentración, apoyando el desarrollo traslacional de biomarcadores para patógenos transmitidos por el agua.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al entregar virus concentrado adecuado para caracterización adicional.
- Valor estratégico: Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la identificación de combinaciones filtro-elución con alta recuperación (filtro de celulosa vítreo con extracto de carne a pH 10 y luz marina).
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de candidatos en la detección de patógenos ambientales, permitiendo una rápida iteración sobre las variables de concentración antes de escalar a volúmenes mayores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre variables de filtración y elución para esclarecer los mecanismos de liberación del virus de las superficies y optimizar la eficiencia de recuperación.
- Detección: Proporciona concentrados de virus listos para ensayos (5-30 mL) con resultados cuantitativos (porcentaje de recuperación) para comparar condiciones entre diferentes tipos de filtros y aditivos de elución.
- Análisis: Permite la medición de variables dependientes (recuperación viral mediante qPCR o infectividad) para evaluar estadísticamente el impacto de variables independientes (tipo de filtro, pH de elución, tamaño de partículas de celita).
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar adenovirus concentrado adecuado para validación posterior en cultivos celulares o modelos animales.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para optimizar la concentración de virus frente a múltiples objetivos virales más allá del adenovirus, reduciendo el desarrollo redundante de métodos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los métodos de recuperación de virus al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la evaluación sistemática de los parámetros de filtración y elución.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad mediante pasos definidos (elución con extracto de carne, concentración secundaria con luz de mar, ajuste de pH a 4,0) y puntos finales cuantificables (porcentaje de recuperación de AdV40 y AdV41).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar en el desarrollo de ensayos de detección de patógenos al identificar las condiciones óptimas (filtro de celulosa de vidrio, extracto de carne a pH 10, luz de mar) con la mayor recuperación observada.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo de métodos de concentración para programas de monitoreo ambiental, reduciendo los fracasos en etapas avanzadas de los flujos de trabajo de detección de patógenos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en virología, técnicas de filtración y manipulación precisa de líquidos para la adición de virus, el ensamblaje de filtros y los pasos de centrifugación.
- Depende de instrumentación que incluye sistemas de filtración al vacío, placas agitadoras, medidores de pH, centrífugas (capaces de 2.500 G y 4.000 G) y tubos estériles para conexión y recolección.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de soluciones (extracto de carne, celite, HCl, PBS) y en los controles ambientales (centrifugación a 4 °C, condiciones estériles) para garantizar la reproducibilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes tipos de virus o matrices de agua, ya que la eficiencia de recuperación puede variar según las propiedades virales (por ejemplo, serotipo de adenovirus) y la composición de la muestra (agua del grifo frente a fuentes ambientales).
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de técnica aséptica durante la manipulación de virus y la posible variabilidad en el rendimiento entre diferentes lotes de filtros, lo cual podría afectar la consistencia de la elución.
