Cell Analyzer basados ​​en impedancia Real-Time como una herramienta para delinear vías moleculares implicadas en la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una técnica basada en impedancia para seguir la citoprotección en tiempo real de una línea celular neuronal para delinear la participación de las vías de segundo mensajero en el proceso de protección. Esto se logra cultivando primero una línea celular neuronal en condiciones proliferativas en un analizador celular en tiempo real basado en impedancia. En el segundo paso, potencialmente relevante.

Las vías de segundo mensajero se inhiben farmacológicamente antes de someter la línea celular a tratamientos neuroprotectores. A continuación, se sigue el estado de la línea celular neuronal utilizando un analizador celular en tiempo real en las diferentes condiciones experimentales. En última instancia, el análisis estadístico se puede utilizar para evaluar la participación en tiempo real de las vías de segundo mensajero en la citoprotección de las células neuronales.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ensayos de neurotoxicidad de punto final, es que permite evaluar la protección y la toxicidad de Tito en líneas celulares neuronales en tiempo real y en condiciones libres de etiquetas. Este método puede ayudar a responder preguntas rápidas en el campo de la neurobiología molecular al contribuir a una evaluación más eficiente de los posibles compuestos neuroprotectores in vitro, y al proporcionar información sobre los mecanismos moleculares involucrados en la neuroprotección. Por ejemplo, en este caso, las células S-K-N-S-H del neuroblastoma humano se utilizan con PBS y luego tripsina en las células durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Eliminar la tripsina por centrifugación y luego resuspender las células en 10 mililitros de medio de proliferación. Después de contar las células, diluya las células a una concentración de tres veces 10 a la quinta célula por mililitro con más medio de proliferación, luego equilibre cada pocillo de un EPL 96 con 100 microlitros de medio de proliferación en una campana de cultivo de tejidos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, inserte el EPL 96 en una estación de análisis de células en tiempo real en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados e inicie el software del analizador de células en tiempo real.

A continuación, en la página de diseño, seleccione los pocillos adecuados para el experimento e introduzca el tipo de celda, el número de célula y los nombres y concentraciones de los compuestos químicos de interés en los cuadros de edición de la página del software de programación, ya que el primer paso está preestablecido. Para la medición en segundo plano, seleccione agregar un paso y establezca el paso dos para medir el índice de celda cada 15 minutos durante 96 horas. A continuación, haga clic en iniciar para iniciar el paso uno y medir la impedancia de fondo de los medios.

Ahora retire el EPL y agregue 100 microlitros de la suspensión de células de neuroblastoma. En cada pocillo experimental, agite suavemente el EPL 96 para cubrir uniformemente los pocillos, y luego incube la placa a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejidos para permitir que las células se asienten después de media hora, cargue el EPL 96 nuevamente en la estación de análisis de células en tiempo real y comience el paso dos. Para supervisar los valores del índice de celda a lo largo del experimento, vea las curvas de celda en la página de trazado y los datos de índice de celda sin procesar en la página de índice de celda 24 horas.

Después de colocar las células, detenga el experimento y retire la placa de la estación analizadora de células en tiempo real. Dispensar un microlitro de los inhibidores recién diluidos de interés en cada pocillo y, después de recargar el EPL 96, reanudar las mediciones del índice celular experimental después de 30 minutos, volver a pausar el experimento y retirar rápida pero cuidadosamente el medio de proliferación de cada pocillo, dirigiendo el borde de la punta de la pipeta a la esquina del pocillo para evitar interrumpir la capa celular adherente. A continuación, añada inmediatamente 200 microlitros de medio de privación sérica a cada pocillo, un microlitro de los compuestos neuroprotectores recién diluidos de interés y un microlitro de los inhibidores de la vía del segundo mensajero de interés para los pocillos apropiados.

Luego continúe con las mediciones del índice de celda cada 15 minutos durante 96 horas como se estableció anteriormente para analizar los datos, ahora seleccione el índice de celda normalizado y las funciones de tiempo normalizado en la página de trazado para normalizar el índice de celda hasta el último punto de tiempo antes de las modificaciones en el cultivo celular. Para reducir la variación entre los experimentos. Resalte los pozos en la página de trazado para las condiciones experimentales de interés y haga clic en agregar para trazar las curvas de índice de celda normalizadas.

A continuación, exporte los datos experimentales de todos los puntos de tiempo del índice de celdas de la página del software de índice de células a un archivo de hoja de cálculo para el análisis estadístico de las diferencias en los valores del índice de células en las diferentes condiciones de tratamiento en puntos de tiempo específicos. Seleccione los valores del índice de celda en sus respectivos puntos de tiempo dentro del archivo de hoja de cálculo exportado. Finalmente, analice los valores del índice celular para los puntos de tiempo seleccionados con un análisis de varianza de una o dos vías, seguido de una prueba post hoc Utilizando software estadístico los estímulos neurotóxicos para las células conducen a una disminución en los valores del índice celular aquí, un aumento en el índice celular cuando las células S-K-N-S-H se cultivan en medio de proliferación y la caída del índice celular seguida de una estabilización en los nuevos niveles más bajos después de En estos gráficos se muestra el cambio de las células a un medio de privación sérica.

Se puede observar el efecto neuroprotector de dos agonistas del receptor de serotonina dos a cinco micromolares, DOI y 20 micromolares IDE añadidos cuando las células fueron alimentadas con privación sérica, medio. Una cuestión importante en los estudios de neuroprotección es si un efecto sobre la proliferación celular contribuye al efecto compuesto observado sobre la supervivencia celular. En este gráfico, se muestra la falta de efecto del tratamiento con DOI de cinco micromolares sobre la proliferación de células SKNS, lo que sugiere que la proliferación no contribuye al efecto neuroprotector observado.

En este gráfico final se puede observar el efecto del tratamiento con 10 micromolares del inhibidor de tres quinasas iniciales de fosfatidil LY 2 9 4 0 0 2 sobre la supervivencia celular y el efecto neuroprotector del DOI sobre las células SK NSH privadas de suero. El LY 2 9 4 0 0 2 previno el efecto neuroprotector del DOI durante la etapa de privación sérica, pero también mostró algún efecto tóxico propio. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo seguir la protección de CTO en una línea celular neuronal utilizando un analizador de células en tiempo real y delinear la participación de las vías de segundo mensajero en la protección.