Una guía para En vivo Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

El objetivo general del siguiente experimento es obtener registros extracelulares de una sola unidad de alta calidad a partir de interneuronas corticales en ratones que expresan el canal rootin two. Esto se logra haciendo avanzar un electrodo de registro de alta impedancia a través del tejido para identificar las neuronas internas de las respuestas de aumento a los pulsos de luz azul. La señal eléctrica se monitorea para detectar cambios que indiquen la tasa de avance adecuada y la probabilidad de obtener un registro estable y bien aislado.

Si no se puede lograr un buen aislamiento de una sola unidad o, por el contrario, rara vez se encuentran neuronas sensibles a la luz, reemplace el electrodo de registro. Los resultados muestran la fiabilidad de las respuestas de la luz identificada ópticamente en las neuronas y la relación señal-ruido típica obtenida con esta estrategia. El enfoque de fotoestimulación es una forma accesible y económica de dirigirse a tipos de células identificadas genéticamente utilizando un amplificador extracelular estándar y luz azul.

Esta es nuestra estrategia para proxenetizar neuronas internas específicas en anestesia de la corteza auditiva, pero los puntos más generales se aplican a otras áreas corticales que los tipos de células dispersas para comenzar este procedimiento. Después de que el animal haya sido anestesiado con un cóctel de ketamina a través de una inyección intraperitoneal, colóquelo en un aparato estereotáxico u otro aparato de sujeción de la cabeza, asegúrese de que el cráneo esté bien asegurado. Esto es esencial para mantener estables las grabaciones de una sola célula.

A continuación, aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad y mantener la temperatura corporal del animal a 37 grados centígrados para realizar un drenaje esternal CI para una mayor estabilidad de registro, extraiga el tejido de la parte posterior del cráneo con una hoja de bisturí para exponer la magna del esternón CI. A continuación, haz una pequeña muesca en la dora con la punta de la cuchilla para drenar el líquido cefalorraquídeo. Ahora, con el bisturí, realice una pequeña craneotomía sobre el área cortical de interés.

Después de eso, retire la duramadre, luego cubra la corteza expuesta con la capa de aros calientes. Mantenga los agros húmedos con solución salina. Prepare un electrodo de soporte de lenguas.

Pegue el electrodo a un tubo capilar de vidrio con superpegamento y acelerador. Luego agregue un tubo termorretráctil para mayor agarre. Después, monte el electrodo en un manipulador de micrómetros motorizado o hidráulico y configúrelo para que se desplace ortogonal a la superficie cortical.

Deslice un cable de tierra debajo de la piel contra el cráneo. Evite el contacto con los músculos del costado de la cabeza y la parte posterior del cuello, ya que pueden generar artefactos miográficos. La señal eléctrica se amplifica utilizando un amplificador extracelular adecuado para la grabación de una sola unidad, preferiblemente equipado con un modo de verificación de impedancia.

La actividad de aumento continua se monitorea con dos osciloscopios y un conjunto de altavoces autoamplificados. Ahora avance el electrodo a través del agro y pruebe su impedancia para asegurarse de que esté dentro de los siete a 14 mega ohmios. Cuando la punta rompe la superficie de la corteza, ponga a cero esta posición en el manipulador de micras.

Para estimar mejor la profundidad del registro, confirme visualmente que la punta del electrodo sale de la superficie cortical a una profundidad de cero. Al retirar el electrodo al final de una penetración en la corteza auditiva para asegurarse de que este punto de ajuste cero corresponde al nivel de la corteza, monitorea los potenciales de campo evocados por el estímulo. Mientras avanza el electrodo a través de los primeros cientos de micrómetros de tejido, confirme que la polaridad del potencial de campo local se invierte alrededor de una profundidad de 100 micrómetros.

A continuación, monte una fibra óptica acoplada a una fuente de luz azul en un micromanipulador manual. Regule la salida de la fuente de luz con la unidad de control capaz de entregar un tren de impulsos TTL de ancho y duración especificados. A continuación, supervise la señal en ambos osciloscopios.

Mida la potencia lumínica total en la punta de la fibra óptica utilizando un medidor de potencia. Utilice este valor para calcular la irradiancia dividiéndola por el área de la sección transversal del núcleo de la fibra. Comience con el valor en el rango de 10 a 15 milivatios por milímetro cuadrado.

Usando el microscopio, coloque la punta de la fibra lo más cerca posible de la superficie del aros. Centre el haz donde el electrodo entrará en el tejido. Ahora compruebe si hay artefactos de luz con el electrodo en el aros.

Produce una tensión de pulso. Elimine cualquier artefacto de luz transitoria reposicionando la fibra óptica en relación con el electrodo para cambiar el ángulo de la luz incidente. Si los artefactos persisten, intente disminuir la potencia de la luz.

A continuación, haga avanzar el electrodo lentamente a través del cerebro a una velocidad de aproximadamente un micrómetro por segundo. Utilice un osciloscopio para monitorear la actividad continua del electrodo. Utilice el otro para activar los pulsos láser.

Escuche el débil hash de los picos evocados por la luz en el monitor de audio, lo que indica que el electrodo se está acercando a una celda positiva de opsina del canal. Luego, disminuya la velocidad de avance tan pronto como la luz evoque. Los picos son lo suficientemente grandes como para ser activados individualmente en el osciloscopio.

Empieza a hacerlo. Ajuste una escala en el eje horizontal para observar la forma exacta de la forma de onda del pico. En este punto, deje de avanzar el electrodo y espere a que se asiente en el tejido.

Esto es fundamental para una grabación estable. Después de varios minutos, si la relación señal/ruido no ha mejorado, avance cinco micrómetros más y espere. Nuevamente, repita este proceso hasta que el pico o el valle de un potencial de acción pueda capturarse de manera confiable con un umbral de voltaje.

Ajústelo muy por encima del ruido de fondo mientras graba. Supervise la actividad en curso en el primer osciloscopio. Al mismo tiempo, preste atención al tamaño y la forma de los picos con el segundo osciloscopio y observe la calidad de su sonido en el altavoz.

Escuche atentamente los cambios bruscos, que indican que la célula se está acercando demasiado al electrodo o se está alejando. Si los picos se vuelven grandes y se deforman, retire el electrodo. Si se hacen más pequeños, avance el electrodo.

Muévase lentamente en pasos de dos micrómetros para confirmar la calidad de los picos. Superponga toda la forma de onda del pico en una amplia gama de valores de umbral. Solo se debe ver una forma de espiga consistente de altura uniforme.

La mayoría de las células PV positivas pueden mantener el disparo durante un segundo completo. Si la señal se contamina con picos de una neurona vecina, avance el electrodo y busque una nueva célula en cada penetración, baje el electrodo a través de toda la profundidad de la corteza. Si no se encuentran neuronas que respondan a la luz después de muchas penetraciones o, por el contrario, las grabaciones se contaminan rutinariamente con picos del canal vecino, células negativas de opsina, pruebe con un nuevo electrodo.

Esta figura muestra ejemplos de grabaciones de tres tipos de interneuronas identificadas ópticamente. Las células responden al tren de pulsos de búsqueda con una ráfaga fiable de picos. Aquí se muestran picos de línea de 100 tr y la forma de onda interpolada promedio.

Estos gráficos de lista muestran el tiempo constante de los picos evocados por la luz. Las primeras latencias de pico para una muestra de potencia. Aquí se presentan las interneuronas volin positivas.

El enfoque de la fotoestimulación es conceptualmente muy simple, pero puede ser sorprendentemente desafiante y de bajo rendimiento. En la práctica. Los electrodos de parche de vidrio están fuertemente sesgados hacia las neuronas parametálicas, por lo que no se obtienen neuronas internas muy a menudo.

Por otro lado, con los tetros, se obtienen muchas interneuronas que responden a la luz, pero los picos son pequeños y hay muchas formas de onda superpuestas, por lo que es muy difícil clasificarlas de forma fiable en unidades individuales. Tratamos de lograr esto de muchas maneras diferentes, y para las neuronas internas, descubrimos que estos electrodos afilados de 10 a 14 mega electrodos lograron el equilibrio correcto en términos de radio de escucha, que debe ser lo suficientemente grande como para detectar la luz de los picos de roble desde la distancia, pero lo suficientemente restringido como para lograr un buen aislamiento de una sola unidad. Sin embargo, hay algo de vudú en ello.

Si no puede lograr eso, se ahorrará mucho tiempo simplemente deshaciéndose de ese electrodo y pasando al siguiente hasta que encuentre uno que funcione.