La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar discos imaginales de larvas de Drosophila Para la inmunohistoquímica, esto se logra eliminando primero el complejo de la cabeza que consta de la boca, los ganchos, el ojo y los discos tenales, y el cerebro de las larvas. El segundo paso es fijar el complejo de la cabeza e incubarlo con anticuerpos primarios y secundarios. A continuación, se separan los discos ocular y tenal del complejo cefálico.

El paso final es montar los discos imaginales en agente antiblanqueo en un portaobjetos de vidrio. En última instancia, los reporteros fluorescentes o LAC Z y la tinción de anticuerpos pueden revelar la expresión espacial y temporal de genes y proteínas dentro de los tejidos imaginales mediante microscopía de fluorescencia. Aunque esta técnica se puede utilizar para proporcionar información sobre la localización de genes y proteínas en el disco imaginal enter.

También se puede aplicar a otros tejidos imaginales, como la pata del ala, y el tope. Aquí. Para comenzar el experimento, llene una placa de Petri de 35 milímetros con tampón de disección. Coloque de 10 a 20 larvas en la placa de Petri y déjelas nadar durante cinco minutos.

Para autolimpiarse con una plaga, su pipeta crea un gran grupo de tampón de disección en el medio de una placa de disección a base de silicona. Coloque tres piscinas más pequeñas alrededor de la piscina grande y use pinzas para transferir las larvas a la piscina inferior. A continuación, con las pinzas número cinco, transfiera una sola larva limpia del pequeño estanque al grupo más grande de tampón de disección.

Para comenzar la disección gruesa, use un par de pinzas para agarrar los ganchos bucales y el otro par de pinzas para agarrar las larvas suavemente. A un tercio de la longitud de su cuerpo, manteniendo firme el gancho bucal. Retira rápidamente el resto del cuerpo con un segundo par de pinzas.

Libere la larva de las pinzas y permita que las tripas se derramen, permitiendo que los discos imaginales permanezcan en su confirmación normal. A continuación, agarre los ganchos bucales y utilice el otro par de pinzas para extraer los dos tercios inferiores de las larvas, incluidas las tripas internas. A continuación, retire suavemente las glándulas salivales, los discos de las piernas y otros tejidos.

Los únicos tejidos que deben permanecer son una pequeña cantidad de cutícula suprayacente. Los ganchos bucales, los discos oculares y tenales, los hemisferios cerebrales y el ganglio ventral. Después de un máximo de 20 minutos, transfiera todos los tejidos disecados al paria de la paraforma aldehído lisina.

Fijador de fecha o PLP. No permita que los discos imaginales permanezcan en el tampón de disección durante más de 20 minutos, ya que se degradarán después de la disección. Transfiera los tejidos diseccionados en incrementos de 100 microlitros a un vidrio de reloj que contenga PLP frío.

Use un par de pinzas para asegurarse de que los tejidos disecados estén completamente sumergidos. Incubar los tejidos disecados en fijador PLP frío durante 45 minutos a temperatura ambiente sin agitación. A continuación, transfiera 100 microlitros de tejidos disecados de PLP al tampón de lavado.

Asegúrese de que los tejidos estén completamente sumergidos e incubelos a temperatura ambiente sin agitación durante 45 minutos. A continuación, transfiera los tejidos disecados a un tubo de micro fuga de 1,5 mililitros. Retire el tampón de lavado y reemplácelo con 100 microlitros de solución de bloqueo.

Incube los tejidos a temperatura ambiente con una rotación suave en un rotador de mesa durante 10 minutos. Después de bloquear, retire la solución y reemplácela con 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios en suero de cabra 10%Normal. Incubar los tejidos a temperatura ambiente con una rotación suave durante 16 horas dependiendo de la potencia del anticuerpo.

A continuación, retire el anticuerpo primario y reemplácelo con 750 microlitros de tampón de lavado. Coloque el tubo en un mutador a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retira el tubo del mutador y deja que las cabezas se asienten en el fondo del tubo.

A continuación, retire el tampón de lavado y añada 100 microlitros de solución de anticuerpos secundarios en el suero 10%Normal. Incubar el tubo a temperatura ambiente con una rotación suave durante al menos dos horas, dependiendo de la potencia del anticuerpo. Después de la incubación, retire la solución de anticuerpos secundarios del tejido.

Reemplácelo con 500 microlitros de tampón de lavado y deje que el tejido se asiente en el fondo del tubo. Coloque tres charcos de tampón de lavado en una placa de disección de silicona. Transfiera todos los tejidos disecados a la gran piscina de tampón de lavado que se ha colocado en la placa de disección.

Esto ayuda a eliminar el exceso de anticuerpos secundarios para comenzar la disección fina, colocar el complejo de la cabeza con el lado ventral hacia abajo y sujetar la cutícula por los ganchos bucales. Coloque un segundo par de pinzas en el espacio entre el cerebro y los discos oculares y separe rápidamente el cerebro de los ganchos bucales para quitar los dos lóbulos cerebrales mientras continúa sosteniendo los ganchos bucales. Pellizque el pañuelo lo más cerca posible de la conexión entre la sección de la antena del disco de la antena del ojo y el gancho de boca.

Continúe hasta que se haya diseccionado todo el tejido deseado. A continuación, agregue dos pedazos pequeños de papel de seda del tamaño de cubreobjetos a tres pulgadas de distancia en el plato de disección. Coloque un portaobjetos de vidrio sobre estos pedazos de papel para evitar que el portaobjetos se pegue a la base de silicona del plato de disección.

Con una pipeta P 20 hombres, agregue nueve microlitros de agente antiblanqueador en el centro del portaobjetos del microscopio de vidrio para evitar el blanqueo con luz fluorescente del tejido con la misma punta sin cortar, reúna todos los discos I y tenal y agréguelos a la gota de reactivo antiblanqueante. A continuación, utilice fórceps para separar y extender los discos oculares y tenales dentro de la gota de reactivo antiblanqueador hasta que no se toquen los discos imaginales. Con un pincel fino, baje suavemente un cubreobjetos sobre la gota de agente antiblanqueador para evitar la formación de burbujas de aire.

Finalmente, guarde los portaobjetos a menos 20 grados Celsius hasta que estén listos para ver y obtener imágenes de los discos iónicos mediante microscopía de luz o fluorescencia. Este método produce de forma fiable material de alta calidad para el análisis, tal y como se transmite mediante estas imágenes confocales de discos imaginales. Los discos fueron tratados con un foid y conjugado con flúor cuatro, que se une a la actina y, por lo tanto, delinea cada célula.

Una de las características más llamativas del disco ental es el surco morfogenético, que se puede ver como una hendidura dentro del tejido que corre a lo largo del eje ventral dorsal. A medida que el surco avanza a través del campo ocular, el mar de células desordenadas se transforma en un conjunto ordenado de ojos unitarios espaciados periódicamente u Oma Tedia. La verificación de la expresión clonal y el análisis del disco imaginal I son posibles aplicaciones posteriores de este método.

Los tres paneles superiores muestran discos que se han teñido con diferentes anticuerpos, como ilis, A DPP, LAC Z transcriptional reporter y marcadores específicos de células como embrionario, letal, visión anormal o vy, que codifica una proteína panneuronal de unión al ARN. Los tres paneles inferiores muestran discos en los que se utiliza GFP para marcar las poblaciones de células. Una vez dominado el curso, el aislamiento de los complejos de cabeza de 10 a 20 larvas tomará aproximadamente 10 minutos, y adicionalmente, el aislamiento fino del disco iónico de estos complejos también tomará alrededor de 10 minutos.