Name: Imágenes en vivo de Drosophila larvales neuroblastos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende a realizar imágenes en vivo de neuroblastos en cerebros intactos de larvas de Drosophila. Este protocolo utiliza microdissección fina y microscopía confocal para estudiar divisiones asimétricas de células madre neurales.

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Este trabajo fue apoyado por la división de investigación intramural en los Institutos Nacionales de la Salud / NHLBI (1ZIAHL006126) y un Lenfant Biomédica beca posdoctoral adjudicados a DAL.

1. Preparación de los materiales requeridos para explante Brains tercer estadio larval <ol><li> Preparar las herramientas necesarias para microdisección. <ol><li> Forjar dos herramientas de disección (un bisturí y un gancho) colocando primero un único pin de disección en cada soporte de pasador. Asegure los pasadores firmemente con la mano o con pinzas (Figura 1C). </li><li> Use un par de pinzas de edad para doblar un pin de disección para un ángulo de aproximadamente 120 °. Haga esto bajo un microscopio de disección para asegurar que la mitad superior de la espiga quede plana cuando el soporte de pasador se mantiene en su mano. Esta herramienta se utilizará como un bisturí para sujetar o cortar a través del tejido. </li><li> Use un par de pinzas de edad para doblar el segundo pasador en forma de gancho que se utiliza para mantener y raspar el tejido. </li><li> Cubra cada herramienta de disección con una punta de pipeta para proteger las herramientas de deterioro. Con cuidado, herramientas bien formados pueden ser utilizados para la disección de forma indefinida. Reemplace los pins dañados o deformados según sea necesario. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Preparar la disección de medio. <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, diluir el suplemento antibiótico-antimicótico en medio de cultivo de la Schneider. Agitar los medios para incorporar el suplemento. </li><li> Prepare varias alícuotas de 5 ml de los medios suplementados. Guarde todos los medios a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> Calentar una alícuota de 5 ml de medio suplementado a temperatura ambiente. Dibuje el medio en una estéril jeringa de 5 ml y el tornillo en un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril. </li></ol></li><li> Seleccione larvas para la disección. Utilice una sonda de disección para seleccionar arrastrándose larvas de tercer estadio como el cerebro será más fácil de diseccionar. Opcional: las larvas se depositan sobre una placa de agar de uva. Nota: No utilizar los viales o frascos excesivamente concurridos con &quot;alimentos húmedos&quot;, ya que estos tienden a forzar segundos o larvas de primer instar a gatear antes de tiempo. Nota: Algunos antecedentes genéticos requerirán el uso de larvas de menos. Esto no afecta el protocolo, pero hace que el dissection más difícil. </li></ol> 2. Disección del Sistema Nervioso Central <ol><li> En una sola lámina de vidrio, cree dos piscinas de 50 ml de medios de disección cálidos separadas por unos 3 cm. Una de las piscinas será utilizada para la disección bruto y otra utilizada para la disección fina (Figura 1C). </li><li> Transferir varios larvas a una de las gotas de medios de comunicación. </li><li> Mueva el cubreobjetos con larvas a un microscopio de disección. Zoom en la piscina que contiene las larvas de tal manera que los extremos anterior y posterior de las larvas son discernibles. </li><li> Use un par de pinzas para agarrar la región media de una sola larva. Tome un segundo par de pinzas en la otra mano y agarrar la larva cerca de la misma región. Tire de los dos pares de pinzas, aparte de romper suavemente la larva en el medio. Repita los dos pasos anteriores para todas las larvas en el cubreobjetos. </li><li> Deshágase de las mitades posteriores del cuerpo de la larva, transfiriéndolos a un tejido. </li><li> Zoom en una larva por lo que thmouthhooks anteriores correos son claramente visibles. Utilice ambos pares de pinzas para crear una pequeña incisión, o muesca, en lados opuestos de los mouthhooks de larvas entre la tercera y la primera torácica bandas denticle anteriores. </li><li> Agarre las mouthhooks con las pinzas en la mano no dominante. Utilice las pinzas en la otra mano para que despegar la cutícula en una dirección antero-posterior a. Continuar para pelar lentamente cutícula hasta el sistema nervioso central está expuesto. </li><li> Aislar el sistema nervioso central del resto de la larva por desgarro tejidos con los fórceps. Tenga cuidado de no alterar el sistema nervioso central. Paso crítico: No tire en el sistema nervioso central! Desechar las muestras dañadas con un cable roto ventral del nervio (Figura 2A) o lóbulos ópticos distorsionadas (Figuras 2B y 2B &#39;). </li><li> Repita los dos pasos anteriores para todas las larvas en el cubreobjetos. Transferir el tejido explantado saludable para lasegunda piscina (limpia) de media sobre el portaobjetos para la etapa de la disección fina. </li><li> Utilice las herramientas de pasador de disección para limpiar los tejidos periféricos (por ejemplo, los ojos, las alas y las piernas discos) desde el cerebro. Deslice el bisturí entre la quería (cerebro) y el tejido no deseado, sujetando el tejido conectivo del cubreobjetos. Utilice el gancho para embromar suavemente el tejido no deseado mientras pulsa simultáneamente el bisturí para el cubreobjetos en los movimientos de sierra similares. </li><li> Paso crítico: Trabaje despacio y deliberadamente para eliminar todos los discos de cada cerebro. Tenga cuidado de no alterar la morfología del cerebro. Un cerebro saludable tendrá un cordón ventral del nervio intacto y simétrico, lóbulos ópticos redondos (Figura 2C). </li></ol> 3. Montaje Brains explantado para imágenes en vivo <ol><li> Invierta una placa de cultivo de gas permeable 50 mm con la película clara hacia arriba (Figura 2D). Presione la jeringa para depositar una pequeña gota (aproximadamente 30 l) de medio sobre tél centro del plato. </li><li> Transfiera los cerebros aislados, uno a la vez, a la gota de medio en el plato. Utilice la herramienta de gancho para sacar un cerebro debajo de los lóbulos ópticos. Por otra parte, el uso de fórceps para agarrar los axones que se proyectan desde el cordón nervioso ventral. </li><li> Recoger 5-10 cerebros en la gota de medio. Sumerja el cerebro mediante el uso de las herramientas de pasador de disección para empujar los cerebros individuales a la parte inferior de la gota de medio ya que muchos de ellos serán atrapados en el menisco (Figura 2E). </li><li> Orientar los cerebros utilizando las herramientas pin de disección para alinear cerebros dependiendo de la RN en ser fotografiado (Figura 3A). Para la imagen de la RN dorsal, coloque el cordón nervioso ventral hacia abajo (a lo largo de la membrana). Para la imagen de las NBS-Antério ventral, ponen el cerebro con el cordón nervioso ventral hacia arriba (alejándose de la membrana). Alinear los cerebros de tal manera que todos los cordones nerviosos ventrales apuntan en la misma dirección dentro del plano XY. </li><li> Utilice una jeringa o de transferencia de plástico pipette para colocar 4 halocarbonos (HC) gotas de aceite (unos 30 l cada uno) sobre la membrana permeable a los gases. El volumen de cada gota de aceite debería ser equivalentes entre sí y a la gota de medio. Espacio de las gotas de aceite para que correspondan a las cuatro esquinas de un cubreobjetos centrada alrededor de la gota de medio de cultivo. Una vez completo, los cinco gotas (cuatro gotas de aceite y una gota de medio en el centro) se parecerán a las cinco facetas en estilo occidental dados (Figura 3B). </li><li> Bajar un # 1.5 22 mm cubreobjetos sobre el conjunto de tal manera que realiza todas las 5 gotas al mismo tiempo. El mantenimiento de una presión uniforme a través de las muestras reduce la probabilidad de que serán interrumpidos. Espere aproximadamente 3 min como el aceite y el medio disperso bajo el peso del cubreobjetos. Se forma una forma de cruz de los medios de comunicación (Figuras 3C y 3D). </li><li> Paso crítico: Baje el cubreobjetos sobre la superficie del cerebro, eliminando el exceso de medios usando una mecha de papel de seda (Figure 3C). Haga esto mientras ve la muestra bajo el microscopio de disección. Como se retiró el medio, el cubreobjetos bajará. Detener una vez que el cubreobjetos toca el cerebro. No se exceda en la mecha, ya que esto hará que la distorsión del tejido del cerebro o explosiones. </li><li> Si dorsal imágenes NBS (Figura 3E), se mueven al paso 3.9. Si de formación de imágenes NBS-Antério ventral, el cubreobjetos se debe mover ligeramente (por suavemente empujándola con fórceps) en la dirección de las puntas de cordón nervioso ventral. Esto hace que el cerebro para girar, lo que trae los lóbulos cerebrales en contacto directo con el cubreobjetos para facilitar la formación de imágenes (Figura 3F). </li><li> Sellar la cámara rodeando el cubreobjetos con pequeñas cantidades de aceite de halocarbono (Figura 3D). El exceso de aceite de la exudación de los cubreobjetos debe reducirse al mínimo y borró de distancia con un pañuelo de papel. </li></ol> 4. Imágenes en vivo de Central Brain neuroblastos Nota: Para este trabajo, un hilado de disco Nikon Eclipse Timicroscopio confocal (microscopio invertido) se utilizó para la formación de imágenes en vivo; detalles de nuestra instalación se han publicado previamente 31. Alternativamente, la muestra puede ser reflejado usando un sistema en posición vertical. <ol><li> Añadir una gota de aceite de inmersión para el cubre justo por encima de los cerebros montados. Esto ayudará a centrar el objetivo directamente sobre la muestra. </li><li> Paso crítico: Mantener el cerebro a una temperatura constante de 25 ° C con una incubadora de etapa. Coloque suavemente la muestra montada en la incubadora escenario y cubrir la cámara con su tapa. </li><li> Localice RN centrales del cerebro con luz transmitida, centrándose en las células grandes y redondos que residen en las zonas central y medial de los lóbulos ópticos y no utilice epi-fluorescencia. Esto se hace más fácil con la práctica. Es muy importante para exponer la muestra a la menor cantidad de luz posible. No pierda tiempo cerebros de imágenes que se encuentren dañados. </li><li> Una vez en su lugar, tomar exposiciones rápidas utilizando el confocal paradeterminar la ubicación y profundidad adecuada. Límite de profundidad a la primera 10-15 micras. Ajuste según sea necesario, y tomar otra imagen de prueba. <ol><li> Paso opcional: Se recoge una película de prueba del cordón nervioso ventral para asegurar que no hay deriva xy. Si se detecta la deriva, espere 15-30 minutos para la muestra a un acuerdo. Si la tendencia no se asienta en 30 min, preparar una nueva muestra. Major deriva generalmente se remonta a la adición de un exceso de aceite, o el tamaño desigual de aceite cae durante el montaje. </li></ol></li><li> Para eliminar la deriva axial (z-drift) utiliza un dispositivo de enfoque automático continuo que utiliza un LED infrarrojo. Alternativamente, corregir manualmente el plano focal. </li><li> Una vez que se identifica una Nota de interés, continuar con el régimen de formación de imágenes. Al igual que con todas imágenes de células vivas, la cantidad de luz láser, tiempo de exposición, la cámara hurgar en la basura, aumento del objetivo, el tiempo y / o el intervalo z pasos deben ser todas empíricamente optimizado para un experimento en particular para responder a la cuestión que nos ocupa. El objetivo es reducir al mínimo la presa luzedad, mientras que todavía la recogida de datos útiles. Véase la discusión para orientación adicional. <ol><li> Imagen de todo el volumen de la NB mediante la recopilación de 12-14 imágenes espaciados por 1 m en el eje z. Ajuste la resolución de tiempo para capturar los ciclos de células individuales o múltiples de la misma NB. Como regla general, utilice intervalos de 10-30 seg para la imagen única del ciclo celular y de 1-3 minutos durante varios ciclos celulares. </li></ol></li><li> Paso crítico: Confirme que la muestra es saludable mediante el control de la duración de la mitosis. Si mitosis tarda más de 15 minutos, pasar a otro cerebro. Un cerebro sano mostrará muchas notebooks en el mismo campo de visión de someterse a varias rondas de mitosis. Tenga en cuenta que cada ciclo celular es ligeramente más larga que la anterior debido a daño de la luz. </li><li> Una vez que la imagen está completa, desmontar la cámara de incubación, y desechar todo, pero los platos de cultivo permeables al gas. Enjuague la superficie del plato de cultivo con 95% de etanol y limpie bien con un pañuelo de papel. Repita dos veces más. </li&gt; </ol> 5. Preparación de Brains por inmunofluorescencia <ol><li> Recoger 20 o más explantados cerebros en un tubo de 1,5 ml que contiene aproximadamente 0,2 ml de medio suplementado. </li><li> Retire medio del tubo y enjuague cerebros una vez con 0,5 ml de PBSTx (salina tamponada con fosfato, PBS, con 0,3% de Triton X-100). Deje cerebros se depositan en el fondo del tubo entre todos los intercambios de líquido. El detergente de Triton X-100 se utiliza para permeabilizar el tejido. El enjuague normalmente toma menos de 30 segundos; basta con quitar el PBSTx una vez cerebros se han asentado en el fondo del tubo. </li><li> Reemplace la solución con 0,5 ml de un 9% de electrones paraformaldehído grado microscopía diluido en PBSTx. Incubar con nutación durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Deshágase de fijador de acuerdo a las regulaciones de desechos peligrosos. </li><li> Lavar las muestras con 0,5 ml de PBSTx durante 15 min. Repita el paso de lavado con PBSTx fresca dos veces más. </li><li> Reemplace la solución con 0,5 ml PBT (PBS, 1% Albúmina de suero bovino (BSA), y 0,1% de Tween-20). Incubar con nutación durante 1 hora a temperatura ambiente. Bloquea el unión no específica de anticuerpos contra el tejido de este paso. </li><li> Reemplazar la solución con 0,5 ml de anticuerpo primario diluido en PBT suplementado con 4% de suero de cabra normal (NGS). Incubar con nutación noche a 4 ° C. </li><li> Deseche o guardar el anticuerpo primario diluido. </li><li> Lavar las muestras con 0,5 ml de PBT durante 15 min. Repita el paso de lavado con PBT fresca dos veces más. </li><li> Reemplazar la solución con 0,5 ml de PBT modificado (PBS, 2% de BSA, 0,1% de Tween-20, y 4% de NGS). Incubar con nutación durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Reemplace la solución con 0,5 ml de anticuerpo secundario diluido en PBT modificado. Incubar con nutación durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar la solución con 0,5 ml de PBST (PBS con 0,1% de Tween-20). Incubar con nutación durante 15 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado con PBST fresca dos veces más. </li></ol><ol><li> Transferir cuidadosamente las muestras como una gota en un portaobjetos de vidrio, la restricción de la caída hacia la izquierda del centro de la corredera. </li><li> Añadir una gota grande (alrededor de 2 cm de diámetro) de medio de montaje (por ejemplo, Aqua-Poly/Mount) al centro de la corredera. Evitar la piscina de PBST que es hacia la izquierda. </li><li> El uso de fórceps para transferir los cerebros de la piscina de PBST a la piscina de medio de montaje. Adición de medio de montaje directamente sobre el cerebro puede alterar su orientación y se debe evitar. </li><li> Bajo un microscopio de luz, disponer las muestras en el medio de montaje con la parte que será reflejado hacia arriba. </li><li> Con el portaobjetos bajo el microscopio de luz, baje lentamente un cubreobjetos de vidrio # 1.5 en la parte superior de las muestras. Paso opcional: Desalojar las burbujas de aire de menor importancia presionando ligeramente sobre el cubreobjetos. </li><li> Dejar que el medio de montaje para polimerizar durante varias horas, o durante la noche, por las diapositivas que miente completamente, la luz-protegida, a temperatura ambiente. </li><li> Los portaobjetos pueden tomarse imágenes al día siguiente, o se almacena antes de la imagen. </li></ol>

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<li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia%2Fflagella+function%2C+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole%2C+but+is+dispensable+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li>
<li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li>
<li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Imágenes de células vivas es un enfoque inestimable utilizado para estudiar los mecanismos que regulan ACD de las células madre, la diferenciación de los linajes de células, y la morfogénesis de tejidos complejos. Aunque los grupos de investigación han utilizado históricamente una variedad de técnicas para visualizar NB ACD, estos enfoques pueden ser generalmente se agrupan en dos categorías que difieren principalmente con respecto a si el tejido cerebral se deja intacta o disociado. Imaging...

Las células madre mantienen un equilibrio de la diferenciación y autorrenovación para generar diversidad celular durante el desarrollo temprano y reemplazar las células dañadas en los tejidos adultos. Reglamento de esta homeostasis impide que tanto la pérdida como la expansión excesiva de la población de células madre, lo cual puede resultar en la degeneración del tejido perjudicial o tumorigénesis. Los neuroblastos (NBS) son las células madre neurales ampliamente estudiadas del sistema nervioso central de Drosophila (Figura 1A) que primero forma durante las etapas embrionarias 1, 2. RN sometidos a rondas repetidas de división celular asimétrica (ACD) para producir dos células desigual predestinados: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celulares. ACD es guiado por centrosomas, los orgánulos no membranosos que actúan como los centros de organización de microtúbulos de la mayoría de las células 3. Durante la mitosis, los centrosomas NB organizan y orientan el huso mitótico bipolar a lo largo del polo apical-basaleje dad. Tras la escisión de la división de NB, determinantes destino apicales que especifican el destino de células madre, y los determinantes del destino basales que especifican la diferenciación, son segregados en las células hijas desiguales. En el cerebro central de las larvas, dos tipos de RN se pueden distinguir por su número, la posición, la expresión del factor de transcripción, y el linaje celular (Figura 1 A) 4-6. Tipo I NBS son los más abundantes, y sobre 90 de los pueblan los lados anterior y posterior de cada lóbulo óptico del cerebro 7. Estos NBS expresan el factor de transcripción Asense (ASE), y que característicamente se dividen en una auto-renovación NB y uno ganglio de células madre más pequeña (GMC; Figura 1B). Cada GMC se somete a una sola división de terminal para generar dos neuronas o la glía (Figura 1B). Por el contrario, los RN ocho de tipo II que pueblan la parte posterior de cada lóbulo óptico carecen Ase expresión 5. Se someten a ACDpara producir un auto-renovación NB y uno progenitoras neurales intermedio (INP). El INP, a su vez, divide asimétricamente tres a cinco veces. Cada una de estas divisiones resultados en la regeneración de la INP y la producción de un solo GMC 4. En conjunto, la identidad específica NB y el orden temporal de GMC nacimiento da lugar a la diversidad neuronal asombrosa del sistema nervioso central adulto. La comprensión de la biología celular que subyace NB ACD se ha mejorado enormemente mediante el uso de técnicas de imágenes de células vivas. Publicado protocolos utilizados por los investigadores a imagen RN vivos varían ampliamente. En general, sin embargo, estos métodos se pueden agrupar en dos categorías generales que se distinguen por si el cerebro de larvas se deja intacta o mecánicamente disociado. Ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, dependiendo de la solicitud del investigador. Los primeros informes que revelan vivo división celular NBnes implican algún grado de disociación manual de la cerebro de larvas. Estos protocolos de detalle se corra 8 o burlas aparte 9 del cerebro para crecer cultivos primarios a corto plazo de la RN sobre cubreobjetos de vidrio. Para mejorar la imagen, las NBS redondas son generalmente aplanados en los cubreobjetos, ya sea con placas de vidrio 8 o almohadillas de agarosa 9. Aunque las células aplanadas han mejorado la óptica, estas técnicas conducen a menudo a defectos mitóticos NB, incluyendo la regresión del surco de segmentación y la incapacidad para dividir más de una vez. Por lo tanto, los protocolos que implican tanto la disociación manual y distorsión física del tejido cerebral de larvas generalmente sólo se adaptan a muy corto plazo (es decir., Ciclo de una célula o menos) aplicaciones. Del mismo modo, semi-aplastamiento o aplanar completamente cerebros intactos entre las diapositivas de cristal y cubreobjetos limita el tiempo que uno puede pasar la imagen de una modelo que figura como a un período de aproximadamente 30 min 10. A pesar de esta limitación, this enfoque ha sido utilizado con éxito 11-14. Los recientes esfuerzos para vivir imagen disocian límite RN distorsión física de las células aisladas. Estas técnicas son particularmente útiles para aplicaciones en las que es necesario para mantener cultivos de células para múltiples ciclos de división celular. Por ejemplo, las células dispersas de cerebros disociados manualmente pueden estar parcialmente incrustadas en un coágulo a partir de la mezcla de fibrinógeno y trombina 15 para formación de imágenes a largo plazo 16. Alternativamente, los cerebros explantados pueden ser primero químicamente disociado con la enzima colagenasa, junto interrumpido manualmente por el paso repetido a través de una punta de pipeta, y posteriormente se sembraron en platos de fondo poli-L-lisina-revestido de vidrio 17, 18. Revestimiento de platos de vidrio, ya sea con el fibrinógeno o poli-L-lisina promueve el apego y ligera propagación de células redondas, llevándolos tan cerca del cubreobjetos posible sin distorsión importante físico. En additien adelante, estos métodos implican el cultivo de la NBS en medio que puede intercambiarse fácilmente para los experimentos de perturbación farmacológicas 18. En general, enchapado directamente dispersados ​​RN mejora óptica de imagen sin sacrificar la capacidad de imagen a largo plazo. Recientemente, un protocolo que describe el cultivo a largo plazo de NB disociada se ha detallado 19. Sin embargo, este enfoque no es sin sus limitaciones. Hay varias advertencias a las imágenes RN disociadas en vivo. En un campo de células dispersas, por ejemplo, es difícil identificar linajes NB específicos que se organizan espacialmente en el cerebro intacto 1. Del mismo modo, distinguir el tipo I frente II NB dentro del tejido disociado tipo también es difícil sin la expresión de marcadores de linaje o transgenes específicos de subtipo, tales como Worniu-GAL4, GAL80-aSENSE 20. Aunque estos transgenes son muy útiles para algunas aplicaciones, no se limitan a los investigadores a los transgenes expresionado bajo el control del elemento promotor de UAS 21 y requieren esquemas genéticos más complejos. Los estudios que se refieren al desarrollo espacial o temporal de los RN, por lo tanto, requieren de imágenes in vivo, en el contexto de un tejido intacto. Por otra parte, los estudios de NBS embrionarias disociadas indican que el contacto físico de las células adyacentes es crítica para la localización de la interfase polaridad clave determinantes 22, 23. Estos estudios muestran completamente aislado RN ya no mantener el eje del huso mitótico invariante. En su lugar, estas células presentan un eje de husillo más aleatorios y amplios ángulos de separación entre los sucesivos brotes de GMC, tal vez debido a la pérdida de posicionamiento del centrosoma apical 22. Aunque la relación entre el BNE larvales y sus células vecinas no ha sido ampliamente estudiado, vale la pena considerar que el microambiente de células madre de larvas puede incidir en la polaridad celular u otrocomportamientos. Para mantener el contexto fisiológico de larvas NBS, que la imagen de ACD a partir de cerebros enteros. Dadas las limitaciones inherentes asociados con la formación de imágenes disociadas RN, nuestro laboratorio y otros han establecido protocolos para imágenes sucesivas rondas de NB ACD de cerebros larvales enteros. Técnicas a la imagen cerebros intactos a menudo sustituyen la superficie rígida de vidrio en un lado de la cámara de cultivo con una membrana flexible para evitar la distorsión o daño de tejido y permitir el intercambio de gases. Algunos métodos implican montaje cerebros explantados en una mezcla de medio de insecto de cultivo, suero, y ácido ascórbico con los cuerpos grasos aislados de diez larvas 24. Los cuerpos grasos aislados se añaden porque secretan un mitógeno sabe que estimula la división celular NB 25. Este protocolo preserva la integridad de los tejidos durante más de 3 horas y es, por lo tanto, susceptibles de formación de imágenes a largo plazo 24, 26-28. Recientemente, un protocolo que describe la lonimágenes g plazo de cerebros larvas intactas en presencia de ácido ascórbico, suero y los órganos de grasa se ​​ha detallado 29. Es importante destacar que, debido a que el tejido está expuesto ni tampoco inmovilizado, este enfoque es menos útil para aplicaciones en las que se intercambia medio de cultivo (por ejemplo, estudios de la droga, la inmunodepleción, etc.). Nuestro laboratorio ha simplificado todo el monte de la preparación de los cerebros de larvas vivas para la imagen a largo plazo 30, 31. La principal ventaja de nuestro protocolo sobre los demás es su simplicidad: nuestras observaciones indican ni el suero, el ácido ascórbico, la insulina, ni cuerpos gordos son aditivos necesarios a imagen de rondas sucesivas de NB ACD. Aunque aditivos, tales como la insulina, han sido útiles para la formación de imágenes prolongada de divisiones celulares vástago 32 y la migración celular colectiva en los ovarios de Drosophila 33, que parecen ser prescindible para NB de ACD, como nuestro medio de formación de imágenes se compone de una mezcla simple de Standard medio de cultivo de células de insecto suplementado con antibiótico-antimicótico para evitar la contaminación. Mediante el uso de placas de cultivo de fondo permeable al gas o de vidrio reutilizables, hemos sido capaces de sostener varias rondas sucesivas de ACD NB. Las mismas muestras explantados fácilmente se pueden utilizar para inmunofluorescencia y otros procedimientos con tejido fijado. En este protocolo, detallamos la disección del cerebro de larvas intactas, así como la preparación de los cerebros para el análisis tanto en directo como fijo.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo de tejidos Lumox 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>Una placa de cultivo reutilizable con una base de película permeable al gas y ópticamente transparente.</td></tr><tr><td>Schneider's S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Un suplemento que contiene penicilina (10,000 U/ml), estreptomicina (10,000 &#956; g/ml) y anfotericina B (25 &#956; g/ml) que se añade a los medios S2 de Schneider para evitar la contaminación bacteriana y fúngica.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Un aceite inerte de alta viscosidad, transparente e incoloro.</td></tr><tr><td>Par de soportes de alfileres niquelados, 17 cm de largo</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Par de pinzas Dumont #5 Fine</td><td>Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aguja/sonda de disección con mango de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A Filtro de jeringa</td><td></td></tr><tr><td>, 0.22 &#956; m tamaño de poro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 32% EM grado</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico; debe manipularse en una campana extractora. Siga las pautas de MSDS para un manejo seguro.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Colorante que marca el ADN y es excitado por la luz ultravioleta.</td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo de<em&gt; drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Las células madre se dividen asimétricamente para generar dos células hijas con desigual potencial destino: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celular. Dada su importancia para el desarrollo y la enfermedad, la comprensión de los mecanismos que gobiernan la división de células madre asimétrica ha sido un área sólida de estudio. Debido a que son genéticamente manejable y se someten a rondas sucesivas de la división celular aproximadamente una vez cada hora, las células madre del sistema nervioso central de Drosophila, o neuroblastos, son modelos indispensables para el estudio de la división de células madre. Acerca de 100 células madre neurales se encuentran cerca de la superficie de cada uno de los dos lóbulos cerebrales de larvas, por lo que este modelo de sistema particularmente útil para estudios de microscopía de formación de imágenes en vivo. En este trabajo se revisan los enfoques ampliamente utilizados para visualizar las divisiones de células madre, y nos dirigimos a las ventajas y desventajas de las técnicas que emplean disocian frente a los tejidos cerebrales intactas relativos. También detalle nuestra simplifprotocolo ied utiliza para explantar cerebros enteros de larvas del tercer estadio de imágenes de células vivas y aplicaciones de análisis fijos.

Formación de imágenes en vivo ha dilucidado una serie de mecanismos que regulan NB ACD. Antes de la adquisición de la imagen, es necesario determinar las condiciones óptimas de formación de imágenes. Es necesario equilibrar la tasa de captura de imágenes con la duración de imágenes de células vivas. Para el análisis celular fina, por ejemplo, aumentó temporal y la resolución óptica puede ser requerida. Cuando la visualización de un solo ciclo celular NB (Figura 4A), la velocidad a la que se capturan las...

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

El objetivo general de este procedimiento es detallar la disección del SNC intacto a partir de larvas de tercer estadio de oph. Con el fin de estudiar divisiones asimétricas de células madre, diferenciación celular y morfogénesis. Esto se logra primero mediante la extracción del SNC del cuerpo larvario mediante disección gruesa.El segundo paso consiste en aislar el cerebro intacto de los tejidos periféricos mediante microdisección fina utilizando herramientas hechas a medida. A continuación, los cerebros sanos se montan para la obtención de imágenes de células vivas o se someten a fijación química e inmunofluorescencia; finalmente, se utiliza microscopía confocal de disco giratorio para mostrar los eventos que regulan las divisiones de las células madre neurales y proporcionar una visión mecanicista del desarrollo del SNC. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del cáncer de células madre y del desarrollo neural.Al contribuir a nuestra comprensión de cómo se regula la proliferación de células madre, sabemos que la división de células madre ABER está asociada con la tumorigénesis y la microcefalia, y nuestros estudios de imágenes revelan los mecanismos que regulan estas divisiones de células madre. La demostración visual de este método es fundamental porque la microdisección y el montaje del cerebro son difíciles de aprender, ya que requieren manos firmes, paciencia y práctica. Comience este procedimiento colocando dos gotas de medio de disección tibio sobre un portaobjetos de vidrio, una para la disección gruesa y la otra para la disección fina.Luego, transfiera varias larvas a una de las gotas de medio. A continuación, transfiera la placa de vidrio con las larvas a un microscopio estereoscópico. Aumente ahora el zoom sobre la gota que contiene las larvas de manera que sean visibles los extremos anterior y posterior de las larvas.Sujete la región media de una larva individual con un par de pinzas y agarre otra región adyacente con un segundo par de pinzas. A continuación, rompa la larva por la mitad. Repita el procedimiento con todas las larvas en la cubierta, deseche las mitades posteriores.Acerque un larva de manera que los ganchos bucales anteriores sean claramente visibles. A continuación, realice una pequeña incisión o muesca en el lado opuesto a los ganchos bucales larvales, entre las bandas CLE del tercer tórax y del primer abdomen. Luego, sujete los ganchos bucales con la pinza.Retire con cuidado la cutícula en dirección anterior a posterior y continúe hasta exponer el SNC. Luego, rompa los tejidos para aislar el SNC del resto de las larvas. Tenga cuidado de no dañar el SNC y deseche las muestras dañadas con el cordón nervioso ventral roto o lóbulos ópticos distorsionados.Repita los procedimientos para todas las larvas en la laminilla. Luego transfiera el tejido explantado sano al otro medio limpio. Deposite una gota sobre la laminilla para la disección fina.Utilice las agujas de disección para eliminar los tejidos periféricos del cerebro. Deslice el escalpelo entre el cerebro y el tejido no deseado y sujete el tejido conectivo al portaobjetos con alfileres. Use el gancho para separar suavemente el tejido no deseado mientras presiona simultáneamente el escalpelo contra el cubreobjetos con movimientos alternos.Trabaje lentamente y con cuidado para extraer todos los discos de cada cerebro. Tenga precaución de no alterar la morfología cerebral. Un cerebro sano tendrá un cordón nervioso ventral intacto y lóbulos ópticos redondos y simétricos.Ahora invierta un platillo de cultivo permeable al gas de 50 milímetros con una película transparente hacia arriba y coloque una pequeña gota de medio en el centro del platillo. A continuación, use un gancho para recoger los cerebros debajo de los lóbulos ópticos y transfiéralos uno por uno a la gota de medio en el platillo. Recolecte de cinco a diez cerebros en la gota de medio.Luego, empujarlos uno por uno hacia el fondo, ya que muchos de ellos quedarán atrapados en el menisco posteriormente. Orientar los cerebros de manera que permitan la visualización del neuroblasto para obtener imágenes del neuroblasto ventral anterior. Colocar los cerebros con el cordón nervioso ventral orientado hacia arriba y alinearlos de modo que todos los cordones nerviosos ventrales apunten en la misma dirección dentro del plano XY.Utilice una jeringa o una pipeta de transferencia de plástico para colocar cuatro gotas de aceite de halo carbono sobre la membrana permeable al gas. El volumen de cada gota de aceite debe ser equivalente entre sí y a la gota del medio. Una vez completado, las cinco gotas se asemejarán a las cinco caras de un dado occidental.A continuación, coloque una lámina de cubierta sobre el montaje de manera que toque las cinco gotas al mismo tiempo. Mantener una presión uniforme sobre las muestras reduce la probabilidad de que se alteren. Espere aproximadamente tres minutos.Mientras el aceite y el medio se dispersan bajo el peso del cubreobjetos al microscopio estereoscópico, baje aún más el cubreobjetos sobre la superficie de los cerebros eliminando el medio en exceso con una mecha de papel absorbente hasta que el cubreobjetos toque los cerebros; no sobremequé, ya que esto causaría distorsión del tejido o explosión del cerebro para imaginar el neuroblasto ventral anterial. El cubreobjetos debe moverse ligeramente en la dirección de las puntas del cordón nervioso ventral.Esto hace que el cerebro gire, lo que coloca los lóbulos cerebrales en contacto directo con la lámina de cubierta para facilitar la obtención de imágenes, y posteriormente se sella la cámara mediante la lámina de cubierta con una pequeña cantidad de aceite de halo carbono. Se debe minimizar el exceso de aceite que se filtra desde la lámina de cubierta y absorberlo con un tejido.Antes de la adquisición de imágenes, agregue una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos justo encima de los cerebros montados para ayudar a centrar el objetivo directamente por encima de la muestra. Coloque suavemente la muestra montada en el incubador del portaobjetos ajustado a 25 grados Celsius y cubra la cámara con su tapa.A continuación, localice el neuroblasto del cerebro central utilizando luz transmitida, enfocando las grandes células redondas que se encuentran en las áreas centrales y mediales de los lóbulos ópticos. Una vez ubicado, realice exposiciones rápidas usando el confocal para determinar la ubicación y profundidad adecuadas del neuroblasto. Limite la profundidad a los primeros 10 a 15 micrómetros.Ajuste según sea necesario y tome otra imagen de prueba. Para eliminar la deriva axial, utilice un dispositivo de enfoque automático continuo que emplee un LED infrarrojo o corrija manualmente el plano focal. Una vez identificado el neuroblasto de interés, optimice todos los parámetros antes de la adquisición de imágenes.Ahora, obtenga imágenes del neuroblasto completo recopilando entre 12 y 14 imágenes separadas por un micrómetro en el eje Z. Ajuste la resolución temporal para capturar uno o múltiples ciclos celulares del mismo neuroblasto. Utilice intervalos de 10 a 32 segundos para la obtención de imágenes de un solo ciclo celular e intervalos de uno a tres minutos para múltiples ciclos celulares.A continuación, confirme que la muestra está sana mediante el monitoreo de la duración de la mitosis. Si la mitosis dura más de 15 minutos, pase a otro cerebro. Un cerebro sano mostrará muchos neuroblastos dentro del mismo campo de visión, realizando varias rondas de mitosis.Una vez finalizada la adquisición de imágenes, desarme la cámara de incubación y deseche todo excepto los recipientes de cultivo permeables al gas. Enjuague la superficie del recipiente de cultivo con etanol al 95 % y limpie el aceite con un tejido. Repita el procedimiento otras dos veces.Se muestra aquí la imagen en vivo de las divisiones de células madre neuroblásticas en preparaciones de montaje completo. Estas son imágenes de lapso de tiempo de un único ciclo celular de un neuroblasto que expresa GFP Mosin para un análisis celular detallado, en las que se captura un solo ciclo celular con intervalos inferiores a 1/32 del tiempo total. Y estas son las imágenes de lapso de tiempo de ciclos sucesivos de división celular de un neuroblasto que expresa tanto G-F-P-M-O como un marcador de centrosoma etiquetado con GFP.Para obtener imágenes de múltiples ciclos celulares de neuroblastos. Por lo general, se obtienen imágenes de los cerebros a intervalos de tiempo de uno a tres minutos durante un período de dos a tres horas. Aquí se muestran las proyecciones confocales de células madre fijadas procedentes de preparaciones montadas en casa.Para obtener imágenes de todos los neuroblastos ubicados en ambos lóbulos ópticos, se utiliza un aumento de 20 x. Este análisis es particularmente útil para examinar la morfología general del cerebro y para cuantificar el número de neuroblastos. La mayoría de los neuroblastos de un solo lóbulo óptico puede visualizarse con un aumento de 40 x.Para un análisis celular detallado de unos pocos neuroblastos, debe utilizarse una ampliación de 100x. Este neuroblasto mutante muestra múltiples centrosomas en cada polo del huso. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar el daño por luz al limitar la cantidad de luz que incide sobre la Muestra.Esta técnica de obtención de imágenes de divisiones de neuroblastos vivos en preparaciones de montaje completo ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la biología de células madre exploren la división celular asimétrica en el contexto nativo vivo del cerebro en desarrollo de Drosophila.

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Se describe el procedimiento para preparar...

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

Aquí se presenta un protocolo de montaje para...

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)El video muestra una técnica de imagen en vivo para estudiar el patrón de ojos en una pupa de Drosophila melanogaster. Los marcadores marcados con proteína fluorescente verde (GFP) permiten la visualización de la organización y diferenciación celular durante la formación de la estructura ocular en desarrollo.

Imágenes en vivo del ojo de la pupa de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia

Aquí se describe un método eficaz para estudiar la dinámica de aclaramiento celular...

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Aquí, describimos el método que empleamos para crear imágenes de filopodia dendrítica altamente móviles en una preparación en vivo del cerebro larvario Drosophila, y el protocolo que desarrollamos para cuantificar conjuntos de datos de imágenes 3D de lapso de tiempo para evaluaciones cuantitativas de la dendrita dinámica en el desarrollo de neuronas.

Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar imágenes en vivo de la división asimétrica de las células madre de la línea germinal (GSC) en el nicho ovárico de Drosophila. Utilizamos una línea transgénica que expresa de forma ubicua una fusión de proteína verde fluorescente (GFP) de la proteína espectrosómica Par-1.

Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster

Aprende a realizar imágenes en vivo de neuroblastos en cerebros intactos de larvas de Drosophila. Este protocolo utiliza microdissección fina y microscopía confocal para estudiar divisiones asimétricas de células madre neurales.

Imágenes en vivo de

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