Name: Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprende a fabricar un biochip electroquímico microfluídico para detectar hibridación de ADN mediante espectroscopía de impedancia. Este método ofrece alta sensibilidad con volúmenes de muestra reducidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen la Fundación Robert W. Deutsch, la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA), y la Fundación Nacional de Ciencias Emergentes Fronteras en la Investigación y la Innovación (EFRI) para el apoyo financiero. Los autores también agradecen a la Maryland NanoCenter y su FabLab apoyo instalación de salas limpias.

1. microfabricación del chip de microfluidos <ol><li> Preparar Electroquímica Viruta <ol><li> Patrón Oro Electrodos <ol><li> Enjuague un espacio en blanco 4 &#39;&#39; oblea de silicio (calidad de primer grado) con acetona, metanol, e isopropanol (&quot;AMI&quot; limpio). Enjuague el isopropanol de la oblea con agua desionizada (DI) seguido de secado con pistola de N 2. </li><li> Crecer una gruesa capa de pasivación 1 m SiO2 con la deposición de vapor químico mejorada por plasma herramienta (PECVD). Depositar una capa de espesor de 200 Å de cromo seguido de una capa de espesor de 2.000 Å de oro con una herramienta de pulverización catódica DC. </li><li> Spin &quot;PR1&quot; fotorresistente positivo (parámetros de giro: 3.000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) para crear película uniforme ~ 1,6 m de espesor. Pre-hornear la oblea durante 1 min a 100 ° C en una placa caliente. </li><li> Exponer la oblea con 190 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Desarrollar la oblea durante 30 segundos en 352 developer y enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma. </li><li> Grabe el oro con grabador de oro durante 1,5 min. Grabe el cromo con mordiente de cromo para el ~ 30 seg. Enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma. </li><li> Pele el fotoprotector con &quot;AMI&quot; procedimiento de limpieza. NOTA: OXIDANTE FUERTE Y POTENCIALMENTE EXPLOSIVA. </li><li> Limpie la oblea con 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 mezcla (&quot;Piranha&quot; limpia) durante 1 min. Enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma. </li></ol></li><li> Patrón Platino Electrodos <ol><li> Spin &quot;PR2&quot; fotorresistente positivo (parámetros de giro: 3.000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) para crear película uniforme ~ 1.4 m de espesor. Pre-hornear la oblea durante 1 min a 100 ° C en una placa caliente. </li><li> Exponer la oblea con 30 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Hornee la oblea durante 45 segundos a 125 ° C en una placa caliente. Flood exponerla oblea con 1.000 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda sin una fotomáscara. Desarrollar la oblea durante 2 minutos en 6: 1 desarrollador AZ400K y enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma. </li><li> Deposita una capa gruesa 400 de titanio seguido de una capa gruesa de 1.600 Å de platino usando un sistema de evaporación por haz de electrones. </li><li> Levante fotorresistente en un baño de acetona a ultrasonidos durante 5 min, seguido de enjuague con acetona e isopropanol. Enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma. </li></ol></li></ol></li><li> Preparar Canales ensayo <ol><li> Preparar Molde para Canales de ensayo <ol><li> Enjuague un espacio en blanco 4 &#39;&#39; oblea de silicio (grado de calidad de prueba) con &quot;AMI&quot; procedimiento de limpieza. Enjuague el isopropanol de la oblea con DI seguido de secado con pistola de N 2. </li><li> Spin &quot;PR3&quot; fotorresistente negativo (parámetros de hilatura de 2 pasos:. Paso uno - 600 rpm, 120 rpm / s, 10 s Paso dos - 1.150 rpm, 383 rpm / seg,27 seg) para crear película uniforme ~ 100 m de espesor. Pre-hornear la oblea en una placa caliente (parámetros de cocción de 2 pasos:. Paso uno - la rampa encima de la temperatura ambiente a 65 ° C a 300 ° C / hr y mantenga la temperatura durante 10 minutos Paso 2 - rampa de hasta 95 ° C a 300 ° C / hr y temperatura de mantenimiento durante 30 min). </li><li> Exponer la oblea con 2.500 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Post-hornear la oblea a acelerar hasta 95 ° C a 300 ° C / hr y mantenga la temperatura durante 10 minutos en un plato caliente. Desarrollar la oblea durante 10 min en propilenglicol monometil éter acetato (PGMEA) desarrollador. Enjuague la oblea con isopropanol y se seca con N 2 arma. </li></ol></li><li> Fabrique Canales ensayo <ol><li> Preparar 10: 1 polidimetilsiloxano (PDMS) mezcla (20 g de elastómero, 2 g de agente de curado) y desgasificar completamente en una cámara de vacío durante 20 min. </li><li> Definir un recinto alrededor de la oblea molde con papel de aluminio y verter lentamente el curado PDMSsobre el molde. </li><li> Hornear el molde con el PDMS en un horno de caja (parámetros de cocción de 2 pasos:. Paso uno - 5 min rampa encima de la temperatura ambiente a 80 ° C Paso 2 - mantenga a 80 ° C durante 17 min). </li><li> Despegue la PDMS del molde y colocar en papel de aluminio. Cortar los chips de ensayo con un cuchillo cirujano, definir agujeros con una herramienta de troquelado de la biopsia. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Montar el dispositivo <ol><li> Alinear manualmente los canales de ensayo PDMS con los electrodos de trabajo en el chip electroquímica. PDMS pega bien al chip electroquímica, el sellado de los canales y la prevención de fugas. </li><li> Conecte un tubo flexible (OD 0.087 &#39;&#39; y el ID de 0,015 &#39;&#39;) a un codo de plástico o conector recto mediante un tubo flexible corto como un adaptador (OD 0.1875 &#39;&#39; y el ID de 0.0625 &#39;&#39;). Fije los conectores a cada una de las entradas perforados en el dispositivo. </li><li> Conectar una jeringa en el otro extremo deel tubo y coloque la jeringa en una bomba de jeringa. Alternativamente cambiar el conjunto de una jeringa, un tubo, y un conector de acuerdo con el procedimiento paso requerido en la sección 3 y su solución correspondiente. </li></ol> 3. Analizar ADN Hibridación NOTA: Introducir cada solución lentamente en el canal a una velocidad de flujo de 200 l / h hasta que se llena todo el canal. <ol><li> Funcionalizar cada microcanal vertical con una secuencia de sonda de ADN monocatenario diferente (realizar en paralelo a los 3 microcanales verticales separadas): <ol><li> Llenar cada microcanal con una solución diferente de incubación sonda de ADN monocatenario (tampón de fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, 10 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), y 1 sonda de ssDNA M), y se incuba durante 1 hora seguido de lavado del microcanal con PBS. </li><li> Llenar los microcanal con una solución que contiene 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) en un tampón de PBS 10 mM, NaCl 100 mM y 1,395 mM TCEP, y incubate durante 1 hora seguido de lavado de la microcanal con PBS. </li></ol></li><li> Levante el PDMS, girar 90 ° a una orientación horizontal, y colocar hacia abajo para mostrar filas separadas de cámaras de reacción con cada fila que contiene un contador único y electrodo de referencia (Figura S1). </li><li> Rellena los microcanales con solución de medición de control de 4x concentran citrato sódico salino tampón (SSC), y se incuba durante 20 min. </li><li> Medición de fondo: Completa los microcanales con 5 mM de ferricianuro de ferrocianuro / 5 mM en solución de PBS y registrar los valores de impedancia del sistema electroquímico para diferentes frecuencias (espectroscopia de impedancia electroquímica; EIS) usando un potenciostato conectado a la de trabajo, contador, y electrodos de referencia ( EIS parámetros: intervalo de frecuencia de 1 MHz a 0,1 Hz, 10 puntos de datos de frecuencia por década, 25 mV de amplitud, 5 mV de polarización frente al electrodo de referencia). Repetir esta medición para cada electrodo de trabajo en los microcanales. </li&gt; <li> Mida la hibridación de ADN (realizar para cada objetivo ssDNA no complementario y complementaria). <ol><li> Rellena los microcanales con destino solución de medición ssDNA de 4x concentrado tampón SSC que contiene 1 M de la meta de ssDNA, y se incuba durante 20 min. Mida el ADN según la etapa 3.4. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+nanofluidic+systems+for+high-throughput+biological+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening.</a> Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).</li>
<li>Sun, Y., Kwok, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+microfluidic+system+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Polymeric microfluidic system for DNA analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).</li>
<li>Xu, Y., Yang, X., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+aptamers+in+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Review: aptamers in microfluidic chips.</a> Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).</li>
<li>Yang, W., Woolley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multiprocess+microfluidic+systems+for+automating+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Automat%22%5BJournal%5D)">Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis.</a> J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).</li>
<li>Gervais, T., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+and+surface+reactions+in+micro%EF%AC%82uidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass transport and surface reactions in microﬂuidic systems.</a> Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).</li>
<li>Song, H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+kinetics+on+a+microfluidic+chip+using+nanoliters+of+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).</li>
<li>Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+whole-blood+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microfluidic whole-blood immunoassays.</a> Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).</li>
<li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview.</a> Sensors. 11, 5754-5768 (2011).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-chip%3A+microfluidics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).</li>
<li>Craighead, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+lab-on-a-chip+technologies+for+interrogating+individual+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules.</a> Nature. 442, 387-393 (2006).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biological+and+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li>
<li>Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).</li>
<li>Fang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+microfluidic+devices+with+concurrent+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).</li>
<li>Pavlovic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+architecture+for+electrochemical+patterning+and+detection+of+multiple+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences.</a> Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).</li>
<li>Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+electrochemistry+in+micro-total+analysis+systems+for+biochemical+assays%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments.</a> Talanta. 80, 8-18 (2009).</li>
<li>Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+protein+recognition+using+an+aptamer-based+impedance+measurement+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).</li>
<li>Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+device+for+impedance+spectroscopy+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).</li>
<li>Prakash, S. B., Abshire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+cancer+cell+proliferation+on+a+CMOS+capacitance+sensor+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip.</a> Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+electrochemical+enzyme+sensor+chip+using+polydimethylsiloxane+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel.</a> Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).</li>
<li>Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics+and+applications+of+microfluidics+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Physics and applications of microfluidics in biology.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).</li>
<li>Mariella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%3A+the+weak+link+in+microfluidics-based+biodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection.</a> Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).</li>
<li>Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBhushan%2C+B+%22Springer+handbook+of+nanotechnology%22">Springer handbook of nanotechnology</a>. , 3rd ed, Springer. (2010).</li>
<li>Ghallab, Y. H., Badawy, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhallab%2C+YH+%22Lab-on-a-chip%3A+Techniques%2C+circuits%2C+and+biomedical+applications%22">Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications</a>. , Artech House. (2010).</li>
<li>Chee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+genetic+information+with+high-density+DNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Accessing genetic information with high-density DNA arrays.</a> Science. 25, 610-614 (1996).</li>
<li>Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hybridization+detection+by+label+free+versus+impedance+amplifying+label+with+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).</li>
<li>Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single-base+mismatch+at+distal+end+of+DNA+duplex+by+electrochemical+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).</li>
<li>Kao, L. T. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+detection+and+differentiation+of+the+DNA+strains+for+influenza+A+%28H1N1+2009%29+using+a+silicon-based+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).</li>
<li>Li, J., Chen, S., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+and+subtyping+influenza+virus+using+DNA+microarrays+and+multiplex+reverse+transcriptase+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).</li>
<li>Gautier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization-induced+interfacial+changes+detected+by+non-faradaic+impedimetric+measurements+compared+to+faradaic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electroanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach.</a> J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).</li>
<li>Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+PAT+gene+sequence+detection+by+nano-SiO2%2Fp-aminothiophenol+self-assembled+films+DNA+electrochemical+biosensor+based+on+impedance+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).</li>
<li>Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+DNA+hybridization+kinetics+in+a+microfluidic+flow+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).</li>
<li>Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electrochemical+sensor+array+for+characterizing+protein+interactions+with+various+functionalized+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces.</a> Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).</li>
<li>Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic-based+electrochemical+biochip+for+label-free+diffusion-restricted+DNA+hybridization+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis.</a> Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).</li>
<li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+for+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43R-50R (1997).</li>
<li>McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization%2C+hybridization%2C+and+oxidation+of+synthetic+DNA+on+gold+surface%3A+Electron+transfer+investigated+by+electrochemistry+and+scanning+tunneling+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy.</a> Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).</li>
<li>Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+surface+charging+during+the+coadsorption+of+mercaptohexanol+to+DNA+layers+on+gold%3A+Direct+observation+of+desorption+and+layer+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation.</a> Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).</li>
<li>Katz, E., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+biomolecular+interactions+at+conductive+and+semiconductive+surfaces+by+impedance+spectroscopy%3A+Routes+to+impedimetric+immunosensors%2C+DNA-sensors%2C+and+enzyme+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors.</a> Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestros procedimientos demuestran la fabricación de un biochip electroquímico basado en microfluidos y su utilización para el análisis de los eventos de hibridación de ADN. A través de un proceso de microfabricación de alto rendimiento controlada desarrollamos un dispositivo compuesto por canales microescala integrados con una serie de transductores electroquímicos. Hemos ideado parámetros de procesamiento controlados para el procedimiento de fotolitografía del chip electroquímica y el molde a través de un canal de mic...

Lab-on-a-chip de microfluidos dispositivos (LOC) proporciona numerosas ventajas en el diagnóstico clínico, monitoreo ambiental y la investigación biomédica. Estos dispositivos utilizan canales de microfluidos para controlar el flujo de fluido a las regiones del chip donde una variedad de procedimientos puede tener lugar incluida la mezcla de reactivo, de afinidad basada en la unión, transducción de señales, y la célula de cultivo de 1-4. Microfluídica proporciona muchas ventajas sobre las herramientas de diagnóstico clínicos convencionales, tales como lectores de placas de micropocillos o ensayos de cambio de gel electroforético. Los dispositivos microfluídicos requieren de 2 a 3 órdenes de magnitud (nanolitros en oposición a microlitros) menos reactivos para llevar a cabo ensayos similares. Además, estos dispositivos pueden aumentar la velocidad por la cual algunos eventos biológicos se producen debido al confinamiento más pequeña de las especies dentro de los canales 5,6. En tercer lugar, los sensores pueden ser integrados dentro de los dispositivos de microfluidos que utilizan técnicas de litografía y aguafuerte, que pueden proporcionar Detectio sin etiquetasn. Por último, estos dispositivos son baratos de producir y requieren poco trabajo por parte del técnico para operar 7-10. Detección libre de etiquetas típicamente se realiza usando un transductor óptico o eléctrico. Los dispositivos ópticos pueden presentar un mejor rendimiento de detección debido a la interferencia menor con analitos en la muestra. Sin embargo, su rendimiento se ve comprometida en los casos en que el fondo de la muestra tiene la misma longitud de onda de resonancia como el sensor 11. Hay muchas ventajas de utilizar las señales eléctricas para realizar la detección química y biológica en los sistemas de microfluidos. La fabricación es inherentemente menos complicado ya que estos sensores por lo general sólo requieren electrodos estampados para operar. Además, las señales eléctricas pueden conectarse directamente con la mayoría del equipo de medición, mientras que otras modalidades de señal pueden requerir un transductor para convertir la señal 12-15. Sensores eléctricos comúnmente medir los cambios en impedance 16,17, capacitancia 18, o redox actividad 19. Sin embargo, nuevos desafíos se presentan como estos sistemas son miniaturizados. Los retos más importantes para superar incluyen: preparación de la muestra y la mezcla de fluidos (debido a el volumen de muestra bajo y el número de Reynolds), efectos físicos y químicos (incluyendo las fuerzas capilares, rugosidad de la superficie, las interacciones químicas entre los materiales de construcción y analitos), bajo señalización relación a ruido (producido por el área reducida de la superficie y volumen) 20-23, y la interferencia potencial de analitos electro-activas en muestras biológicas complejas (por ejemplo, de sangre y de saliva). Investigaciones posteriores de estos efectos se traducirá en las directrices para una fabricación precisa y manejo de estos dispositivos de una manera reproducible que mejoren en su desempeño general. Detección de la hibridación de ADN se utiliza ampliamente para diagnosticar trastornos genéticos 24,25 y diversas formas de Cancer 26. Cada año, varias cepas de la gripe se identifican en los pacientes que utilizan los resultados de las técnicas de hibridación de ADN 27. El virus de la gripe por sí sola representa 36.000 muertes cada año en los Estados Unidos 28. Tales ejemplos podrían beneficiarse de un dispositivo de sobremesa de microfluidos que puede realizar las mismas técnicas de ensayo como un ensayo de desplazamiento en gel de lector de placas o con bajo volumen de muestra y en una fracción del costo sin sacrificar la sensibilidad o especificidad. Debido a las muchas ventajas de detección electroquímica libre de etiquetas, se ha utilizado ampliamente para la detección de eventos de hibridación de ADN 29,30. Una configuración donde los electrodos escala macro (en el rango de milímetros) se sumergen en vasos de precipitados con la solución de interés puede ser utilizado para proporcionar datos muy sensibles con respecto a la cinética de unión de secuencias de ADN de cadena sencilla a sus emparejan secuencias complementarias. Recientemente, ha habido algunos avances en la incorporación de la detección electroquímica en microfluidics para la hibridación de ADN. Se han realizado estudios en relación con la cinética de hibridación 31 y la integración de sensores para la detección de 15 en los canales de microfluidos. Sin embargo, todavía existe una necesidad de un dispositivo de microfluidos rápida de alto rendimiento que puede analizar los eventos de hibridación de ADN en paralelo sin complicados pasos de preparación de muestras. El dispositivo se presenta en este trabajo proporciona una plataforma que permite múltiples interacciones que se proyectarán en paralelo y sin complicados pasos de preparación de muestras. Nuestro protocolo presenta la forma de microfluidos basada en biochips electroquímicos se microfabricados con la tecnología de sistemas micro-electromecánicos (MEMS) 32,33. Se describe el proceso de fabricación tanto del chip de microfluidos, hecho de polidimetilsiloxano (PDMS), y el chip electroquímica, compuesto por una matriz de electrodos. La funcionalización química del biochip con ssDNA sondas también se aborda. Finalmente, el Abildad del biosensor para detectar específicamente y analizar los objetivos de ssDNA se demuestra. En general, el biochip electroquímico basado en microfluidos es una técnica rápida y el análisis de alto rendimiento. Se puede utilizar para investigar las interacciones entre moléculas biológicas y transductores de conductores, y se puede utilizar en una variedad de aplicaciones de laboratorio en un chip.

<table><tbody><tr><td>Oblea de silicona de 4''</td><td>Ultrasil</td><td>4-5664</td><td>Pulido por un lado; Tipo P; Boro dopado; Orientación 1-0-0; Espesor 500 micras; Resistencia 10-20 ohm&middot; cm</td></tr><tr><td>Shipley 1813 fotorresistente ("PR1")</td><td>Microchem</td><td></td><td>fotorresistente</td></tr><tr><td>AZ5214 fotorresistente ("PR2")</td><td>Hoechst Celanse</td><td></td><td>fotorresistente</td></tr><tr><td>positivo SU-8 50 fotorresistente ("PR3")</td><td>Microchem</td><td></td><td>fotorresistente negativo</td></tr><tr><td>Grabador de oro</td><td>Transene</td><td>TFA</td><td>Sin dilución</td></tr><tr><td>Grabador de cromo</td><td>Transene</td><td>1020AC</td><td>Sin dilución</td></tr><tr><td>Elastómero PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097366 1004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Agente de curado</td><td>Dow Corning</td><td>3097358 1004</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de punzonado para biopsia</td><td>Healthlink</td><td>BP20</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubo flexible</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>R 3603</td><td>0.015"</td></tr><tr><td>Tygon adaptador flexible</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>06417-41</td><td>Jeringa de 0.0625"</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>Beckton-Dickenson</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fluka</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico anhidro</td><td>Sigma</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>6-mercapto-1-hexanol</td><td>Aldrich</td><td>451088</td><td></td></tr><tr><td>20x tampón concentrado de citrato de sodio y solución salina</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potasio(III)</td><td>Aldrich</td><td>455946</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA complementario #1</td><td>Tecnologías de ADN integradas (IDT)</td><td>100 nmol ADN oligo</td><td>5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3'</td></tr><tr><td>Objetivo ssDNA #2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmol ADN oligo</td><td>5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3'</td></tr><tr><td>Complementario ssDNA #2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmol ADN oligo</td><td>5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3'</td></tr><tr><td>Objetivo ssDNA #3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmol ADN oligo</td><td>5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3'</td></tr><tr><td>Complementario ssDNA #3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmol ADN oligo</td><td>5'-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3'</td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Plasma Enhanced Vapor Deposition (PECVD)</td><td>Oxford Instruments</td><td>PlasmaLab System 100</td><td>Presión de cámara 1.000 mTorr, Tempreture 200 &#176; C, potencia de RF 20 W, gases: a) Caudal N2O 710 sccm; b) una composición de 5% de SiH4 y 95% de N2 caudal de gases 170 sccm, SiO2 tasa de crecimiento 690 &#197;/min.</td></tr><tr><td>Unidad de pulverización catódica de CC</td><td>AJA INTERNATIONAL</td><td>ATC 1800-V</td><td>para cromo: Presión de la cámara 10 mTorr, Caudal de argón 20 sccm, Potencia de CC suministrada 200 W, Tasa de pulverización catódica 10 nm/min. Para oro: Presión de la cámara 10 mTorr, Caudal de argón 20 sccm, Potencia de CC suministrada 200 W, Tasa de pulverización catódica 36 nm/min.</td></tr><tr><td>Sistema de evaporación E-beam</td><td>Denton Hecho</td><td>a medida</td><td>para titanio: Presión de la cámara < 2 x 10-6 Torr, Potencia suministrada a la pistola electrónica 7,5 kW, Corriente de filamento 150-200 mA, Tasa de evaporación 6-10 &#197;/seg. Para Platino: Presión de la cámara < 2 x 10-6 Torr, Potencia suministrada a la pistola electrónica 7,5 kW, Corriente de filamento 150-200 mA, Tasa de evaporación 2-3 &#197;/seg.</td></tr><tr><td>Potenciostato</td><td>CH Instruments</td><td>660D</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS230</td><td></td></tr></tbody></table>

un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación adn-label libre

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

La miniaturización de los procedimientos analíticos de sobremesa en la escala micro proporciona ventajas significativas en cuanto a tiempo de reacción, el coste, y la integración de las etapas de pre-procesamiento. La utilización de estos dispositivos hacia el análisis de los eventos de hibridación de ADN es importante porque ofrece una tecnología para la evaluación en tiempo real de los biomarcadores en el punto de atención para diversas enfermedades. Sin embargo, cuando la huella dispositivo disminuye el dominio de diversas ampliaciones de los fenómenos físicos. Estos fenómenos influyen en la precisión de fabricación y fiabilidad de funcionamiento del dispositivo. Por lo tanto, hay una gran necesidad de fabricar con precisión y operar estos dispositivos en una manera reproducible con el fin de mejorar el rendimiento global. A continuación, describimos los protocolos y los métodos utilizados para la fabricación y el funcionamiento de un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis preciso de los eventos de hibridación de ADN. El biochip se compone de dos partes: un chip de microfluidos contres micro-canales paralelos hechos de polidimetilsiloxano (PDMS), y un Arrayed electroquímica micro-chip de 3 x 3. Los eventos de hibridación de ADN se detectan usando un análisis de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). El análisis EIS permite monitoreo de las variaciones de las propiedades del sistema electroquímico que son dominantes en estas escalas de longitud. Con la capacidad para monitorizar los cambios tanto de transferencia de carga y la resistencia difusional con el biosensor, se demuestra la selectividad a los objetivos de ADNss complementarios, un límite de detección calculado de 3,8 nM, y una reactividad cruzada del 13% con otros ssDNA no complementaria siguiente 20 min de incubación. Esta metodología puede mejorar el rendimiento de dispositivos miniaturizados por elucidar sobre el comportamiento de la difusión en el régimen de micro-escala y al permitir el estudio de los acontecimientos de hibridación de ADN.

Un proceso de fabricación controlable y precisa para el dispositivo experimental es esencial en la investigación. Se permite a los investigadores obtener rendimiento experimentos reproducibles y altas. Aquí hemos demostrado un alto rendimiento, el proceso de microfabricación alta reproducibilidad de un biochip electroquímico basado en microfluídico (Figura 1). Con una baja tasa de fracaso, pocos dispositivos han mostrado problemas de unión que llevan a la solución de las fugas. Con el fin de validar la ...

Se presenta un biochip electroquímico basado en microfluídico para la detección de la hibridación de ADN. Tras ssDNA sonda funcionalización, la especificidad, sensibilidad y límite de detección se estudian con objetivos ssDNA complementarias y no complementarias. Resultados ilustran la influencia de los eventos de hibridación de ADN en el sistema electroquímico, con un límite de detección de 3,8 nM.

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de los eventos de hibridación del ADN en los espectros de impedancia utilizando un dispositivo electroquímico microfluídico. Para ello, se fabrica un chip electroquímico que permite una serie de sensores de electrodos y se fabrica un chip PDMS microfluídico. Para facilitar la introducción de muestras de micro volúmenes, los dos chips se unen y funcionalizan con sondas de ADN monocatenarias.Luego, el ADN monocatenario objetivo se agrega tras la hibridación del ADN, la fuerza de repulsión más fuerte entre el ADN bicatenario cargado negativamente y las moléculas de cianuro Ferris cargadas negativamente da como resultado una mayor resistencia a la transferencia de carga. En última instancia, los eventos de hibridación del ADN se pueden detectar midiendo los cambios en los espectros de impedancia electroquímica. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de un lector de placas o el ensayo de desplazamiento J, es que los dispositivos pueden realizar la misma técnica con un volumen de muestra bajo y a una fracción del costo sin sacrificar la sensibilidad o la especificidad.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación del cáncer, la detección de la gripe y la ingeniería genética al permitir el cribado rápido de secuencias específicas de ADN y la investigación de la cinética binaria de las secuencias de ADN monocatenario. Debido a que este método de análisis de hibridación de ADN rápido y de alto rendimiento puede funcionar con un volumen de muestra bajo y sin pasos complicados de preparación de la muestra, las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestro diagnóstico de trastornos genéticos, diversas formas de cáncer o enfermedades con marcadores de ADN específicos, como la gripe. Por lo general, las personas nuevas en el método tendrán dificultades porque el desarrollo de microdispositivos requiere parámetros de procesamiento de control y un enfoque iterativo para resolver problemas como la fuga de solución.Después del ensamblaje del dispositivo Para modelar electrodos de oro en el chip electroquímico, sostenga una oblea de silicio de cuatro pulgadas de primera calidad en blanco con pinzas y use una botella de lavado para enjuagar la superficie de ambos lados de la oblea con acetona, metanol y luego isopropanol. Este proceso se denomina en lo sucesivo limpieza A MI bajo un chorro de agua desionizada. Enjuague el isopropanol de la oblea, luego use una pistola de nitrógeno para secar la oblea.Cargue la oblea en un equipo de deposición de vapor químico mejorado por plasma o P-E-C-V-D. Ingrese los parámetros para producir una capa de dióxido de silicio de un micrómetro de espesor y comience el proceso automatizado a continuación, utilizando una herramienta de pulverización catódica de CC, deposite una capa de cromo de 200 angstroms de espesor en la oblea, luego deposite una capa de oro de 2000 stroms de espesor. Cargue la oblea en una ruleta, espolvoree la superficie con una pistola de nitrógeno y, con una pipeta de pasta, aplique spin PR un giro fotorresistente positivo para crear una película uniforme de aproximadamente 1,6 micrómetros de grosor.A continuación, hornee previamente la oblea durante un minuto a 100 grados centígrados en una placa caliente. Cargue la oblea con la fotorresistencia en el equipo alineador de mascarillas. A continuación, inicie una exposición de 190 milijulios por centímetro cuadrado a 405 nanómetros en la que el alineador de la máscara abrirá el obturador y expondrá la resistencia fotográfica a la luz a través de una máscara con las características diseñadas.Después de la exposición, sumerja la oblea en un plato de vidrio que contenga revelador 3 5 2 e incube durante 30 segundos agitando suavemente. Luego enjuague la oblea bajo un chorro de agua di y seque con la pistola de nitrógeno como antes. A continuación, sumerja la oblea en un plato de vidrio que contenga una solución de grabado de oro e incube durante 1,5 minutos agitando suavemente.Luego transfiera la oblea a un plato de vidrio que contenga el cromo mencionado e incube agitando suavemente hasta que desaparezcan las marcas de cromo en la oblea. Esto debería tardar unos 30 segundos. Enjuague la oblea con agua di y séquela con la pistola de nitrógeno que sujeta la oblea con unas pinzas.Retire la resistencia fotográfica utilizando el procedimiento de limpieza MI. Luego enjuague con agua desionizada y seque con la pistola de nitrógeno usando dos capas de guantes. Sumerge la oblea en un plato de teflón con una solución limpia de piraña durante un minuto.Luego enjuague la oblea con agua di y seque con una pistola de nitrógeno. Junto al patrón de los electrodos de platino, cargue la oblea en un centrifugador. Espolvoree la superficie con una pistola de nitrógeno y con una pipeta pastelera, dispense PR dos fotorresistencias positivas en la superficie para crear una película uniforme de aproximadamente 1,4 micrómetros de espesor.Coloque la oblea en una placa caliente a 100 grados centígrados y hornee previamente durante un minuto. Después de la pre-horneación, exponga la oblea a 30 milijulios por centímetro cuadrado 405 nanómetros a través de una máscara fotográfica. Luego coloque la oblea en una placa caliente a 125 grados centígrados y hornee por 45 segundos.Retire la mascarilla de la mascarilla, el alineador y la inundación. Exponga la oblea con 1000 milijulios por centímetro cuadrado a una longitud de onda de 405 nanómetros sin una máscara fotográfica. Después de la exposición, revele la oblea sumergiéndola en un plato de vidrio que contenga seis a uno una solución reveladora Z 400 K.Incubar durante dos minutos agitando suavemente. Luego enjuague la oblea con agua di y seque con una pistola de nitrógeno. Utilizando un sistema de evaporación de haz E, deposite una capa de titanio de 400 angstroms de espesor seguida de una capa de platino de 1600 angstroms de espesor sobre la oblea.Coloque la oblea en un plato de vidrio lleno de acetona y coloque el plato en un baño ultrasónico durante cinco minutos para levantar la foto. Resista luego sostener la oblea con pinzas. Use una botella de lavado para enjuagar ambas superficies de la oblea con acetona y luego con isopropanol.Enjuague la oblea con agua y séquela con la pistola de nitrógeno. Para preparar el molde para los canales de ensayo, enjuague una oblea de silicio de calidad de grado de prueba de cuatro pulgadas en blanco con el procedimiento de limpieza MI. Como antes, enjuague el isopropanol de la oblea con agua di, seguido de un secado con una pistola de nitrógeno.Cargue la oblea en un spinner, espolvoree la superficie de la oblea con una pistola de nitrógeno y, con una pipeta pasti, dispense PR tres fotorresistentes negativos en la superficie para crear una película uniforme de unos 100 micrómetros de espesor. Coloque la oblea en una placa caliente para hornearla previamente mediante un procedimiento de horneado de dos pasos. Primero, aumente la temperatura de temperatura ambiente a 65 grados Celsius a 300 grados Celsius por hora.Luego manténgalo a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Aumente hasta 95 grados Celsius a 300 grados Celsius por hora y luego mantenga presionado durante 30 minutos. Exponga la oblea con 2.500 milijulios por centímetro cuadrado a una longitud de onda de 405 nanómetros a través de una máscara fotográfica.Luego, coloque la oblea en un plato caliente y hornee la oblea aumentando desde la temperatura ambiente hasta los 95 grados centígrados a 300 grados centígrados por hora. Mantenga la posición a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Sumerja la oblea en un plato de vidrio que contenga propilenglicol, acetato de éter monometílico o revelador P-G-M-E-A y deje que se desarrolle durante 10 minutos.Enjuague la oblea con isopropanol y séquela con una pistola de nitrógeno para fabricar canales de ensayo para encontrar un recinto alrededor de la oblea del molde con papel de aluminio y vierta lentamente el polidimetilsuboxano sin curar o PDMS sobre el molde. Hornee el molde con el PDMS en un horno de caja utilizando un procedimiento de horneado de dos pasos en el que la temperatura aumenta de temperatura ambiente a 80 grados centígrados durante cinco minutos y permanece a 80 grados centígrados durante 17 minutos. Después de que el molde se haya enfriado, retire el PDMS del molde y colóquelo sobre papel de aluminio.Corte los chips de ensayo con un bisturí quirúrgico y defina los orificios con una herramienta de punzonado de biopsia como se muestra aquí. Alinee manualmente los canales de ensayo PDMS con los electrodos de trabajo en el chip electroquímico. El PDMS se adhiere bien al chip electroquímico, sellando los canales y evitando fugas.Conecte el tubo flexible a un codo de plástico o a un conector recto utilizando un tubo corto y flexible como adaptador para funcionalizar los microcanales verticales. Conecte una jeringa que contenga la sonda de ADN monocatenaria al tubo y colóquela en una bomba de jeringa. Conecte los conectores a cada una de las entradas perforadas completas del dispositivo.El aspecto más difícil de este procedimiento es hacer fluir la solución en los microcanales sin generar burbujas. Para garantizar el éxito, fluya la solución muy lentamente Para lograr un llenado homogéneo del canal, encienda la bomba a un caudal de 200 microlitros por hora para llenar lentamente cada uno de los tres microcanales separados con una solución de incubación de sonda de ADN monocatenaria diferente. Después de incubar durante una hora, cambie el tubo de la jeringa y el conector para enjuagar los microcanales con PBS A continuación, cambie el tubo de la jeringa y los conectores para llenar el microcanal con una solución que consta de un milimolar seis mer, CAPTO, un H, etanol, MCH en PBS 10 milimolares, 100 milimolares de cloruro de sodio y 1,395 milimolares TCEP incubar durante una hora.Luego enjuague con PBS como antes usando pinzas. Levante el PDMS girado 90 grados a una orientación horizontal y colóquelo hacia abajo. Esto expondrá filas separadas de cámaras de reacción con cada fila conteniendo un contador único y un electrodo de referencia para el análisis de hibridación de ADN.Intercambio, el tubo de la jeringa y los conectores para llenar los micro canales con una solución de medición de control de tampón SSC de citrato de sodio salino concentrado Forex incubar durante 20 minutos después de la incubación cambiar la jeringa para llenar los micro canales con cianuro de Ferris de cinco milimolares cinco milmolares de cianuro de Faraón en solución de PBS. Luego, para registrar los valores de impedancia de fondo del sistema electroquímico para diferentes frecuencias mediante espectroscopia de impedancia electroquímica o EIS, conecte un estado de potencial al contador de trabajo y los electrodos de referencia usando puntas de sonda. Introduzca los parámetros de la medición del EIS en el software del ordenador y, a continuación, inicie la medición.Repita esta medición para cada electrodo de trabajo en los microcanales para medir la hibridación de ADN para cada intercambio de dianas de ADN monocatenario no complementario y complementario. El tubo de la jeringa y el conector. Llene los microcanales con un tampón SSC concentrado de cuatro veces que contenga un micromolar del ADN monocatenario objetivo e incube durante 20 minutos.Tome medidas iniciando la medición de EIS con un software en la computadora para cada solución de ADN monocatenario objetivo para validar la actividad electroquímica del bio chipp vol cíclico. Las mediciones de telemetría se tomaron en los microcanales llenos de un cianuro redox electroactivo que se muestra aquí son telegramas de vol cíclico de nueve electrodos de trabajo. La forma similar, las alturas de los picos y la separación de los picos de todos los electrodos demuestran una alta reproducibilidad para demostrar la capacidad de los biochips para detectar eventos de hibridación de ADN.Se midieron las variaciones de impedancia electroquímica para los eventos de hibridación entre tres sondas de ADN monocatenario y sus objetivos de ADN monocatenario complementarios y no complementarios, se observaron cambios más altos en la resistencia a la transferencia de carga cuando se introdujo un objetivo de ADN monocatenario complementario e hibridado con la sonda, en comparación con la introducción de objetivos de ADN monocatenario no complementarios para demostrar la sensibilidad del biosensor. Se introdujeron diferentes concentraciones de ADN monocatenario complementario en la sonda de detección, que se muestra aquí es un diagrama de Nyquist de mediciones de espectroscopia de impedancia electroquímica después de la introducción de concentraciones crecientes de ADN monocatenario objetivo indicadas por la flecha en el gráfico. Se observaron valores de impedancia aumentados a bajas frecuencias de alrededor de 15 hercios para concentraciones de ADN monocatenario objetivo más altas debido a las fuerzas de repulsión más fuertes entre el ADN bicatenario y las moléculas de cianuro ferrociuro.En general, los BIOCHIPS muestran la capacidad de detectar rápidamente la presencia de eventos de hibridación de ADN. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo desarrollar y fabricar un dispositivo electroquímico microfluídico y usarlo para detectar eventos de hibridación de ADN. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar varios parámetros del BIOS, como la relación señal-enfermera, la estabilidad y la sensibilidad.Se pueden realizar otros métodos, como la introducción de dianas de ADN monocatenario con secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes, para responder a preguntas adicionales como la combinación de mutaciones en el ADN y la competencia. No olvide que trabajar con soluciones de procesos de microfabricación puede ser extremadamente peligroso, y la protección del cuerpo, los ojos y las manos siempre debe advertir mientras realiza este procedimiento.

a-microfluidic-based-electrochemical-biochip-for-label-free-dna

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presenta un nuevo y poderoso de integración de la nanofotónica (QD-FRET) y microfluídica para investigar la formación de polyplexes polielectrolito, que se espera que proporcione un mejor control y síntesis de polyplexes uniforme y personalizable para a base de ácido nucleico futuras terapias.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

"ADN electrónico" sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

En este vídeo, analizamos la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN libre de células o cfDNA mediante electroforesis capilar automatizada. Esta técnica ayuda a obtener información sobre el perfil de los fragmentos de ADN liberados por las células cancerosas durante la apoptosis.

Análisis automatizado de distribución del tamaño de los fragmentos basado en electroforesis capilar del ADNcf: un método basado en microchips de ADN para estudiar la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN aislados de biofluidos

Este video muestra la PCR digital basada en chip, una variación de la técnica de PCR digital que es útil para detectar variantes raras de transcripción. La reacción de PCR se divide en las cámaras de un chip nanofluido, cada una de las cuales actúa como una reacción independiente. La detección de señales de fluorescencia de las cámaras con objetivos amplificados confirma la presencia de variantes raras de transcripción en la muestra.

PCR digital basada en chip para detectar variantes raras de transcripción utilizando un chip nanofluídico

Un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico ha sido desarrollado para su uso como un diagnóstico molecular. El chip realiza la extracción de ácido nucleico, la transcriptasa inversa y la PCR. Los métodos para fabricar y ejecutar el chip se describen.

Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.

Microfluidic Reacción en el chip de captura-cicloadición para inmovilizar reversiblemente pequeñas moléculas o estructuras de múltiples componentes para aplicaciones de biosensores

Este artículo de vídeo describe un método de microarrays basado en vitro para determinar los objetivos de genes y sitios de unión para dos reguladores de respuesta del sistema de componentes.

Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

Demostramos una plataforma de microfluidos con una red de electrodo de superficie integrado que combina detección de pulso resistivo (RPS) con división de código de acceso múltiple (CDMA), para multiplexar la detección y el tamaño de las partículas en múltiples canales de microfluidos.

Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

Una plataforma de biosensores de microfluídica fue diseñada y fabricado utilizando la tecnología de fotoresistencia de película seca de bajo costo para la cuantificación rápida y sensible de diversos analitos. Este sistema de uso único permite la lectura electroquímica de sobre-chip-inmovilizado análisis enzima-ligado mediante la técnica de stop-flow.

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

El microfluídico digital basado en electrohumección es una técnica que utiliza un cambio impulsado por voltaje en el ángulo de contacto aparente de una gota de volumen de microlitros para facilitar su manipulación. La combinación de esto con perlas magnéticas funcionalizadas permite la integración de múltiples operaciones de unidades de laboratorio para la preparación de muestras y la identificación de patógenos utilizando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Plataforma de microfluídico digital basada en electrohumección para el ensayo automatizado de inmunoabsorbentes ligados a enzimas

Aprende a fabricar un biochip electroquímico microfluídico para detectar hibridación de ADN mediante espectroscopía de impedancia. Este método ofrece alta sensibilidad con volúmenes de muestra reducidos.

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Explorar más videos