Cell Analyzer basados ​​en impedancia Real-Time como una herramienta para delinear vías moleculares implicadas en la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una técnica basada en la impedancia para seguir en tiempo real la citoprotección de una línea celular neuronal y delinear la participación de las vías de mensajería secundaria en el proceso de protección. Esto se logra primero cultivando una línea celular neuronal en condiciones proliferativas en un analizador celular en tiempo real basado en impedancia. En el segundo paso, potencialmente relevante.

Las vías de mensajeros secundarios se inhiben farmacológicamente antes de someter la línea celular a tratamientos neuroprotectores. A continuación, se monitorea el estado de la línea celular neuronal mediante un analizador celular en tiempo real bajo diferentes condiciones experimentales. Finalmente, se puede utilizar un análisis estadístico para evaluar la participación en tiempo real de las vías de mensajeros secundarios en la citoprotección de las células neuronales.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los ensayos de neurotoxicidad en punto final es que permite evaluar la protección Tito y la toxicidad tito en líneas celulares neuronales en tiempo real y en condiciones libres de marcado. Este método puede ayudar a responder rápidamente preguntas en el campo de la neurobiología molecular al contribuir a una evaluación más de alto rendimiento de compuestos neuroprotectores potenciales in vitro, y al proporcionar información sobre los mecanismos moleculares implicados en la neuroprotección. Comience por lavar una capa de línea celular neuronal adherente. Por ejemplo, aquí se utilizan células de neuroblastoma humano S-K-N-S-H con PBS y luego se trypsinizan las células durante cinco minutos a 37 grados Celsius.

Elimine la tripsina mediante centrifugación y luego resuspenda las células en 10 mililitros de medio de proliferación. Después de contar las células, dilúyalas hasta una concentración de tres veces 10 a la quinta células por mililitro con más medio de proliferación, luego equilibre cada pocillo de una placa EPL 96 con 100 microlitros de medio de proliferación en una cabina de cultivo celular a temperatura ambiente. Tras 30 minutos, inserte la placa EPL 96 en una estación de analizador celular en tiempo real dentro de una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius e inicie el software del analizador celular en tiempo real.

Luego, en la página de diseño, seleccione los pocillos adecuados para el experimento e ingrese el tipo celular, el número de células y los nombres y concentraciones de los compuestos químicos de interés en los cuadros de edición de la página del software de programación, ya que el paso uno está preestablecido. Para la medición del fondo, seleccione agregar un paso y configure el paso dos para medir el índice celular cada 15 minutos durante 96 horas. A continuación, haga clic en iniciar para comenzar el paso uno y medir la impedancia de fondo del medio.

Ahora retire el EPL y agregue 100 microlitros de la suspensión de células de neuroblastoma. A cada pocillo experimental, agite suavemente el EPL 96 para recubrir uniformemente los pocillos, luego incube la placa a temperatura ambiente en la cabina de cultivo celular para permitir que las células se asienten. Pasada media hora, coloque nuevamente el EPL 96 en la estación del analizador celular en tiempo real e inicie el paso dos. Para monitorear los valores del índice celular durante todo el experimento, visualice las curvas celulares en la página de gráficos y los datos brutos del índice celular en la página del índice celular a las 24 horas.

Después de sembrar las células, detenga el experimento y retire la placa de la estación analizadora de células en tiempo real. Añada un microlitro del inhibidor de interés recién diluido en cada pocillo y, tras recargar el EPL 96, reanude las mediciones del índice celular experimental tras 30 minutos. Luego detenga nuevamente el experimento y retire rápidamente pero con cuidado el medio de proliferación de cada pocillo, dirigiendo el borde de la punta de la pipeta hacia la esquina del pocillo para evitar alterar la capa celular adherida. A continuación, añada inmediatamente 200 microlitros de medio de privación de suero a cada pocillo, un microlitro de los compuestos neuroprotectores de interés recién diluidos y un microlitro de los inhibidores de interés de la vía del mensajero secundario a los pocillos correspondientes.

Luego, continúe con las mediciones del índice celular cada 15 minutos durante 96 horas según se haya configurado previamente para analizar los datos. Ahora, seleccione las funciones de índice celular normalizado y tiempo normalizado en la página de gráficos para normalizar el índice celular al último punto de tiempo antes de las modificaciones en el cultivo celular. Para reducir la variación entre los experimentos, resalte los pocillos en la página de gráficos correspondientes a las condiciones experimentales de interés y haga clic en agregar para trazar las curvas del índice celular normalizado.

Luego, exporte los datos experimentales de todos los puntos temporales del índice celular desde la página del software de índice celular a un archivo de hoja de cálculo para el análisis estadístico de las diferencias en los valores del índice celular bajo distintas condiciones de tratamiento en puntos temporales específicos. Seleccione los valores del índice celular en sus respectivos puntos temporales dentro del archivo de hoja de cálculo exportado. Finalmente, analice los valores del índice celular para los puntos temporales seleccionados mediante un análisis de varianza unifactorial o bifactorial, seguido de una prueba post hoc utilizando software estadístico. Los estímulos neurotóxicos aplicados a las células provocan una disminución en los valores del índice celular; aquí se observa un aumento del índice celular cuando las células S-K-N-S-H se cultivan en medio de proliferación, y la caída del índice celular seguida de una estabilización en nuevos niveles más bajos tras cambiar las células a medio con privación de suero se muestra en estos gráficos.

Se puede observar el efecto neuroprotector de dos agonistas del receptor de serotonina 2A, cinco micromolar, DOI y 20 micromolar, IDE, añadidos cuando las células fueron alimentadas con medio de privación de suero. Una pregunta importante en los estudios de neuroprotección es si un efecto sobre la proliferación celular contribuye al efecto del compuesto observado sobre la supervivencia celular. En esta gráfica, se muestra la ausencia de efecto del tratamiento con cinco micromolar de DOI sobre la proliferación de células SKNS, lo que sugiere que la proliferación no contribuye al efecto neuroprotector observado.

En este gráfico final, se puede observar el efecto del tratamiento con 10 micromolar del inhibidor de la fosfatidilinoicial tres quinasas LY 2 9 4 0 0 2 sobre la supervivencia celular y el efecto neuroprotector de DOI en células SK-N-SH privadas de suero. LY 2 9 4 0 0 2 evitó el efecto neuroprotector de DOI durante la etapa de privación de suero, pero también mostró un cierto efecto tóxico propio. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seguir la protección frente a CTO en una línea celular neuronal utilizando un analizador celular en tiempo real, y de cómo delimitar la participación de las vías de mensajeros secundarios en la protección.