Name: Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a producir y aislar axones de neuronas sensoriales usando filtros porosos para análisis bioquímico. Este método permite obtener preparaciones axonales puras de ganglios de raíz dorsal embrionarios.

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Este proyecto fue apoyado por MOP62827 de subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud.

NOTA: Los siguientes procedimientos están en conformidad con las directrices aprobadas por el Consejo Canadiense de los Animales. Se hacen todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el sufrimiento de los animales durante los procedimientos. 1. Revestimiento de Filtros NOTA: Cuando insertos de filtro de cultivo se colocan en pocillos de placas de múltiples pocillos, dos compartimentos se definen: el compartimento superior es la región por encima de la pieza de inserción y el compartimento inferior es el uno debajo del inserto de la Figura 1A.ab. Los explantes se sembraron en el compartimento superior donde se unen a la parte superior del filtro; muchos axones crecen a través del filtro y se extienden en el lado inferior del filtro, dentro de la parte inferior del compartimiento de la figura 1A.c. Los volúmenes de trabajo estándar (es decir, para la aplicación de la solución de recubrimiento, lavados, medios de cultivo, etc) son de 2 ml para el compartimiento inferior y 1 ml para el compartimiento superior y van a ser mencionada en el protocolo como &quot;; Volúmenes estándar &quot;. Añadir soluciones de partida con el compartimento inferior mediante la colocación de la punta de la pipeta en la brecha entre el inserto y el lado del pozo. Además, la inclinación de la inserción a un lado mientras que la dispensación de la solución para evitar las burbujas de ser atrapado en la parte inferior del filtro. <ol><li> Comience el recubrimiento de los filtros el día antes de chapado. Bajo el tejido campana de cultivo estéril, colocar 24 mm inserciones de filtro en una placa de 6 pocillos de recepción. Incubar insertos con poli-D-lisina en agua (1 mg / ml) durante 1 hora a TA usando volúmenes estándar: 2 ml en el compartimento inferior y 1 ml en la parte superior. </li><li> Aspirar poli-D-lisina y se lava una vez con agua. Aspirar el agua, cierre la tapa y deje los platos a secar en la campana de O / N. Durante la aspiración de líquidos, asegúrese de eliminar un remanente de líquido que queda atrapado directamente debajo del filtro. </li><li> A la mañana siguiente, diluir la laminina en agua (10 mg / ml), mezclar y caliente a 37 ° C. Incubar insertos con laminina 1 hr en cell incubadora a 37 ° C, utilizando volúmenes estándar. </li><li> Laminina Aspirar y añadir colágeno en agua (0,1 mg / ml) e incubar durante 1 hora a TA. En este caso, utilizar 2 ml para el compartimiento inferior y 2 ml para el compartimento superior. </li><li> Colágeno Aspirar y lavar una vez con agua estéril. Los filtros están ahora listos para recibir medios de cultivo y explantes de DRG, como se describe en el PASO 3. </li></ol> 2. Dissecting Embryonic Ganglio de raíz dorsal (GRD) explantes <ol><li> Anestesiar a un ratón hembra embarazada de 13 días por una inyección IP de Avertin (250 mg / kg). Espere 10 a 15 minutos y compruebe si hay falta de reflejos de retirada de la córnea y de pedal. Una vez que los reflejos están ausentes, realice dislocación cervical. </li><li> Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos y abdomen de una mujer con etanol al 70%. Permitir que los instrumentos se sequen. Manteniendo la piel del abdomen y cortar a través de las capas de piel y músculo para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Extirpar el útero separando del cuello del útero y los ovarios. En un esterilizadorle capó, la toma de embriones del útero con tijeras y recogerlas en una placa de Petri llena de medios L15 helada. Mantener en hielo. NOTA: Consulte los informes técnicos previos para más detalles sobre cómo obtener embriones de 13 días de gestación 17,18. </li><li> Bajo el microscopio, se encontraba el embrión en un lado y el uso de pequeñas tijeras de primavera para quitar de la cabeza. Hacer una incisión a lo largo de los lados laterales para descartar el pecho, el vientre, las extremidades y la cola. Mantenga la parte posterior que contiene la columna vertebral, sentar lado ventral hacia arriba y retire todos los órganos viscerales. </li><li> Con pequeñas tijeras de primavera, exponer toda la médula espinal mediante la reducción de la columna vertebral desde su lado ventral a lo largo de la línea media. Sujete la carcasa inferior con un par de pinzas (# 3) y el uso de un segundo par de celebrar la médula espinal por su aspecto más rostral. </li><li> Lenta y suavemente jale el cable alejado de la cavidad vertebral y evitar el paso de los GRD de la médula espinal utilizando fórceps ultrafinas (# 5). Grupo de los GRD que se recaude enla parte inferior del plato. </li><li> Recoger GRD agrupados por aspiración con una pipeta 200 l que ha sido cortado para ampliar su apertura. Coloca los GRD en un tubo y dejar en hielo hasta que se termine la colección DRG. NOTA: Se prefieren las blancas puntas / transparentes porque GRD no se adhieren a las paredes de este consejo (en comparación con las puntas amarillas estándar). Consejos de lavado con medios antes de su uso previene más GRD se adhiera a sus paredes. </li></ol> 3. Siembra y mantenimiento del Ganglio de raíz dorsal explantes de Filtros <ol><li> Añadir media DRG completa a 37 ° C a los insertos recubiertos utilizando volúmenes estándar. Complementar los medios compartimiento inferior con 15 ng / ml de NGF, mientras se mantiene el compartimento superior libre de NGF. NOTA: Si bien el NGF se difunde de manera eficiente a través del filtro y su concentración se equilibra dentro de horas, hemos observado que la aplicación de NGF al compartimiento inferior directamente antes de la siembra aumenta significativamente el rendimiento axonal en el BOttom superficie del filtro. </li><li> Transfiera los GRD del tubo a los filtros con una pipeta 1.000 l con una punta recortada para ampliar su apertura. </li><li> Dibujar recursos en la punta de 2 a 3 veces antes de la recogida de los GRD. Esto evita que se pegue a la cara interna de la punta. La misma punta puede ser re-utilizado para todos los pozos. El uso de puntas sin color (frente a puntas azules estándar) reduce la adherencia a la superficie DRG punta. </li><li> Para transferir los GRD, establezca la pipeta de 800 l. Aspirar aproximadamente 200 l de los medios de comunicación desde la parte superior del filtro, y luego ir al tubo que contiene DRG-y una pipeta un volumen pequeño de arriba a abajo - para volver a suspender los GRD que se han hundido hasta el fondo. Aspirar todo el volumen y GRD de pipeta sumergiendo la punta en el centro de la pieza de inserción. </li><li> Una vez que todas las partes movibles se cargan, cierre la tapa de la placa y agitar la placa de 10x, golpeándolo suavemente en el banco campana entre cada remolino. Estos movimientos aumentan el rendimiento axonal ayudando explantes de DRG fregadero yadjuntar al filtro. Esto también ayuda a distribuir uniformemente explantes de modo que los axones de diferentes explantes no se superponen. NOTA: El procedimiento de siembra explante se describe en los pasos anteriores aumenta significativamente la tasa global de unión explante al sustrato (hasta 75%). Más significativamente, el procedimiento de pipeteado evita fácilmente explantes de flotando en la superficie del medio en vez de hundirse hasta el fondo de la pieza de inserción. </li><li> Para los análisis bioquímicos, los GRD de semillas de un embrión (alrededor de 30) por filtro. Para los análisis morfológicos, utilice la mitad o un tercio de los GRD de un embrión (10-15). Esta decisión debe ser tomada antes de la recogida de los GRD en tubos, de modo que todos los GRD de un tubo se siembran en un único bien (ya sea 30, 15 o 10 GRD). </li><li> Mantener culturas en un incubador de células a 37 ° C, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días. Para cambiar los medios de comunicación, aspirar el compartimento superior primero, seguido por el compartimento inferior. Añadir medio fresco en volumen estándars empezando por el compartimento inferior. NOTA: Para evitar que células / axones se seque, no cambie los medios de comunicación en más de 3 inserciones al mismo tiempo. GRD cultivadas en filtros en presencia de NGF se extenderán los axones largos, alcanzando hasta 2 mm después de 2 días en cultivo. </li></ol> 4. Factor trófico Tratamiento Retiro La retirada de NGF induce la degeneración axonal con la fragmentación axonal (determinado por contraste de fase y β-III-tubulina IF) que aparece por primera vez alrededor de 12 horas después de la retirada. Fragmentación completa se logra en un 36 hr. ¿Por cuánto tiempo se deja la degeneración de proceder para tiene que ser elegido por el usuario final de acuerdo con el diseño experimental. <ol><li> Después de la fase de extensión axonal 2-día, cambio de medio de compartimentos superior e inferior de los medios de comunicación que carece de NGF y contiene anticuerpos anti-NGF (1 mg / ml) para secuestrar cualquier NGF restante (o producido endógenamente). </li><li> Placas de retorno a la incubadora de células (37 ° C) para permitirNGF degeneración inducida por la retirada de proceder para la cantidad de tiempo deseada. </li><li> Proceder a la extracción de proteínas (paso 6) para su análisis por Western blot o examinar directamente los filtros de IF (paso 7). </li></ol> 5. Axonal transección para inducir walleriana Degeneración Este procedimiento deja los axones en el lado inferior del filtro separados de su cuerpo celular, pero por lo demás intacto. A partir de entonces, estos axones iniciar rápidamente la degeneración walleriana. Fragmentación axonal (evidenciado por contraste de fase o β-III-tubulina SI) aparece por primera vez por 3 horas después de la sección; por 9 horas, los axones son completamente fragmentada y se separan del filtro. ¿Por cuánto tiempo se deja la degeneración de proceder para tiene que ser elegido por el usuario final de acuerdo con el diseño experimental. <ol><li> Raspe el lado superior del filtro, que contiene los explantes de DRG cultivadas, con una célula-rascador. Asegurar la eliminación completa del material superior por raspador se mueve en X-, Y-y circularlas direcciones. </li><li> Deseche los medios de comunicación desde el compartimiento superior que contiene los explantes flotantes que han sido tomadas por raspado del filtro y reemplazar con 1 ml de medio DRG pre-calentado, completo que contiene NGF (10 ng / ml). </li><li> Placa de retorno a la celda incubadora (37 ° C) para permitir la degeneración walleriana de proceder para la cantidad de tiempo seleccionado por el usuario final. </li><li> Proceder a la extracción de proteínas (paso 6) para su análisis por Western blot o examinar directamente los filtros de IF (paso 7). </li></ol> 6. Extracción de proteínas de muestras axonales <ol><li> Llenar los tubos de recogida (1,5 ml) con 75 l de tampón de muestra Laemmli. Mantener los tubos en hielo durante la cosecha axones de todo el conjunto de filtros. </li><li> Lavar el filtro con explantes de DRG en PBS y raspar el lado superior del filtro. Extraiga la tapa de la placa, limpiar la parte superior del filtro con un aplicador de punta de algodón y aspire cualquier PBS extra de los lados superior e inferior. </li><li> Coloque inserción al revéssobre un banco y corte el filtro de la inserción utilizando un bisturí afilado. Mantenga el filtro con pinzas, de abajo hacia arriba. Haga un corte desde la circunferencia al centro del filtro con unas tijeras. </li><li> Coloque el filtro en la parte superior del tubo de recogida, y con unas pinzas, pulse el centro del filtro por el tubo. Mientras hace esto, debe formar un embudo. Empuje el filtro en forma de embudo para la parte inferior del tubo de modo que se sumerge en el tampón de muestra de Laemmli. </li><li> Extracción de la proteína completa por ebullición los tubos durante 4 min. Retirar el filtro utilizando pinzas para colocar boca abajo en la parte superior del tubo y la realización de un breve centrifugado (2000 xg durante 15 seg). Deseche los filtros secos. </li><li> Resolver 10 l de la preparación de proteína axonal en un SDS-PAGE seguida de Western blot para detectar las proteínas de interés. NOTA: Como referencia, una preparación axonal de 20 explantes cultivados durante 2 días y se lisaron en 100 l de tampón de lisis RIPA tendrá una concentración de proteína de 4-6g / l. </li></ol> 7. Examen de inmunofluorescencia de los axones en los filtros Los pasos siguientes describen las manipulaciones generales para llevar a cabo si la tinción de elementos filtrantes, ejemplificadas por la detección de β-III-tubulina. Fijador, tiempos de incubación, las concentraciones y los demás datos deben ser optimizados para otros pares de antígeno-anticuerpo. <ol><li> Utilizar placas de 6 pocillos utilizados anteriormente, limpiar a fondo, para los siguientes lavados e incubaciones de los insertos. </li><li> Lavar brevemente insertos en PBS. Fijarlos en recién preparada de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a TA en un agitador. </li><li> Después de la fijación, raspar y limpiar el lado superior de la pieza de inserción para recoger los axones que crecieron exclusivamente en la superficie inferior del filtro. Proceda con incubaciones estándar para IF. </li><li> Incubar insertos en solución de bloqueo (TBS, 0,05% de Tween 20, leche descremada 5%), el uso de volúmenes estándar, durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Transferencia inserta al anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo (anti-β-III-tubulina, 1:5.000), usando volúmenes estándar. Incubar O / N (~ 18 h) a 4 ° C con agitación suave. </li><li> Lavar el primer anticuerpo dos veces en PBS (2 X 10 min a TA). </li><li> Transferencia inserta a anticuerpos secundarios fluorescentes conjugado diluido en tampón de bloqueo (cabra anti-ratón, 1:2000), usando volúmenes estándar. Incubar protegido de la luz durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Lavar el 3x anticuerpo secundario en PBS (3 x 10 min a TA). </li><li> Después de IF es completa, tome Salida de inserción, vaciar PBS desde el último lavado y limpie la parte superior del filtro con un aplicador de punta de algodón. Aspirar el líquido de los lados superior e inferior. </li><li> Lugar inserte al revés en el banco, y cortó el filtro del inserto con un bisturí afilado. </li><li> Mantenga el filtro con una pinza, la baja, y colocarla sobre el portaobjetos de microscopía. Overlay con un cubreobjetos y mou compatible fluorescentemedios nting. Deje secar extendido en cuarto frío, protegido de la luz. Examinar y capturar imágenes con un microscopio fluorescente. NOTA: Cuando se almacena a 4 ° C y protegido de la luz, estas preparaciones se pueden mantener durante semanas con una mínima pérdida de fluorescencia. </li><li> OPCIONAL: Como alternativa, si se puede realizar en los filtros que se han eliminado de la inserción. Para hacer eso, raspar y limpiar la parte superior de los filtros directamente después de la fijación. <ol><li> Tome filtros de los insertos con un bisturí y colocar filtros en punto axones-up en la parte inferior de una placa de seis pocillos. </li><li> Después, realizar incubaciones de SI como se indica en 7.4 a 7.8 y 7.11. La ventaja de esta alternativa es que ahorra reactivos, ya que, por ejemplo, volúmenes de incubación puede bajar a 500 l (en comparación con los 3 ml utilizados cuando los filtros se tiñeron directamente en los insertos como se muestra en 7.1 a 7.11). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).</li>
<li>Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axon+initial+segment+and+the+maintenance+of+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).</li>
<li>Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+as+a+therapeutic+target+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS.</a> Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).</li>
<li>Torre, E. R., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+local+protein+synthesis+within+dendrites+using+a+new+cell+culture+system+that+permits+the+isolation+of+living+axons+and+dendrites+from+their+cell+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies.</a> J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).</li>
<li>Zheng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+intra-axonal+protein+synthesis+during+axonal+regeneration+from+adult+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).</li>
<li>Willis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+transport+and+local+translation+of+cytoskeletal%2C+injury-response%2C+and+neurodegeneration+protein+mRNAs+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons.</a> J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).</li>
<li>Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+process-localized+mRNAs+from+cultured+rodent+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).</li>
<li>Schoenmann, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+is+regulated+by+the+apoptotic+machinery+or+a+NAD%2B-sensitive+pathway+in+insects+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals.</a> J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).</li>
<li>Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIAP+regulates+caspase+activity+in+degenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">XIAP regulates caspase activity in degenerating axons.</a> Cell Rep. 4, 751-763 (2013).</li>
<li>Ure, D. R., Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li>
<li>Minis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+transcriptomics-Dissection+of+the+mRNA+composition+in+the+axonal+compartment+of+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons.</a> Dev. Neurobiol. , (2013).</li>
<li>Niekerk, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+in+axons+triggers+retrograde+transport+of+the+RNA-binding+protein+La%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins%3A+roles+in+neuronal+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).</li>
<li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).</li>
<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog%2C+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.</li>
<li>Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+Plating%2C+and+Maintenance+of+Dorsal+Root+Ganglion+Neurons+for+Monoculture+and+for+Coculture+with+Dorsal+Horn+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Leach, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+primary+motor+and+sensory+neurons+in+defined+media+on+electrospun+poly-L-lactide+nanofiber+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthetic+pathways+delays+axonal+degeneration+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy.</a> J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los parámetros más importantes a tener en cuenta para la adaptación de esta técnica incluyen la población neuronal que será estudiado, el sustrato, el tamaño de poro del filtro y superficie. Todos estos parámetros tendrán un impacto en la especificidad, la calidad y cantidad de la preparación de las neuritas obtenido, y deben ser cuidadosamente considerados por el usuario final. En los ejemplos presentados en este protocolo, el uso de las neuronas DRG tiene la ventaja de que se extiende sólo los axones, dando así una pu...

El compartimiento axonal de las neuronas muestran un alto grado de independencia funcional del compartimiento somato-dendrítica. En las neuronas de proyección, los axones contienen la mayor parte de la proteína de 1,2 neuronal. El estudio de la fisiología y la patofisiología de los axones ha cobrado fuerza en la comunidad de las neurociencias porque los estudios recientes han demostrado que la disfunción axonal temprana parece ser una característica común de las enfermedades neurodegenerativas y trastornos neuropsiquiátricos 3. Parece probable que una mejor comprensión de los mecanismos-axonales exclusiva en condiciones normales y patológicas arrojará luz sobre los primeros eventos que conducen a la disfunción. El presente protocolo describe cómo utilizar insertos de cultivo que lleva una membrana porosa (filtro) para obtener grandes cantidades de material axonal pura que es adecuado para la bioquímica y análisis inmunocitoquímico. El uso de filtro inserta estudiar biología axonal fue implementado por primera vez por Steward y4 colegas y seguirá trabajando Twiss y sus colegas 5 a su configuración actual. La técnica está ahora en uso actual por grupos que estudian diversos aspectos de la biología axonal y dendrita, con ligeras modificaciones en cada caso para adaptarse a la población de neuronas estudiados, los tratamientos realizados y el tipo de análisis bioquímicos utilizados 6-9. El presente protocolo no tiene intención de dar cabida a todas las alternativas para una variedad de aplicaciones tales, sino más bien proporcionar un enfoque simple que es adecuado para la mayoría de aplicaciones. En particular, el protocolo descrito aquí utiliza un revestimiento de triple que maximiza el rendimiento axonal para los análisis bioquímicos y es más adecuado para estudiar axonales revestimientos-degeneración otra descritos en la literatura producida menos axones que se retraen y degeneran más rápido cuando se le priva de factores tróficos 9. En este procedimiento, los cuerpos celulares neuronales permanecen aislados en la cima de las qu filtroaxones ile pasan a través de los poros y crecen a lo largo de su superficie inferior. Axones Pure (libres de células gliales y contaminantes del cuerpo celular neuronal) que crecen en la superficie inferior del filtro pueden ser recogidos para análisis bioquímicos o se pueden fijar in situ y se examinaron mediante técnicas inmunocitoquímicas 9. El procedimiento se basa en el uso de las neuronas sensoriales embrionarias a partir de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). GRD embrionarias son ampliamente utilizados para estudiar la biología axonal porque neuritas de estas células experimentan un crecimiento rápido y robusto in vitro cuando se mantiene en factor de crecimiento nervioso (NGF), y porque se someten a la degeneración rápidamente cuando se le priva de este factor. Además, las neuronas DRG carecen de dendritas, de manera que todas las neuritas recogidos por este método son puramente axones. Elementos filtrantes representan una gran ventaja en comparación con otros métodos utilizados para estudiar los axones. Estudios dependen de la utilización de la microscopía para diferenciar los procesos que ocurren en el soma celular de las de unXons proporcionan información bioquímica limitada. Como otro ejemplo, los sistemas de cultivo compartimentadas (por ejemplo, cámaras Campenot 10 o dispositivos de microfluidos 11) son útiles para los enfoques de formación de imágenes y para el tratamiento diferencial de los compartimentos de la célula, pero proporcionan sólo pequeñas cantidades de material axonal, lo que impide el uso de estas técnicas para los análisis bioquímicos que requieren cantidades relativamente grandes de muestra. Además, su uso requiere una formación importante, así como dispositivos especializados, y son mucho tiempo. Otro enfoque a menudo se utiliza para aislar los axones de explantes es quitar manualmente un centro de explante (que contiene los cuerpos celulares neuronales) antes de la recogida de muestras axonal. Aunque esto puede producir grandes cantidades de preparaciones del axón enriquecido, los axones en esta preparación pueden ser envueltos en glía y eliminar rápidamente los cuerpos 20 de explantes consecutivamente de 6 pozos (como un ejemplo de un experimento mínimo) es que consume tiempo y en el límite de la viabilidad. En contraste, el método presentado aquí produce preparaciones axonales abundantes y puros que se pueden analizar por prácticamente cualquier técnica bioquímica que se utiliza comúnmente para analizar lisados ​​de células enteras, como western blot, inmunoprecipitación 6, transferencia de Northern 5 espectrometría de masas 6, la purificación del ARN 7,12,13, entre otros. Además, el protocolo se puede aplicar a inmunofluorescencia (IF) técnicas, ya que es posible fijar los axones que crecen en el lado inferior del filtro de examinar más a ellos por SI. Este enfoque facilita en gran medida el análisis de los procesos axonales-específica ya que no hay cuerpos celulares en la preparación final. Esta es una ventaja significativa ya que una señal de alta inmunofluorescencia desde los cuerpos celulares a menudo socava examen y análisis de una señal más débil procedente de estructuras delgadas tales como los axones. Dos aplicaciones del método de cultivo para estudiar AR degeneración axonalE descrito; un modelo de la poda de desarrollo y un modelo de degeneración inducida por la lesión (comúnmente conocida como degeneración walleriana). El modelado de la poda de desarrollo se basa en el hecho de que las neuronas sensoriales in vivo compiten para limitar cantidades de NGF derivado de la diana y aquellos que no lo suficiente para recibir degenerada apoyo neurotrófico 14. Este fenómeno se puede imitar en cultivos de DRG embrionarias mediante la retirada de NGF del medio de cultivo, que, como sucede in vivo, inicia la degeneración axonal seguida de la destrucción cuerpo de la célula. Para modelar la degeneración walleriana, la parte superior del filtro con los cuerpos celulares se raspa. Los axones que habían crecido en el lado inferior del filtro se separan físicamente de los cuerpos celulares y se someten a partir de entonces el proceso degenerativo rápida y estereotipado conocida como degeneración walleriana 15, el nombre de A. Waller que informó por primera vez el fenómeno en 1850 16.

<table><tbody><tr><td>Ratón CD-1, embarazo cronometrado E13</td><td>Charles River</td><td></td><td>Los embarazos cronometrados en casa se pueden realizar apareando ratones y comprobando si hay tapones vaginales (Día E0)</td></tr><tr><td>Inserciones de cultivo de células Falcon</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 y micro; m tamaño de poro, se adapta a la placa receptora de 6 pocillos</td></tr><tr><td>Placas complementarias de cultivo celular Falcon</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Placas receptoras para insertos</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Utilizado a 1 mg/ml en agua. Se puede reutilizar una vez.</td></tr><tr><td>laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Usado en 10 &micro; g/ml en agua. Tome 100x stock de -80 &deg; C y descongele O/N a 4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de colágeno bovino</td><td>PureCol Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Medio L-15 de Leibovitz</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Puede ser reemplazado por DMEM</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplemento sin suero</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-desoxiuridina (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, subunidad beta)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-NGF</td><td>Preparado internamente</td><td></td><td>Como se describe en: Acheson, A. et al. Detección de actividad similar a un factor neurotrófico derivado del cerebro en fibroblastos y células de Schwann: inhibición por anticuerpos contra NGF. Neurona. <fuerte>7</fuerte>, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Opción</td><td></td>comercial</tr><tr><td>Anticuerpo anti-tubulina</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo anti-ratón de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DRG medio de cultivo</td></tr><tr><td colspan="4">Medio Neurobasal 2% B27 Suplemento Neurobasal 2 mM L-Glutamina 1% Penicilina-estreptomisina 10 &micro; M FDU 15 ng/ml NGF (solo compartimento inferior)</td></tr><tr><td colspan="4">1x Tampón de muestra Laemmli</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glicerol 0.01% (p/v) Azul de bromofenol</td></tr></tbody></table>

producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico usando porosos filtros

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Los axones neuronales utilizan mecanismos específicos para mediar la extensión, mantener la integridad e inducir la degeneración. Se requiere un equilibrio adecuado de estos eventos para dar forma a los circuitos neuronales funcionales. El protocolo aquí descrito explica cómo utilizar insertos de cultivo celular con una membrana porosa (filtro) para obtener grandes cantidades de preparaciones axonales puras adecuadas para el examen mediante técnicas bioquímicas o inmunocitoquímicas convencionales. La funcionalidad de estos insertos filtrantes se demostrará con modelos de poda de desarrollo y degeneración walleriana, utilizando explantes de ganglio de raíz dorsal embrionario. La integridad y función axonal se ve comprometida en una amplia variedad de patologías neurodegenerativas. De hecho, ahora está claro que la disfunción axonal aparece mucho antes en el curso de la enfermedad que la pérdida del soma neuronal en varias enfermedades neurodegenerativas, lo que indica que los procesos específicos del axonal son los principales objetivos de estos trastornos. Al obtener muestras axonales puras para su análisis mediante técnicas moleculares y bioquímicas, esta técnica tiene el potencial de arrojar nueva luz sobre los mecanismos que regulan la fisiología y la fisiopatología de los axones. Esto, a su vez, tendrá un impacto en nuestra comprensión de los procesos que impulsan las enfermedades degenerativas del sistema nervioso.

Explantes de ganglios de la raíz dorsal de ratones E13.5 crecen extensamente sobre filtros secuencialmente recubiertos con poli-D-lisina, la laminina y el colágeno (Figura 1B, izquierda), que alcanzan hasta 2 mm dentro de 2 días en cultivo. Esta combinación de sustrato produce un crecimiento especialmente exuberante; otras combinaciones producen axones que son considerablemente más corto (Figura 1 B, derecha). Por otra parte, los GRD mantenidos en los filtros se extienden más y más larg...

Este artículo describe un sistema de cultivo neuronal que se puede utilizar para obtener grandes cantidades de muestras axonales puras para análisis bioquímicos e inmunocitoquímicos. Esta técnica permitirá una mejor comprensión de la fisiología axonal normal y de las vías de señalización que conducen a la neurodegeneración.

Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

El objetivo de este procedimiento es obtener preparaciones axonales puras adecuadas para el examen mediante técnicas convencionales, bioquímicas o inmunocitoquímicas. Esto se logra cultivando primero células ganglionares embrionarias de la raíz dorsal en insertos de cultivo que llevan un filtro de membrana porosa a medida que las neuronas DRG extienden los axones. Algunos de los axones crecen a través de los poros del filtro y se extienden en su superficie inferior, mientras que los cuerpos celulares permanecen aislados en la superficie superior. Después de las manipulaciones experimentales deseadas, la preparación axonal se obtiene eliminando físicamente las células de la parte superior de los filtros, manteniendo los axones que crecieron en la parte inferior.En última instancia, los axones aislados pueden ser lisados para análisis bioquímicos o fijados para el examen inmunoquímico mediante la producción de muestras axonales puras adecuadas para el análisis mediante técnicas bioquímicas convencionales. Este procedimiento ha demostrado ser muy útil para investigar la fisiología y la fisiopatología de los axones. Como verás, la técnica es relativamente sencilla de implementar y se p

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Demostramos un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta basada en la disección de los fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, seguido de la extracción del resto del axón material enriquecido.

Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

Un método para preparar translationally activa, synaptoneurosomes intacta (SN) de la corteza cerebral del ratón se describe. El método utiliza una discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad que permite la rápida preparación de los ganglios centinela activa.

Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

Este video muestra el aislamiento de las células de los ganglios sensoriales de ratones. Los ganglios se someten a digestión enzimática para disolver la matriz extracelular. A continuación, las células individuales se recogen mediante filtrado a través de un filtro de células seguido de una centrifugación en gradiente de densidad para la eliminación de residuos. Finalmente, se realiza el lavado y la centrifugación para recoger las células aisladas para su posterior análisis.

Aislamiento de células de los ganglios sensoriales

Este video describe el aislamiento y cultivo de células de Schwann de raíces espinales de ratón. A continuación, las células aisladas se cultivan en medios específicos. Las células de Schwann se aíslan mediante digestión diferencial y adherencia. Posteriormente se transfieren a cubreobjetos recubiertos de matriz extracelular para su fijación y proliferación.

Aislamiento de células de Schwann de raíces espinales de ratón

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar...

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

Las neuronas sensoriales aferentes envían información sensorial desde la periferia al sistema nervioso central. La identificación de neuronas aferentes específicas ayudará a comprender su fisiología. Describimos un método de marcaje retrógrado para identificar neuronas aferentes y estudiamos los canales iónicos dependientes de voltaje en estas neuronas utilizando electrofisiología e inmunocitoquímica de patch clamp.

Identificación de poblaciones específicas de neuronas sensoriales para el estudio de los canales iónicos expresados

Aquí, presentamos un protocolo para la extrusión hidráulica de la médula espinal, así como la identificación y el aislamiento de ganglios específicos de la raíz dorsal (DRG) en el mismo roedor. En comparación con los métodos estándar de aislamiento de la médula espinal, este método es significativamente más rápido y reduce el riesgo de daño tisular.

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Aquí, presentamos un método para purificar fibroblastos y células Schwann de nervios sensoriales y motores in vitro.

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

El proteasoma de membrana neuronal (NMP) se identificó recientemente en un subconjunto de neuronas somatosensoriales como un regulador clave del tacto, el dolor y la percepción de la picazón. Este artículo presenta un flujo de trabajo sólido para analizar la expresión y función de NMP específica del tipo de célula mediante clasificación celular, perfiles de transcriptoma y análisis inmunofluorescentes basados en cultivos.

Análisis específico del subtipo celular del proteasoma de membrana neuronal en neuronas somatosensoriales

Este estudio presenta un método robusto para aislar ARNm axonales utilizando inserciones de membrana porosas, permitiendo la separación total de neuronas frente a neuritas y la purificación de ARN. Combinado con RTddPCR, el enfoque permite la cuantificación absoluta de transcritos de baja copia, facilitando estudios sobre el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad, reproducibilidad y amplia aplicabilidad experimental.

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

Aprenda a producir y aislar axones de neuronas sensoriales usando filtros porosos para análisis bioquímico. Este método permite obtener preparaciones axonales puras de ganglios de raíz dorsal embrionarios.

Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros

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