Medición de la función respiratoria en ratones usando irrestricta pletismografía corporal total
12 de agosto de 2014
La evaluación de la fisiología respiratoria se ha basado tradicionalmente en las técnicas, que requieran inmovilización o sedación de los animales. Unrestrained pletismografía de cuerpo entero, sin embargo, proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales. Además, la técnica permite repitió evaluación respiratorio de los ratones que permiten estudios longitudinales.
El objetivo general de este procedimiento es medir los parámetros respiratorios de un roedor consciente utilizando una pletismografía de cuerpo entero sin restricciones. Esto se logra calibrando primero el amplificador de puente. Una vez calibrado, se coloca un ratón dentro de la cámara de pletismografía y se le permite aclimatarse antes de la prueba.
A continuación, se registran los cambios de presión que se producen dentro de la cámara. A continuación, se calculan múltiples parámetros respiratorios a partir de la información obtenida durante el uso del sistema de pletismografía. Los resultados muestran que la pletismografía de cuerpo entero sin restricciones es una evaluación fiable de la función pulmonar en roedores.
Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes como la pletismografía invasiva son que los animales no están anestesiados, lo que significa que no estamos asociando artefactos con la anestesia. Además, debido a la naturaleza no invasiva de este protocolo, permite medidas longitudinales. En general, los individuos que son nuevos en esta técnica tienden a subestimar el tiempo necesario para aclimatar a los animales a la cámara de plasma.
Para comenzar, configure el amplificador de puente y el transductor de presión de la máquina de adquisición de datos. Cuando esté listo, vaya a la computadora y abra el software de análisis. Abra la opción de configuración de canales que se encuentra en la barra de herramientas de configuración y cambie el número de canales que se están grabando a uno.
A continuación, configure el aparato de columna de agua como se demuestra. Conecte dos pipetas serológicas de cinco mililitros con tubo de plástico. Llene las columnas con agua y asegúrese de que los niveles de agua estén equilibrados.
Con una regla, conecte una pieza de tubo de plástico a la parte superior de cada pipeta. Para calibrar el amplificador de puente, primero, conecte una jeringa de un mililitro llena de 300 microlitros de aire al lado derecho de la columna de agua. Conecte el tubo del lado izquierdo al conector del transductor de presión.
A continuación, abra el menú desplegable y seleccione amplificador puente. Introduzca la configuración correcta y haga clic en cero para establecer la traza en aproximadamente cero milivoltios. Cuando esté listo, presione la jeringa de un mililitro, la presión resultante moverá el agua en la columna en un centímetro y mostrará un pico repentino en el software debido al cambio de presión.
A continuación, seleccione las unidades de entrada de la ventana del amplificador puente y resalte la traza de fondo antes del pico, también conocida como región cero. Haga clic en la flecha situada junto a 0,1 para producir la señal de fondo dentro de los rangos de 0,002 milivoltios negativos y 0,002 milivoltios positivos. Escriba cero en la ventana adyacente a la ventana de señal de fondo.
Resalte la región de aumento de la presión en el gráfico desde que se presionó la jeringa. Haga clic en la flecha situada junto a 0,2. El valor debe estar en el rango de 0,9 a 1,2 milivoltios.
A continuación, escriba uno en la ventana. Junto a la ventana de aumento de presión, vaya a definir unidades y seleccione centímetros H2O y presione OK. Vuelve al menú del amplificador puente.
Seleccione un milivoltio y ponga el amplificador a cero. Esto completará la calibración y la columna de agua se puede quitar de manera segura. Para obtener los mejores resultados, los animales de experimentación deben introducirse en la cámara de pletismografía una semana antes del inicio de la experimentación.
Para comenzar, coloque la temperatura relativa de la humedad, sondee en todo el extremo de la cámara de pletismografía y registre la temperatura, la humedad y la presión barométrica. Después de registrar el peso y la temperatura corporal del animal, colóquelo en la cámara de pletismografía y cierre la cámara. A continuación, inserte el transductor y la jeringa en los dos orificios del otro lado de la cámara.
Presione inicio en el programa de software y grabe durante un máximo de 45 segundos. Asegúrese de registrar cinco segundos de datos cuando el animal no se esté moviendo. Detenga la grabación después de 45 segundos y retire el mouse de la cámara de pletismografía.
Registre inmediatamente la temperatura y la humedad de la cámara. Regrese el mouse a su jaula rociadora y limpie la cámara con un 80% de volumen por volumen. Etanol Permita que la cámara se seque y vuelva a la temperatura y humedad de referencia antes de pasar al siguiente ratón.
Para comenzar, abra el programa en pantalla completa y seleccione los datos. Abra la ventana del mini panel de datos y seleccione las mediciones del ciclo en la columna de la izquierda y la altura cíclica promedio. En la columna de la derecha de la columna uno, seleccione la opción y establezca la escala para la detección de picos mínimos en uno.
Esto presentará la deflación de presión debido a la medición del volumen corriente PT en el mini panel de datos. Seleccione las mediciones de ciclo seguidas del recuento de eventos para presentar la medición de frecuencia F. A continuación, seleccione las mediciones del ciclo seguidas del período cíclico promedio para presentar la medición del tiempo total del ciclo de respiración T tote seconds para generar valores de inspiración máxima y tiempo de expiración, asegúrese de que el cursor esté directamente sobre el máximo del valle máximo y agregue un comentario sobre nueve picos y valles secuenciales.
Abra una nueva ventana y haga clic en información de selección en la columna de la izquierda y duración en la columna de la derecha antes de seleccionar. Bien, seleccione la macro que se encuentra en la parte superior del programa para comenzar a grabar. A continuación, localice el primer cuadro de comentarios utilizando la herramienta fina.
Vaya al inicio del archivo, seguido del primer comentario y seleccione el comando agregar al panel de datos. Por último, seleccione comenzar a repetir en los comandos de macro y confirme que la ventana de recuento de repeticiones está establecida en nueve. Utilice la opción buscar siguiente y seleccione el comando agregar al panel de datos.
Cuando termine, seleccione y repita. Detenga la grabación y guarde la macro en función del número de animal. Ahora se puede ejecutar la macro para obtener el tiempo de inspiración y expiración entre cada comentario.
Dado que la caducidad y la inspiración se producen consecutivamente, los datos aparecen en este orden y deben dividirse manualmente. Este rastro respiratorio ilustra datos apropiados y consistentes de un animal de control. Se añaden nueve comentarios consecutivos en los picos y valles de las oscilaciones respiratorias para obtener los parámetros respiratorios.
Estos ejemplos muestran los seguimientos subóptimos más comunes que nunca se deben usar para el análisis. Este rastro se registró mientras el animal olfateaba y se movía, un rastro con oscilaciones que aumentan gradualmente con el tiempo suele ser causado por la condensación y la acumulación de humedad. El ruido en este rastro es el resultado de la interacción del animal o investigador con el equipo.
Esta figura muestra la función pulmonar de un ratón con fibrosis pulmonar inducida por bleomicina. Observe el patrón irregular en el rastro de la respiración. Una vez que se domina la técnica y se calibra el equipo, se pueden recopilar los datos de cada animal en cinco minutos.
Los datos recopilados se pueden analizar y exportar a una hoja de cálculo de Excel. Si bien es importante intentar este procedimiento para aclimatar al ratón a la cámara de pletismografía antes de recopilar datos, esto puede variar entre cepas de ratones. En promedio, usamos ratones C 57 black six de adolescentes, y esto tomará de cuatro a cinco días antes de recopilar datos.
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Descripción general
Este artículo analiza el uso de la pletismografía de cuerpo entero sin restricción para medir parámetros respiratorios en roedores conscientes. Esta técnica no invasiva permite evaluaciones precisas y repetidas de la fisiología respiratoria, facilitando estudios longitudinales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología respiratoria
- Modelos animales
- Técnicas no invasivas
Antecedentes
- Los métodos tradicionales para evaluar la fisiología respiratoria a menudo requieren sedación o inmovilización.
- La plestimografía de cuerpo entero sin restricción ofrece una alternativa no invasiva.
- Esta técnica permite mediciones repetidas a lo largo del tiempo.
- Es particularmente útil para estudiar la función pulmonar en roedores.
Objetivo del estudio
- Medir parámetros respiratorios en roedores conscientes.
- Mostrar la fiabilidad de la plestimografía de cuerpo entero sin restricción.
- Facilitar estudios longitudinales de la fisiología respiratoria.
Métodos Utilizados
- Calibración del amplificador de puente.
- Aclimatación del ratón en la cámara de pletismografía.
- Registro de los cambios de presión dentro de la cámara.
- Cálculo de múltiples parámetros respiratorios a partir de los datos registrados.
Resultados principales
- La plestimografía de cuerpo entero sin restricción proporciona evaluaciones confiables de la función pulmonar.
- Se pueden medir con precisión múltiples parámetros respiratorios.
- La técnica permite evaluaciones repetidas en los mismos sujetos.
- Los resultados respaldan el uso de este método para estudios longitudinales.
Conclusiones
- La plestimografía de cuerpo entero sin restricción es eficaz para estudiar la fisiología respiratoria en roedores.
- Este método mejora la capacidad de realizar investigaciones longitudinales.
- Representa un avance significativo respecto a las técnicas tradicionales basadas en restricción.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La plestimografía de cuerpo entero sin restricción permite la medición no invasiva y repetida de parámetros respiratorios en roedores conscientes, facilitando la evaluación longitudinal de la función pulmonar en modelos preclínicos. Este enfoque reduce los efectos de confusión provocados por la anestesia y la restricción, mejorando la fiabilidad de los datos para la validación de dianas y estudios mecanicistas en la investigación de enfermedades respiratorias. La técnica proporciona resultados respiratorios cuantitativos que pueden utilizarse para evaluar candidatos terapéuticos y reducir los riesgos en las vías de traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Cuestionar hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de fenotipos respiratorios en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Permitir mediciones repetidas en el mismo animal para reducir la variabilidad y aumentar el poder estadístico.
- Valor predictivo: Apoyar la confirmación de dianas mediante lecturas reproducibles de la función pulmonar a lo largo de diferentes puntos temporales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para el ensayo: Preparar sistemas biológicos validados para la selección de compuestos con puntos finales respiratorios estandarizados.
- Resultados cuantitativos: Generar volumen tidal, volumen minuto y velocidad de flujo inspiratorio para el análisis de respuesta a la dosis.
- Reproducibilidad: Minimizar artefactos provocados por anestesia y manipulación para mejorar la consistencia del ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicar a modelos de fibrosis pulmonar, asma y EPOC para evaluar el impacto terapéutico sobre la mecánica pulmonar.
- Continuidad traslacional: Vincular el descubrimiento con la validación preclínica mediante un monitoreo respiratorio no invasivo y constante.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orientar los criterios de avance o interrupción basados en tendencias longitudinales de la función respiratoria.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder y las pruebas de eficacia preclínica, especialmente para programas enfocados en el sistema respiratorio.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de salidas respiratorias funcionales en animales conscientes.
- Selección: Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos para evaluar los efectos de compuestos sobre la función pulmonar.
- Análisis: Proporciona parámetros mensurables como el volumen corriente y el ciclo inspiratorio para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos iniciales con la continuidad preclínica mediante un monitoreo respiratorio repetido y no invasivo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable en múltiples modelos de enfermedades respiratorias y series de compuestos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en los fenotipos respiratorios.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, reproducibilidad y escalabilidad para estudios con múltiples grupos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas respiratorios.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en datos longitudinales de función respiratoria.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en fisiología respiratoria y sistemas de adquisición de datos.
- Depende de transductores de presión calibrados y monitoreo ambiental estable.
- Necesita procedimientos operativos estándar (SOP) coordinados entre equipos para la aclimatación en cámaras y la identificación de artefactos.
- Implica consideraciones de adaptación entre cepas de ratones y modelos de enfermedades.
- Limitado por la susceptibilidad a artefactos por movimiento y condensación ambiental, lo que requiere una exclusión cuidadosa de valores atípicos.
