Grabaciones simultáneas a largo plazo en dos etapas de procesamiento neuronal en Behaving abejas

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el recubrimiento olfativo y la formación de memoria utilizando el acceso a largo plazo a dos etapas de procesamiento neuronal independientes dentro de las abejas melíferas que se comportan. Esto se logra ensamblando primero electrodos multicanal de bajo costo a partir de microcables de cobre aislados y soportes hechos a medida. El siguiente paso es preparar una abeja viva quitando una sección de su cápsula principal para insertar dos electrodos tratados con un tinte fluorescente en el cerebro expuesto.

El tercer paso es registrar las dos neuropíldoras o tractos independientes en la vía olfativa, mientras se estimula con olores florales y feromonas. Más tarde, después de diseccionar el cerebro, se inyecta un trazador fluorescente diferente en el lóbulo de la antena para rellenar las neuronas objetivo. A continuación, se visualizan las pistas de relleno y los trazados de electrodos para producir una reconstrucción tridimensional de la arquitectura neuronal.

En última instancia, las relaciones en el recubrimiento de olor entre las dos poblaciones de neuronas en diferentes niveles de procesamiento, como el lóbulo de la antena y el cuerpo del hongo, se pueden comprender mejor utilizando estas técnicas. Por lo tanto, las principales ventajas de esta técnica de los métodos existentes es que nuestros electrodos multicanal son muy pequeños y se pueden usar en combinación, lo que significa que podemos grabar simultáneamente en diferentes áreas del cerebro después de estar anclados. Los alambres flexibles permiten una recuperación estable durante varias horas en animales que se comportan.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuropatología, como la comprensión de cómo los animales reciben, perciben y, finalmente, calculan las fábricas de olf en la vida de su entorno. Esta técnica de doble registro puede proporcionar información sobre el mecanismo subyacente de la codificación de los olores y las redes neuronales en general. También se puede aplicar a otros organismos modelo en invertebrados o afección y neurobiología.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita mucho entrenamiento para identificar las neuronas de las abejas melíferas utilizando solo puntos de referencia morfológicos como el lóbulo interno o el lóbulo vertical del cuerpo del hongo. Para este protocolo, construya un adaptador de electrodo que se adapte a una placa de interfaz de electrodo estándar. Primero suelde tres piezas cortas de cables aislados a un conector de 18 pines.

A continuación, corte un trozo de placa de plexiglás e inserte una ranura poco profunda a lo largo del lado más largo. A continuación, atornille las orejetas de soldadura en la placa de plexiglás y pegue la placa en la parte superior del conector. A continuación, conecte la base a las orejetas utilizando los tres cables cortos.

A continuación, coloque un capilar de vidrio en la ranura de la placa de plexiglás. El capilar debe poder deslizarse y fijarse con un tornillo Con un alfiler minucioso, extienda el capilar de vidrio hacia afuera unos cinco milímetros. El capilar y el pin se utilizarán para soportar y estabilizar los microcables de los electrodos.

A continuación, coloque tres microcables. Con la ayuda de cinta adhesiva para un mejor acceso, el capilar de vidrio se puede quitar con un pegamento de aguja de soldar de 12 voltios. Los alambres junto con la cera dental LMP no pegan el último tercio de los alambres.

Ahora conecte este conjunto de micro cable multicanal al adaptador de electrodo. Coloque el capilar de vidrio extendido paralelo a los microcables. Asegure este accesorio con cera dental a lo largo del capilar de vidrio superpuesto y el alfiler minucioso.

A continuación, recorte los cables del electrodo dejando dos o tres centímetros que se extiendan desde el pin minucioso y de dos a tres centímetros que se extiendan desde el extremo del electrodo. A continuación, fije el capilar en el adaptador de electrodo y utilice un tornillo para estabilizar todo en su lugar. A 360 grados centígrados.

Suelde los extremos de los cables perpendicularmente a las orejetas. A continuación, compruebe que hay un contacto eléctrico lo suficientemente fuerte comprobando que su impedancia es de unos 300 kiloohmios a un kilohercio. Ahora conecte los canales del segundo adaptador de electrodo al electrodo maestro y suelde los electrodos de referencia y de músculo a la base de los electrodos maestros.

Finalmente, monte el electrodo maestro en la placa de interfaz de la etapa principal. Fije el segundo electrodo en un adaptador separado después de obtener las abejas melíferas, enfríe uno en hielo hasta que esté inmovilizado. A continuación, fije la abeja en un soporte de plexiglás estándar con la cabeza expuesta.

Aplique cera dental caliente en la base de los ojos y la unión entre la cabeza y el tórax, asegurando así la cabeza. Continúe usando la cera para inmovilizar el ojo escapal de las antenas en la cápsula de la cabeza. Evita aplicar cera en el fagel, que debe apuntar hacia adelante.

El Pro Bois debe estar libre de pinzamientos. Comprueba que se puede mover. Ahora afeita la cápsula de la cabeza para mejorar la accesibilidad.

A continuación, alimenta a la abeja con todo el 30% de sacarosa que consumirá. Esto asegura una buena preparación, viabilidad e hidratación de los tejidos. Ahora, usando un micro bisturí, corte verticalmente a lo largo del borde del ojo y horizontalmente por encima de las bases de la antena.

Continúe cortando debajo del ojo de la célula O y retire la cutícula suelta. Las glándulas hipofaríngeas deben hacerse a un lado, al igual que la tráquea. Esto despejará el camino para insertar el electrodo.

Comience insertando el electrodo de referencia, un alambre de plata de 35 micras. Primero, haz una pequeña incisión en el ojo compuesto ipsilateral. A continuación, introduzca el electrodo a través de él.

A continuación, inserte el segundo cable en la región de proyección muscular debajo del ojo lateral de la célula O. Para visualizar posteriormente las posiciones de los electrodos, sumerja los electrodos en una solución de cloruro de potasio 0,5 molar y 5%Alexa Hydrocyte 4 88 durante tres minutos. A continuación, utilizando micro manipuladores, coloque los dos electrodos en el cerebro.

Oriéntese identificando el lóbulo de la antena y el lóbulo vertical del cuerpo del hongo. Aquí, un electrodo está en el tracto del lóbulo lateral de la antena a 180 micras de profundidad y el otro en el tracto del lóbulo de la antena medial. Se inserta a unas 300 micras de profundidad.

Complete la colocación de los electrodos anclándolos con dos componentes. El silicio cubre todo el espacio por encima del cerebro, lo que también evitará que los tejidos se sequen. A continuación, proceda a realizar grabaciones para extraer la actividad unitaria de la señal extracelular grabada.

Utilice el software de clasificación de picos disponible. Utilice los canales de electrodos diferenciados. Aplique técnicas de coincidencia de plantillas simultáneamente en los tres canales de electrodos para detectar diferentes combinaciones de formas de onda que tengan en cuenta eventos de pico único.

Y, por último, controlar la correcta separación de las unidades. Utilizando el análisis de componentes principales en los eventos de pico único de los tres canales de electrodo diferenciados registrados. Después de hacer las grabaciones, retire con cuidado la silicona y los electrodos de la abeja.

A continuación, enjuague el cerebro con una solución de timbre de abeja y retire las glándulas y la tráquea. Luego, usando una micropipeta inyectar en el lóbulo de la antena, 5% de micro rubí disuelto en un molar acetato de potasio. Esto proporcionará una etiqueta anterógrada a las huellas del lóbulo.

A partir de aquí, realiza todos los pasos en la máxima oscuridad. Enjuague el cerebro con timbres de abeja nuevamente, tres veces, y deje que el tinte se incube durante 30 a 45 minutos. Inmoviliza la abeja enfriándola en la nevera.

A continuación, aísla el cerebro. Fije el cerebro en aldehído al 4%Para en PBS de 0,1 molares durante la noche a cuatro grados centígrados y con una agitación suave. Después de rellenar las neuronas de proyección en el lóbulo de la antena con un trazador de micro rubí, se ensambló una vista de proyección de estas neuronas a partir de cortes ortoortográficos a lo largo del eje Z.

El colorante Alexa Hydrocyte 4 88 en los dos electrodos muestra su inserción en el lóbulo de la antena medial y en el tracto del lóbulo lateral de la antena. Se utilizó una reconstrucción en 3D de las células objetivo teñidas y los sitios de inserción de electrodos para hacer un esquema de las trayectorias de los dos lóbulos de antena, se utilizó el registro simultáneo de los dos lóbulos de antena mientras se estimulaba a la abeja con diferentes concentraciones de olor para investigar el procesamiento temporal. La actividad se evaluó en las siguientes etapas de procesamiento.

Las neuronas de proyección del lóbulo de la antena y el análisis de componentes principales de las neuronas extrínsecas de los vectores poblacionales ilustran que el olor en las neuronas de proyección fue prolongado y duró más que el estímulo. Por el contrario, en la población de neuronas extrínsecas, solo se representaron los tipos de olor encendido y apagado. Por lo tanto, al ver la actividad con el tiempo, la población de neuronas extrínsecas de la derecha muestra la actividad de separación de olores ligeramente antes de que la población de neuronas de proyección comience a desarrollar su actividad inducida por el olor.

La estimulación de olores está marcada en gris. Una vez dominado, se tarda unos 30 minutos en construir un electrodo. La preparación de la abeja y la inserción de los electrodos en las regiones objetivo se pueden realizar en otra media hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada paso requiere mucha práctica y paciencia hasta que se domine. Tenga especial cuidado al elevar los cables de los electrodos a sus puntos de conexión y registrar desde el alcance cerebral deseado. Se requiere un conocimiento sólido de la anatomía del cerebro de las abejas melíferas después de su desarrollo.

Esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la neuropatología y el olfato de los insectos explorar las relaciones temporales precisas entre la actividad de diferentes vías neuronales y centros cerebrales en el comportamiento de las abejas melíferas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir y usar electrodos de microcables multicanal para grabar simultáneamente desde dos regiones del cerebro y abejas melíferas que se comportan. También debería poder visualizar las ubicaciones exactas de sus electrodos de registro.