Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

El objetivo general de este procedimiento es seguir la distribución de la unión endógena, terina y pcam uno durante la migración transendotelial de leucocitos en condiciones de flujo fisiológico. Esto se logra aislando primero los leucocitos polimorfonucleares o PMN de la sangre total de voluntarios sanos utilizando un gradiente proco. El segundo paso es añadir anticuerpos marcados con fluorescencia a una monocapa de células endoteliales de la vena umbilical humana estimulada con TNF alfa cultivada en portaobjetos de flujo 30 minutos antes de comenzar el experimento de flujo.

Esto permitirá la visualización de la dinámica de unión de las células endoteliales durante la transmigración de neutrófilos en condiciones de flujo fisiológico. A continuación, el portaobjetos de flujo que contiene las células endoteliales de la vena umbilical humana estimuladas con TNF alfa marcadas con fluorescencia se conecta al sistema de flujo y se coloca en la platina del microscopio. La bomba extraerá el tampón de flujo del depósito a través de la cámara de flujo hacia la jeringa.

El paso final es inyectar los PMN lentamente en el sistema de flujo a través del puerto de inyección. En última instancia, los PMN se visualizan utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Al cabo de unos minutos, los leucocitos aparecen, se adhieren y transmigran.

El experimento se puede detener en cualquier momento que se desee. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes como los ensayos de transmigración estática, es que con esta técnica se puede estudiar la adherencia y la transmigración en la vida real en condiciones de flujo fisiológico. Esto nos ayudará a entender por qué los leucocitos eligen una raíz sobre la otra, por lo que la PGA frente a la migración transcelular.

Hacemos esto visualizando las uniones celulares con anticuerpos marcados con fluorescencia. Las células endoteliales de la vena umbilical humana o HU X para este experimento se cultivan de acuerdo con las instrucciones del fabricante en placas recubiertas de fibronectina utilizando medios suplementados con crecimiento endotelial. Medio. El cultivo celular se utiliza entre cuatro a ocho pasos cuando las células alcanzan el 80 al 90%Confluencia, lávelas cuidadosamente con PBS a temperatura ambiente a pH 7.4 y luego tripsina es las células después de tripsina y centrifugación.

Suspendemos a 800.000 células por mililitro utilizando medios. El experimento utiliza cámaras de flujo que han sido recubiertas con fibronectina en la placa del día anterior. 80.000 células en cada uno de los canales de las cámaras de flujo codificadas por fibronectina y pipetean suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo durante la noche en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono al día siguiente.

Refresque el medio en el portaobjetos de la cámara de flujo inclinando suavemente el portaobjetos en un ángulo de 45 grados. Se recomienda eliminar solo los medios en los depósitos y no en el canal en sí. La eliminación de los medios en los canales puede provocar la pérdida y muerte de las células endoteliales debido a la fuerza de arrastre de los medios causada por el pipeteo.

Comprobar mediante microscopía de contraste de fases si las células endoteliales han formado una monocapa. Si las celdas no son 100% cofluentes, cambie el medio dos veces al día hasta que alcancen el 100% de confluencia. Una vez que las células han alcanzado el 100% de fluidez, estimule las células con medios que contengan el mediador inflamatorio.

La estimulación nocturna del TNF alfa con TNF alfa da lugar a un fenotipo inflamatorio del endotelio IE, una regulación positiva de las moléculas de adhesión celular como ICAM one y VA M1. Antes de aislar leucocitos polimorfonucleares o PMN, prepare un tampón de flujo para lavar PMN aislados y para usar en el ensayo de flujo a 100 mililitros de una solución madre previamente preparada. A 100 microlitros de cloruro de calcio fresco de un molar, 2,5 mililitros de albúmina humana a partir de una concentración de caldo de 200 gramos por litro y 0,1 gramos de glucosa.

Filtre el tampón de flujo con un filtro de 0,45 micras. También se prepara una solución de citrato trisódico al 10% o TNC en PBS a pH 7,4 antes del aislamiento de PMN. Las PMN se aislarán de 20 mililitros de sangre total recolectada en una red de heparina de sodio de un voluntario sano.

Primero diluya la sangre entera uno a uno con 10% PBST NNC en un tubo de 15 mililitros. A continuación, utilice un pipeteador en la configuración más lenta para pipetear cuidadosamente 20 mililitros de sangre diluida sobre 12,5 mililitros de solución coloidal per co en agua con una densidad de 1,130 gramos por mililitro en un tubo nuevo de 50 mililitros. El tubo que contiene el per coll debe inclinarse en un ángulo de 45 grados durante la adición de la sangre.

Coloque cuidadosamente los tubos en la centrífuga y gire a temperatura ambiente durante 20 minutos a 800 Gs con baja aceleración y con los frenos desactivados cuando se complete la centrifugación. Retire todo el líquido y llene cada tubo con tampón de lisis de eritrocitos helado para alisar los eritrocitos. Deje los tubos en hielo, invirtiéndolos de vez en cuando hasta que la suspensión se vuelva centrífuga de color rojo oscuro a 500 GS durante cinco minutos a cuatro grados centígrados con los frenos habilitados.

La fracción de pellet resultante contiene los PMNs Junto con los eritrocitos, retire el sobrenadante y lave el pellet dos veces con hielo. Tampón de lisis en frío a 500 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet con tampón de flujo a temperatura ambiente y determine la concentración de PMN utilizando un contador de celdas automatizado.

Por último, suspenda las PMN en el tampón de flujo a una vez de 10 a las seis celdas por mililitro y manténgalas a temperatura ambiente para etiquetar la unión endotelial VA, cadherina y pcam uno. Añadir el anticuerpo PCAM LOR 6 47 en una dilución de uno a 100 y el anticuerpo FE cadherina ZI independiente del calcio en una dilución de uno a 50 en el medio de cultivo de VE en la cámara de flujo e incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para preparar los PMN para el ensayo, colóquelos en un baño de agua durante 15 minutos a 37 grados Celsius antes de inyectarlos en el sistema de flujo.

Conecte la tubería a una cámara de flujo vacía y llénela con un tampón de flujo caliente para evitar la formación de burbujas de aire. Al configurar el sistema de flujo. Con un tubo de silicona, conecte un lado de la cámara de flujo vacía al sistema de flujo de la bomba de jeringa que contiene una jeringa de 20 mililitros.

Coloque la cámara de flujo en la platina del microscopio. El ensayo se realizará utilizando un microscopio de barrido láser confocal equipado con el objetivo de aceite 63 x y una cámara climática ajustada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Conecte el otro lado de la cámara de flujo vacía al matraz del depósito lleno de tampón de flujo de 37 grados Celsius y encienda la bomba de jeringa para llenar toda la tubería con tampón de flujo, la bomba extraerá el tampón de flujo del depósito a través de la cámara de flujo hacia la jeringa.

Este tubo también contiene un puerto de inyección de señuelo en línea, que permite inyectar PMN con una aguja en un experimento en curso sin detener el flujo y crear burbujas de aire. A continuación, reemplace la cámara de flujo vacía con la cámara de flujo que contiene VE tratado con TNF alfa y pellizque los tubos antes de desconectarlos y volver a conectarlos a la cámara que contiene el VE.To evitar burbujas de aire en el sistema, es fundamental pellizcar y sujetar los tubos. Al conectar la corredera que contiene las celdas.

Coloque la cámara de flujo en la platina del microscopio, ajuste la velocidad del flujo a un centímetro cuadrado de acuerdo con la velocidad del flujo fisiológico en los sistemas postcapilares, que es de uno a cinco dines por centímetro cuadrado de contraste de interferencia diferencial de registro o DIC fite LOR 6 47. Simultáneamente usando una jeringa de un mililitro, inyecte el PMN lentamente en el sistema de flujo a través del puerto de inyección de señuelo en línea. Al cabo de unos minutos, los leucocitos aparecen, se adhieren y transmigran deteniendo el experimento en cualquier momento deseado.

Al desconectar el tubo de la cámara de flujo y pipetear el fijador aff en la cámara de flujo, se midió la resistencia de las monocapas endoteliales para probar si los anticuerpos interferían con la función de barrera del endotelio. No se observaron cambios en la resistencia cuando el VE pudo escuchar un clon de anticuerpo 55 7 H uno o se agregó el control de isotipo a las células. Por el contrario, el anticuerpo bloqueante CL 75 redujo drásticamente la resistencia.

análisis de RAP no reveló cambios en la recuperación de fluorescencia en presencia o ausencia del anticuerpo VE CADHERIN 55 7 H uno, lo que indica que el anticuerpo no alteró la dinámica de la distribución de cadherina VE, cadherina VE y pcam uno durante la migración transendotelial de neutrófilos o TEM en tiempo real. El panel superior muestra un neutrófilo delineado en blanco que se adhiere al endotelio y cruza la unión célula a célula sin dañar la distribución de VE coherente y PCAM uno. Durante la diapedesis, se puede observar una dispersión local de VE coherente y P chem cuando un neutrófilo sobresale a través de la célula a las uniones celulares delineadas en blanco es un neutrófilo en la parte superior del endotelio.

El contorno amarillo muestra la membrana de los neutrófilos que ya está debajo del endotelio. Una vez finalizada la diapedesis, las uniones se cierran y se reubican en los sitios de la diapedesis. Los bordes de los neutrófilos transmigrados están delineados en amarillo.

Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la migración transendotelial de los leucocitos con el fin de responder a preguntas adicionales como si los leucocitos atraviesan el endotelio utilizando la bagga o la raíz transcelular.