Name: Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a visualizar la migración transendotelial de neutrófilos bajo flujo fisiológico usando microscopía confocal. Este método permite estudiar la dinámica de proteínas de unión como VE-cadherina y PECAM-1 en tiempo real.

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Los autores agradecen al Dr. P.L. Hordijk por leer críticamente el manuscrito. El DEA cuenta con el apoyo de una beca de la Fundación Landsteiner para la Investigación en Transfusiones de Sangre (LSBR) (subvención #1028). JK cuenta con el apoyo de la Fundación Holandesa del Corazón (2005T3901). JDvB es miembro del NHS Dekker (subvención #2005T039).

Los neutrófilos se aislaron a partir de voluntarios sanos que han firmado un consentimiento informado. La investigación ha sido realizada de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales para el bienestar humano. 1. Plating y mantenimiento de umbilical humana células endoteliales de vena <ol><li> Células de cultivo endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) según las instrucciones del fabricante. Grow HUVECs en fibronectina (FN) presenta el revestimiento platos (10 g / ml, disueltos en agua desmineralizada) usando los medios de comunicación (medio basal endotelial (EBM-2) medio suplementado con medio de crecimiento endotelial (EGM-2) SingleQuots). Utilice cultivo celular entre 4-8 pasajes para los experimentos. </li><li> Día 1: Escudo de flujo cámaras con 100 l de fibronectina (10 g / ml en PBS) durante al menos 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Día 2: Cuando las células alcanzan 80-90% de confluencia, las células trypsinize después de un lavado cuidadoso con solución salina tamponada con fosfato RT (PBS) pH 7,4, centrifugar a 800 xg y resuspender a 800.000 células / ml utilizando los medios de comunicación. Placa de 80.000 células en cada canal de flujo de las cámaras recubiertas con FN y suavemente pipeta la suspensión celular arriba y abajo. Cultura O / N en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Día 3: Actualiza los medios de comunicación en la diapositiva flujo cámaras inclinando suavemente el portaobjetos en un ángulo de 45 °. (Véase la Figura 1A). NOTA: Se recomienda para eliminar sólo los medios de comunicación en los embalses y no en el propio canal. La eliminación de los medios de comunicación en los canales puede resultar en la pérdida de células endoteliales y la muerte debido a la fuerza de arrastre de los medios de comunicación causados ​​por pipeteo. </li><li> Compruebe por microscopía de contraste de fase si las células endoteliales se han formado una monocapa (es decir, 100% de confluencia). Si las células no son 100% confluentes, cambiar los medios de comunicación dos veces al día hasta que alcanzan el 100% de confluencia. </li><li> Una vez que las células han alcanzado la confluencia, estimular las células con los medios de comunicación (véase el paso1,1) que contiene mediador inflamatorio (TNF-α (10 ng / ml)). Estimular HUVECs O / N (es decir, 12 horas) con resultados TNF-α en un fenotipo inflamatorio del endotelio, es decir., Sobre regulación de moléculas de adhesión celular tales como ICAM-1 y VCAM-1 13. </li></ol> 2. leucocitos polimorfonucleares Aislamiento uso de gradientes de Percoll <ol><li> Preparar N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanosulfónico (HEPES) -buffer (en adelante denominado: flujo-buffer) antes de aislar los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Flow-tampón se utiliza para lavar PMNs aislados y como tampón en el ensayo de flujo. Para preparar flujo-buffer: diluir 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g de HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) en 1 L de agua desmineralizada y se ajusta a pH 7,4 (esta población puede mantenerse a 4 ° C durante varias semanas). </li><li> Añadir frescos 100 l 1 M CaCl 2 y #160; (1 mM), 2,5 ml de albúmina humana a partir de una concentración de 200 g / L de stock (0,5% v / v) y 0,1 g de glucosa a 100 ml (0,1% w / v) de tampón de flujo. A continuación, un filtrado del búfer de flujo utilizando un filtro de 0,45 micras. NOTA: Este-buffer de flujo tiene que estar preparado fresco para cada experimento. </li><li> Antes de aislamiento de PMN, preparar la solución de 10% de citrato trisódico (TNC) en PBS, pH 7,4. </li><li> Recoger 20 ml de sangre total en vacuettes heparina de sodio de un voluntario sano. Diluir la sangre completa 1: 1 con 10% de PBS / TNC en tubos de 50 ml y 20 ml de pipeta sangre diluida cuidadosamente en 12,5 ml de Percoll (un 23% (w / w) solución coloidal en agua con una densidad de 1,130 g / ml) en un nuevo tubo de 50 ml. Con cuidado, coloque los tubos en la centrífuga y centrifugar durante 20 min a 800 xg con baja aceleración y ninguna rotura puesta a RT. NOTA: Cuando la adición de la sangre diluida a la Percoll, inclinar el tubo de Percoll que contiene en un ángulo de 45 ° y la pipeta suavemente la sangre diluida en el ingenio del tuboh el ajuste más lento pipeta chico. </li><li> Eliminar todo el líquido y posteriormente llenar el tubo con eritrocitos buffer de lisis enfriado con hielo (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] y 18,5 mg de EDTA (Triplex III) [0,1 mM] a 500 ml de helado H 2 O) para lisar los eritrocitos. Deje el tubo en hielo, de vez en cuando invirtiendo el tubo, hasta que la suspensión se vuelve rojo oscuro, seguido de centrifugación 500 xg durante 5 min a 4 ° C con descansos habilitados. NOTA: La fracción de sedimento contiene los PMN (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) junto con los eritrocitos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar pellet dos veces en buffer de lisis enfriado con hielo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento con tampón de flujo a temperatura ambiente y determinar la concentración de PMNs utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Suspender los PMNs en el flujo-tampón a 1 x 10 6 células / ml y mantenerla en RT. </li></ol> 3. Etiquetado de Endotelial Junctional VE-cadherina y PECAM-1 <ol><li> Añadir el anticuerpo 647 PECAM Alexa Fluor (clon WM59) a una dilución 1: 100 y el anticuerpo VE-cadherina-FITC independiente de calcio (clon 55-7H1) en un medio de cultivo 1:50 dilución a HUVEC (ver paso 1.1), e incubar durante 30 min antes de iniciar el experimento de flujo de visualizar la dinámica de unión de células endoteliales durante la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo fisiológicas. NOTA: Antes de añadir los anticuerpos directamente etiquetados a los flujos de cámaras, asegúrese de que el volumen de cada canal no exceda de 100 l. Esto ayuda a mantener los gastos de anticuerpo tan bajo como sea posible. </li></ol> 4. PMN TEM Ensayo de Flujo Bajo <ol><li> Coloque los PMNs en un baño de agua durante 15 min a 37 ° C antes de su inyección en el sistema de flujo. </li><li> Conecte el tubo a un flujo-cámara vacía y llénela con agua caliente (por ejemplo, 37 ° C) Caudal-buffer (véase el paso 4.3) para evitar la formación de burbujas de aire al configurar ªsistema de flujo e. </li><li> Conectar un lado de una cámara vacía de flujo para el sistema de flujo de la bomba de jeringa mediante el uso de tubo de silicona que contiene una jeringa de 20 ml, y poner la cámara de flujo en la platina del microscopio. </li><li> Conectar el otro lado de un flujo de la cámara de vacío al matraz depósito lleno de 37 ° C-tampón de flujo (Figura 1B) y comenzar la bomba de jeringa con el fin de llenar todo el tubo con tampón de flujo. La bomba se tire el flujo de tampón desde el depósito a través de la cámara de flujo dentro de la jeringa. NOTA: Este tubo también contiene un puerto de inyección en línea Luer, que permite a los PMNs a inyectar con una aguja en un experimento de funcionamiento sin detener el flujo y la creación de burbujas de aire. </li><li> Vuelva a colocar el flujo de la cámara de vacío con la cámara de flujo que contiene las HUVEC tratadas con TNF-α, conecte el tubo que contiene el flujo-buffer-y colocarla en la platina del microscopio (Figura 1C). Pellizque de los tubos antes de desconectar y volver a conectar elm a las cámaras que contienen el HUVECs, ya que no pellizcando puede resultar en la formación de burbujas de aire dentro de la tubería y / o de flujo cámaras. </li><li> Ajustar la velocidad de flujo a 1 dyn / cm 2, de acuerdo con la velocidad de flujo fisiológico en vénulas capilares enviar (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Registro de contraste de interferencia diferencial (DIC), FITC (488 nm) y Alexa Fluor 647 (647 nm) simultáneamente usando un microscopio de escaneo láser confocal. </li><li> Inyectar los PMNs (paso 4.1) lentamente en el sistema de flujo a través de la in-line Luer puerto de inyección (Figura 1D) utilizando jeringuillas de 1 ml. </li><li> Después de unos minutos, aparecen los leucocitos, se adhieren, y transmigrar. Pare el experimento en cualquier momento deseado desconectando el tubo de la cámara de flujo y fijador de pipeteado (3,7% de formaldehído en PBS) en la cámara de flujo-. Permitir la fijación durante 10 min, seguido de lavado con PBS. Los datos se analizan usando el software de formación de imágenes (ver materiales y equipos de mesa). NOTA: Realice la que experimento usando un microscopio de barrido de láser confocal equipado con una cámara climática con una temperatura constante a 37 ° C, 5% de CO 2, y un objetivo 63X de aceite. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Para este protocolo, es crítico para evitar la formación de burbujas de aire en el flujo de cámaras, ya que esto dará como resultado la apoptosis celular y una monocapa interrumpido. Para evitar esto, queremos destacar que prestar especial interés a las medidas 4.2 y 4.5, donde los tubos están conectadas al flujo de cámaras. Otro paso crítico en el protocolo es el cebado de los PMNs que se mantienen a temperatura ambiente, mediante su incubación durante 15-30 min a 37 ° C antes de la inyección a la cámara de flujo (paso 4.1). Esto resulta en el cebado de las integrinas de leucocitos, lo que les permite adherirse a las moléculas de adhesión tales como ICAM-1 o VCAM-1 en el endotelio. Este protocolo no se limita a estudiar la transmigración de neutrófilos. Se pueden usar también otros tipos de leucocitos tales como monocitos o linfocitos. Tenga en cuenta que el paso 4.1, es decir, cebar los leucocitos pueden diferir entre los tipos de leucocitos. También, se pueden utilizar otros tipos de células endoteliales. Para ello, sigue siendo críticapara estimular las células endoteliales con estímulos inflamatorios adecuados, tales como TNF-α o IL-1β. Si los neutrófilos no responden de transmigración, se puede considerar el tratamiento de la brevemente los neutrófilos (5 min) con N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (fMLP) péptido 16. Esto estimulará los neutrófilos, en particular, sus integrinas, aún más, haciéndolos más propensos a adherirse al endotelio. Por lo general se usa 1 dyn / cm 2 velocidad de flujo. Esta velocidad de flujo se mide en vénulas post-capilares, sitios donde se produce más migración transendotelial de leucocitos 17. Uso de las cámaras de flujo descritos, es posible aumentar el flujo de velocidad de hasta 10 dyn / cm 2. Sin embargo, no se recomienda aumentar la cizalla más. Puede dar lugar a fugas no deseadas de la tubería y el desprendimiento de las células del flujo-cámara. Los resultados descritos en la Figura 3 indican que estosanticuerpos se pueden usar para visualizar y estudiar la dinámica de endoteliales uniones célula-célula durante la diapedesis de leucocitos. En particular, además de los ensayos de transmigración existentes este protocolo permite discriminar paracelular de la migración transcelular en condiciones de flujo fisiológicas en tiempo real. Dado que los anticuerpos se tiñen las uniones célula-célula, se puede marcar el número de leucocitos que cruzan VE-cadherina / uniones PECAM-1-positivas frente no positiva VE-cadherina / PECAM-1 sitios. De esta manera, la migración transcelular puede ser discriminado de la migración paracelular. Es importante destacar que estos anticuerpos no interfieren con la función de las proteínas que se unen a: el anticuerpo PECAM-1 utilizado en este estudio está dirigido contra el segundo dominio extracelular. Las células endoteliales que se colocaron en placas en presencia del anticuerpo no mostró defectos en la propagación o la formación de una monocapa, lo que sugiere que el anticuerpo, al menos, no lo hizointerferir con las interacciones entre las células endoteliales homotípicos. Además de eso, ambos anticuerpos no afectan a la capacidad de los neutrófilos para migrar a través de la monocapa endotelial. Además, el número de neutrófilos que transmigrar través de la monocapa endotelial en la ausencia o presencia de los anticuerpos no se altera (datos no mostrados). Es importante destacar que, microscopía confocal de barrido láser nos da la posibilidad de grabar diferentes canales fluorescentes y DIC simultáneamente. Por lo tanto, este ensayo permite estudiar la dinámica de VE-cadherina y PECAM-1 al mismo tiempo cuando una de neutrófilos cruza la unión célula-célula endotelial y ayudará a entender por qué los leucocitos eligen una ruta sobre la otra, es decir, paracelular frente transcelular.

Eficiente y muy controlado migración transendotelial de leucocitos (TEM) es de vital importancia en los procesos fisiológicos tales como la vigilancia inmune y la inflamación aguda. Sin embargo, bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, TEM descontrolado y excesivo se observó resultando en enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide, aterosclerosis, asma). También durante la metástasis de células tumorales, el proceso de migración transendotelial es instrumental para las células tumorales para dejar la circulación de metástasis 1-3. Con el fin de interferir específicamente con leucocitos excesivo o TEM de células tumorales, se requiere un conocimiento detallado de la regulación de este proceso. Se cree que el proceso de TEM se produce a través de diferentes pasos. Estudios seminales, crítica hace dos décadas por Butcher y Springer, llevaron al modelo de múltiples pasos que describe el proceso de TEM 4,5. Este modelo sigue siendo válida, aunque algunos adpasos tradicionales se han incluido 6. Alon et al. Describe la necesidad de la presencia de quimiocinas inmovilizadas sobre la superficie del endotelio 7. Recientemente, se demostró que el propio endotelio genera quimiocinas que se presentan en la superficie apical endotelial 8. Por otra parte, el mismo grupo planteó la importancia de las condiciones de flujo durante TEM 7. Recientemente, varias publicaciones centradas en las dos rutas diferentes leucocitos pueden tomar en la etapa de diapedesis final del TEM. Ellos pueden ir a través de las uniones célula-célula, es decir, la ruta de migración paracelular, o cruzar a través del cuerpo de la célula endotelial, conocida como la ruta de migración transcelular 9. Carman y sus colegas estudiaron estas vías en detalle y llegó a la conclusión de que los leucocitos preferentemente eligen la ruta de migración paracelular (90%) sobre la ruta transcelular (10%) al cruzar una monocapa endotelial de la vena umbilical 10.Sin embargo, cuando se utilizaron células endoteliales de otros orígenes, por ejemplo, el cerebro o la microvasculatura, más leucocitos utilizan la ruta transcelular (30%) 11. El grupo Vestweber mostró recientemente que cuando las uniones célula-célula fueron incapaces de disociar el uno del otro mediante el uso de un knock-in modelo animal, en sustitución endógena VE-cadherina para un VE-cadherina-alfa-catenina quimera, TEM de leucocitos fue bloqueada completamente 12 . Sorprendentemente, los autores notaron que TEM se bloqueó en varios, pero no todos, los tejidos. En general, estos elegantes experimentos indicaron que los leucocitos prefieren la ruta paracelular sobre la ruta transcelular, aunque las señales reguladoras que activan esta decisión aún no se conocen. A pesar de que la mayoría de los leucocitos prefieren la ruta de migración paracelular, todavía es difícil discriminar entre ambas vías. Además de que, a pesar de varios estudios que se centran en el papel de la JUNCT célula-célula endotelialiones, la dinámica de estas uniones, en particular, las proteínas de unión VE-cadherina y PECAM-1, durante el cruce de leucocitos sigue siendo objeto de debate. Hemos desarrollado un ensayo relativamente simple en el que estas moléculas de unión se pueden monitorizar en tiempo real durante la diapedesis de leucocitos en condiciones de flujo fisiológicas usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Estos anticuerpos no interfirieron con o bloquean la integridad de la unión o de la movilidad de las proteínas específicas. Este ensayo nos permite seguir la dinámica de las proteínas de unión durante el proceso de TEM paracelular. Además, este ensayo también permite discriminar entre las rutas de migración de parámetros y transcelulares.

<table><tbody><tr><td>&mu;-Corredera VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Cámara de flujo</td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtro M&nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 20 ml&nbsp;</td><td>BD Discardit II 366296</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 21 g&nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio (NH4Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>medio basal EBM-2 + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Factores de crecimiento</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>medios</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Tubos Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Puerto de inyección Luer en línea&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4&bull; 7H2O)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>clon WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fresenius Kabi&nbsp; Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de potasio (KHCO3)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico trihidrato (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona Tygon 3350</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa&nbsp;</td><td>Número</td><td>de modelo del aparato Harvard 55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>factor de necrosis tumoral</td></tr><tr><td>Citrato trisódico&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Alemania</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>560411</td><td>clon 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales durante neutrófilos transmigración bajo flujo fisiológica

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Durante la inflamación, los leucocitos abandonan la circulación y cruzan el endotelio para luchar contra los patógenos invasores en los tejidos subyacentes. Este proceso se conoce como migración transendotelial de leucocitos. Dos rutas para leucocitos para cruzar la monocapa endotelial se han descrito: la ruta paracelular, es decir, a través de las uniones célula-célula y la ruta transcelular, es decir, a través del cuerpo de la célula endotelial. Sin embargo, ha sido técnicamente difícil discriminar entre el párrafo y la ruta transcelular. Hemos desarrollado un sencillo ensayo in vitro para estudiar la distribución de endógeno VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración transendotelial de neutrófilos bajo condiciones de flujo fisiológicas. Antes de la perfusión de los neutrófilos, las células endoteliales se trataron brevemente con anticuerpos marcados con fluorescencia contra VE-cadherina y PECAM-1. Estos anticuerpos no interfieren con la función de ambas proteínas, como se determinó por la célula-Substra eléctricade detección de impedancia TE y FRAP mediciones. Utilizando este ensayo, hemos sido capaces de seguir la distribución de los endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración transendotelial bajo condiciones de flujo y discrimina entre los parámetros y migración transcelular rutas de los leucocitos a través del endotelio.

Primero probamos si los anticuerpos no interfieren con la función de barrera del endotelio. Se midió la resistencia de monocapas endoteliales mediante el uso de detector de impedancia de la célula-sustrato eléctrica (ECIS). Para más detalles, véase Van Buul et al. 13 se observó ningún cambio en la resistencia cuando se añadió el anticuerpo anti-VE-cadherina marcado con fluorescencia de las células (Figura 2A). Un anticuerpo anti-VE-cadherina que está bien reconocida para bloquear VE-cadherina función reduce drásticamente la resistencia (Figura 2A). Además, los anticuerpos utilizados para la formación de imágenes no alteran la dinámica de la VE-cadherina, como se evaluó mediante la medición de la recuperación de fluorescencia después de la foto-blanqueamiento (FRAP) de VE-cadherina-GFP (Figura 2B). Después de 1-2 minutos, los neutrófilos se adhirieron a la monocapa endotelial activada como podría ser visualizado en el canal de DIC (Figura 3A). Después de arrastrarse por 5-30 en síc, la gran mayoría de los neutrófilos transmigrado través de la monocapa endotelial a través de las uniones célula-célula que se marcaron con los anticuerpos dirigidos contra PECAM-1 y VE-cadherina. Durante el proceso de diapedesis, la distribución de la VE-cadherina y PECAM-1 se siguió en tiempo real (Figura 3B). En los sitios de diapedesis de neutrófilos, VE-cadherina fue interrumpida localmente y PECAM-1 mostró una estructura más similar a un anillo. Después de la terminación de diapedesis, las uniones estrechas y VE-cadherina y PECAM-1 claramente reubicados en los sitios de diapedesis (Figura 3C). Tenga en cuenta que las partes del anticuerpo anti-PECAM-1 se detectaron en la superficie del neutrófilo una vez que el de neutrófilos alcanza el lado basolateral del endotelio. Sin embargo, esto no impidió que los neutrófilos de cruzar el endotelio. La dinámica observada de VE-cadherina en tiempo real durante la migración transendotelial de neutrófilos estaban de acuerdo con la obra de Shaw y colegas quemostró, mediante microscopía confocal y la VE-cadherina-GFP-transfectadas las células endoteliales, que VE-cadherina-GFP difundido lateralmente cuando leucocitos cruzaron las uniones entre células endoteliales 14. También trabajar por Su y compañeros de trabajo subrayaron nuestras observaciones de PECAM-1. Ellos mostraron difusión que, junto al lateral VE-cadherina tras el paso de leucocitos, PECAM-1 se redistribuyó localmente en un anillo alrededor de la transmigración de neutrófilos 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> Figura 1 En la cámara de flujo vitro. (A) La flecha indica el depósito de la que el medio tiene que ser renovado. (B) Tubo de silicona que conecta la cámara de flujo con la in-line puerto de inyección Luer utilizado para inyectar PMN sin desconectar el tubo (punta de flecha). (C) Conexiónreflejo de un flujo-cámara vacía al matraz depósito lleno de 37 ° C el flujo-buffer (punta de flecha). (D) La conexión de la cámara de flujo con las HUVECs TNF-α-tratado a la tubería de flujo que contiene-buffer-y se coloca en la platina del microscopio (punta de flecha). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2. VE-cadherina anticuerpos no interfieren con la dinámica o la función de unión. (A) Impedancia de monocapa de células endoteliales se mide usando ECIS. Eje Y se expresa en ohmios de impedancia y el eje x representa el tiempo en horas. VE-cadherina anticuerpo clon 55-7H1, marcado con Alexa647 (línea azul) o isotipo IgG control-Alexa647 (línea roja) no alteran la impedancia monocapa de células endoteliales, mientras que la VE-cadherina bloqueando CL75 anticuerpo (línea de color negro) se reduce la impedancia . (B <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3. VE-cadherina y PECAM-1 de distribución durante TEM de neutrófilos en tiempo real. (A) Neutrófilos (marcado con la línea blanca) que se adhiere sobre el endotelio y el cruce de la unión célula-célula sin afectar a la distribución de la VE-cadherina y PECAM -1. (B) de neutrófilos cruzar la monocapa endotelial a través de las uniones célula-célula. Una dispersión local de la VE-cadherina y PECAM-1 se pueden observar cuando una de neutrófilos sobresale a través de las uniones célula-célula. Línea blanca ilustra presencia de neutrófilos todavía en la parte superior del endotelio. La línea amarilla muestra Tha membrana de neutrófilost ya está por debajo del endotelio. (C) de neutrófilos ha cruzado completamente la monocapa endotelial. VE-cadherina y PECAM-1 son reubicados en sitios de diapedesis. Línea amarilla ilustra las fronteras de los neutrófilos transmigrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

El objetivo general de este procedimiento es seguir la distribución de la unión endógena, terina y pcam uno durante la migración transendotelial de leucocitos en condiciones de flujo fisiológico. Esto se logra aislando primero los leucocitos polimorfonucleares o PMN de la sangre total de voluntarios sanos utilizando un gradiente proco. El segundo paso es añadir anticuerpos marcados con fluorescencia a una monocapa de células endoteliales de la vena umbilical humana estimulada con TNF alfa cultivada en portaobjetos de flujo 30 minutos antes de comenzar el experimento de flujo.Esto permitirá la visualización de la dinámica de unión de las células endoteliales durante la transmigración de neutrófilos en condiciones de flujo fisiológico. A continuación, el portaobjetos de flujo que contiene las células endoteliales de la vena umbilical humana estimuladas con TNF alfa marcadas con fluorescencia se conecta al sistema de flujo y se coloca en la platina del microscopio. La bomba extraerá el tampón de flujo del depósito a través de la cámara de flujo hacia la jeringa.El paso final es inyectar los PMN lentamente en el sistema de flujo a través del puerto de inyección. En última instancia, los PMN se visualizan utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Al cabo de unos minutos, los leucocitos aparecen, se adhieren y transmigran.El experimento se puede detener en cualquier momento que se desee. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes como los ensayos de transmigración estática, es que con esta técnica se puede estudiar la adherencia y la transmigración en la vida real en condiciones de flujo fisiológico. Esto nos ayudará a entender por qué los leucocitos eligen una raíz sobre la otra, por lo que la PGA frente a la migración transcelular.Hacemos esto visualizando las uniones celulares con anticuerpos marcados con fluorescencia. Las células endoteliales de la vena umbilical humana o HU X para este experimento se cultivan de acuerdo con las instrucciones del fabricante en placas recubiertas de fibronectina utilizando medios suplementados con crecimiento endotelial. Medio. El cultivo celular se utiliza entre cuatro a ocho pasos cuando las células alcanzan el 80 al 90%Confluencia, lávelas cuidadosamente con PBS a temperatura ambiente a pH 7.4 y luego tripsina es las células después de tripsina y centrifugación.Suspendemos a 800.000 células por mililitro utilizando medios. El experimento utiliza cámaras de flujo que han sido recubiertas con fibronectina en la placa del día anterior. 80.000 células en cada uno de los canales de las cámaras de flujo codificadas por fibronectina y pipetean suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo durante la noche en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono al día siguiente.Refresque el medio en el portaobjetos de la cámara de flujo inclinando suavemente el portaobjetos en un ángulo de 45 grados. Se recomienda eliminar solo los medios en los depósitos y no en el canal en sí. La eliminación de los medios en los canales puede provocar la pérdida y muerte de las células endoteliales debido a la fuerza de arrastre de los medios causada por el pipeteo.Comprobar mediante microscopía de contraste de fases si las células endoteliales han formado una monocapa. Si las celdas no son 100% cofluentes, cambie el medio dos veces al día hasta que alcancen el 100% de confluencia. Una vez que las células han alcanzado el 100% de fluidez, estimule las células con medios que contengan el mediador inflamatorio.La estimulación nocturna del TNF alfa con TNF alfa da lugar a un fenotipo inflamatorio del endotelio IE, una regulación positiva de las moléculas de adhesión celular como ICAM one y VA M1. Antes de aislar leucocitos polimorfonucleares o PMN, prepare un tampón de flujo para lavar PMN aislados y para usar en el ensayo de flujo a 100 mililitros de una solución madre previamente preparada. A 100 microlitros de cloruro de calcio fresco de un molar, 2,5 mililitros de albúmina humana a partir de una concentración de caldo de 200 gramos por litro y 0,1 gramos de glucosa.Filtre el tampón de flujo con un filtro de 0,45 micras. También se prepara una solución de citrato trisódico al 10% o TNC en PBS a pH 7,4 antes del aislamiento de PMN. Las PMN se aislarán de 20 mililitros de sangre total recolectada en una red de heparina de sodio de un voluntario sano.Primero diluya la sangre entera uno a uno con 10% PBST NNC en un tubo de 15 mililitros. A continuación, utilice un pipeteador en la configuración más lenta para pipetear cuidadosamente 20 mililitros de sangre diluida sobre 12,5 mililitros de solución coloidal per co en agua con una densidad de 1,130 gramos por mililitro en un tubo nuevo de 50 mililitros. El tubo que contiene el per coll debe inclinarse en un ángulo de 45 grados durante la adición de la sangre.Coloque cuidadosamente los tubos en la centrífuga y gire a temperatura ambiente durante 20 minutos a 800 Gs con baja aceleración y con los frenos desactivados cuando se complete la centrifugación. Retire todo el líquido y llene cada tubo con tampón de lisis de eritrocitos helado para alisar los eritrocitos. Deje los tubos en hielo, invirtiéndolos de vez en cuando hasta que la suspensión se vuelva centrífuga de color rojo oscuro a 500 GS durante cinco minutos a cuatro grados centígrados con los frenos habilitados.La fracción de pellet resultante contiene los PMNs Junto con los eritrocitos, retire el sobrenadante y lave el pellet dos veces con hielo. Tampón de lisis en frío a 500 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet con tampón de flujo a temperatura ambiente y determine la concentración de PMN utilizando un contador de celdas automatizado.Por último, suspenda las PMN en el tampón de flujo a una vez de 10 a las seis celdas por mililitro y manténgalas a temperatura ambiente para etiquetar la unión endotelial VA, cadherina y pcam uno. Añadir el anticuerpo PCAM LOR 6 47 en una dilución de uno a 100 y el anticuerpo FE cadherina ZI independiente del calcio en una dilución de uno a 50 en el medio de cultivo de VE en la cámara de flujo e incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para preparar los PMN para el ensayo, colóquelos en un baño de agua durante 15 minutos a 37 grados Celsius antes de inyectarlos en el sistema de flujo.Conecte la tubería a una cámara de flujo vacía y llénela con un tampón de flujo caliente para evitar la formación de burbujas de aire. Al configurar el sistema de flujo. Con un tubo de silicona, conecte un lado de la cámara de flujo vacía al sistema de flujo de la bomba de jeringa que contiene una jeringa de 20 mililitros.Coloque la cámara de flujo en la platina del microscopio. El ensayo se realizará utilizando un microscopio de barrido láser confocal equipado con el objetivo de aceite 63 x y una cámara climática ajustada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Conecte el otro lado de la cámara de flujo vacía al matraz del depósito lleno de tampón de flujo de 37 grados Celsius y encienda la bomba de jeringa para llenar toda la tubería con tampón de flujo, la bomba extraerá el tampón de flujo del depósito a través de la cámara de flujo hacia la jeringa.Este tubo también contiene un puerto de inyección de señuelo en línea, que permite inyectar PMN con una aguja en un experimento en curso sin detener el flujo y crear burbujas de aire. A continuación, reemplace la cámara de flujo vacía con la cámara de flujo que contiene VE tratado con TNF alfa y pellizque los tubos antes de desconectarlos y volver a conectarlos a la cámara que contiene el VE.To evitar burbujas de aire en el sistema, es fundamental pellizcar y sujetar los tubos. Al conectar la corredera que contiene las celdas.Coloque la cámara de flujo en la platina del microscopio, ajuste la velocidad del flujo a un centímetro cuadrado de acuerdo con la velocidad del flujo fisiológico en los sistemas postcapilares, que es de uno a cinco dines por centímetro cuadrado de contraste de interferencia diferencial de registro o DIC fite LOR 6 47. Simultáneamente usando una jeringa de un mililitro, inyecte el PMN lentamente en el sistema de flujo a través del puerto de inyección de señuelo en línea. Al cabo de unos minutos, los leucocitos aparecen, se adhieren y transmigran deteniendo el experimento en cualquier momento deseado.Al desconectar el tubo de la cámara de flujo y pipetear el fijador aff en la cámara de flujo, se midió la resistencia de las monocapas endoteliales para probar si los anticuerpos interferían con la función de barrera del endotelio. No se observaron cambios en la resistencia cuando el VE pudo escuchar un clon de anticuerpo 55 7 H uno o se agregó el control de isotipo a las células. Por el contrario, el anticuerpo bloqueante CL 75 redujo drásticamente la resistencia.El análisis de RAP no reveló cambios en la recuperación de fluorescencia en presencia o ausencia del anticuerpo VE CADHERIN 55 7 H uno, lo que indica que el anticuerpo no alteró la dinámica de la distribución de cadherina VE, cadherina VE y pcam uno durante la migración transendotelial de neutrófilos o TEM en tiempo real. El panel superior muestra un neutrófilo delineado en blanco que se adhiere al endotelio y cruza la unión célula a célula sin dañar la distribución de VE coherente y PCAM uno. Durante la diapedesis, se puede observar una dispersión local de VE coherente y P chem cuando un neutrófilo sobresale a través de la célula a las uniones celulares delineadas en blanco es un neutrófilo en la parte superior del endotelio.El contorno amarillo muestra la membrana de los neutrófilos que ya está debajo del endotelio. Una vez finalizada la diapedesis, las uniones se cierran y se reubican en los sitios de la diapedesis. Los bordes de los neutrófilos transmigrados están delineados en amarillo.Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la migración transendotelial de los leucocitos con el fin de responder a preguntas adicionales como si los leucocitos atraviesan el endotelio utilizando la bagga o la raíz transcelular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Este es un método para visualizar adhesión de los leucocitos con el endotelio en cosechados recipientes a presión. La técnica permite el estudio de adhesión vascular en el flujo de corte con diferentes presiones intraluminales hasta 200 mmHg por lo tanto imitan-ción de las condiciones fisiopatológicas de la hipertensión arterial.

Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

En este protocolo, se emplea un ensayo biomimético de microfluidos, que puede reproducir un entorno microvascular fisiológicamente relevante y reproducir toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos, para estudiar las interacciones leucocitarios-células endoteliales en la enfermedad inflamatoria.

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Aprende a visualizar la migración transendotelial de neutrófilos bajo flujo fisiológico usando microscopía confocal. Este método permite estudiar la dinámica de proteínas de unión como VE-cadherina y PECAM-1 en tiempo real.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

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