Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de los eventos de hibridación del ADN en los espectros de impedancia utilizando un dispositivo electroquímico microfluídico. Para ello, se fabrica un chip electroquímico que permite una serie de sensores de electrodos y se fabrica un chip PDMS microfluídico. Para facilitar la introducción de muestras de micro volúmenes, los dos chips se unen y funcionalizan con sondas de ADN monocatenarias.

Luego, el ADN monocatenario objetivo se agrega tras la hibridación del ADN, la fuerza de repulsión más fuerte entre el ADN bicatenario cargado negativamente y las moléculas de cianuro Ferris cargadas negativamente da como resultado una mayor resistencia a la transferencia de carga. En última instancia, los eventos de hibridación del ADN se pueden detectar midiendo los cambios en los espectros de impedancia electroquímica. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de un lector de placas o el ensayo de desplazamiento J, es que los dispositivos pueden realizar la misma técnica con un volumen de muestra bajo y a una fracción del costo sin sacrificar la sensibilidad o la especificidad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación del cáncer, la detección de la gripe y la ingeniería genética al permitir el cribado rápido de secuencias específicas de ADN y la investigación de la cinética binaria de las secuencias de ADN monocatenario. Debido a que este método de análisis de hibridación de ADN rápido y de alto rendimiento puede funcionar con un volumen de muestra bajo y sin pasos complicados de preparación de la muestra, las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestro diagnóstico de trastornos genéticos, diversas formas de cáncer o enfermedades con marcadores de ADN específicos, como la gripe. Por lo general, las personas nuevas en el método tendrán dificultades porque el desarrollo de microdispositivos requiere parámetros de procesamiento de control y un enfoque iterativo para resolver problemas como la fuga de solución.

Después del ensamblaje del dispositivo Para modelar electrodos de oro en el chip electroquímico, sostenga una oblea de silicio de cuatro pulgadas de primera calidad en blanco con pinzas y use una botella de lavado para enjuagar la superficie de ambos lados de la oblea con acetona, metanol y luego isopropanol. Este proceso se denomina en lo sucesivo limpieza A MI bajo un chorro de agua desionizada. Enjuague el isopropanol de la oblea, luego use una pistola de nitrógeno para secar la oblea.

Cargue la oblea en un equipo de deposición de vapor químico mejorado por plasma o P-E-C-V-D. Ingrese los parámetros para producir una capa de dióxido de silicio de un micrómetro de espesor y comience el proceso automatizado a continuación, utilizando una herramienta de pulverización catódica de CC, deposite una capa de cromo de 200 angstroms de espesor en la oblea, luego deposite una capa de oro de 2000 stroms de espesor. Cargue la oblea en una ruleta, espolvoree la superficie con una pistola de nitrógeno y, con una pipeta de pasta, aplique spin PR un giro fotorresistente positivo para crear una película uniforme de aproximadamente 1,6 micrómetros de grosor.

A continuación, hornee previamente la oblea durante un minuto a 100 grados centígrados en una placa caliente. Cargue la oblea con la fotorresistencia en el equipo alineador de mascarillas. A continuación, inicie una exposición de 190 milijulios por centímetro cuadrado a 405 nanómetros en la que el alineador de la máscara abrirá el obturador y expondrá la resistencia fotográfica a la luz a través de una máscara con las características diseñadas.

Después de la exposición, sumerja la oblea en un plato de vidrio que contenga revelador 3 5 2 e incube durante 30 segundos agitando suavemente. Luego enjuague la oblea bajo un chorro de agua di y seque con la pistola de nitrógeno como antes. A continuación, sumerja la oblea en un plato de vidrio que contenga una solución de grabado de oro e incube durante 1,5 minutos agitando suavemente.

Luego transfiera la oblea a un plato de vidrio que contenga el cromo mencionado e incube agitando suavemente hasta que desaparezcan las marcas de cromo en la oblea. Esto debería tardar unos 30 segundos. Enjuague la oblea con agua di y séquela con la pistola de nitrógeno que sujeta la oblea con unas pinzas.

Retire la resistencia fotográfica utilizando el procedimiento de limpieza MI. Luego enjuague con agua desionizada y seque con la pistola de nitrógeno usando dos capas de guantes. Sumerge la oblea en un plato de teflón con una solución limpia de piraña durante un minuto.

Luego enjuague la oblea con agua di y seque con una pistola de nitrógeno. Junto al patrón de los electrodos de platino, cargue la oblea en un centrifugador. Espolvoree la superficie con una pistola de nitrógeno y con una pipeta pastelera, dispense PR dos fotorresistencias positivas en la superficie para crear una película uniforme de aproximadamente 1,4 micrómetros de espesor.

Coloque la oblea en una placa caliente a 100 grados centígrados y hornee previamente durante un minuto. Después de la pre-horneación, exponga la oblea a 30 milijulios por centímetro cuadrado 405 nanómetros a través de una máscara fotográfica. Luego coloque la oblea en una placa caliente a 125 grados centígrados y hornee por 45 segundos.

Retire la mascarilla de la mascarilla, el alineador y la inundación. Exponga la oblea con 1000 milijulios por centímetro cuadrado a una longitud de onda de 405 nanómetros sin una máscara fotográfica. Después de la exposición, revele la oblea sumergiéndola en un plato de vidrio que contenga seis a uno una solución reveladora Z 400 K.

Incubar durante dos minutos agitando suavemente. Luego enjuague la oblea con agua di y seque con una pistola de nitrógeno. Utilizando un sistema de evaporación de haz E, deposite una capa de titanio de 400 angstroms de espesor seguida de una capa de platino de 1600 angstroms de espesor sobre la oblea.

Coloque la oblea en un plato de vidrio lleno de acetona y coloque el plato en un baño ultrasónico durante cinco minutos para levantar la foto. Resista luego sostener la oblea con pinzas. Use una botella de lavado para enjuagar ambas superficies de la oblea con acetona y luego con isopropanol.

Enjuague la oblea con agua y séquela con la pistola de nitrógeno. Para preparar el molde para los canales de ensayo, enjuague una oblea de silicio de calidad de grado de prueba de cuatro pulgadas en blanco con el procedimiento de limpieza MI. Como antes, enjuague el isopropanol de la oblea con agua di, seguido de un secado con una pistola de nitrógeno.

Cargue la oblea en un spinner, espolvoree la superficie de la oblea con una pistola de nitrógeno y, con una pipeta pasti, dispense PR tres fotorresistentes negativos en la superficie para crear una película uniforme de unos 100 micrómetros de espesor. Coloque la oblea en una placa caliente para hornearla previamente mediante un procedimiento de horneado de dos pasos. Primero, aumente la temperatura de temperatura ambiente a 65 grados Celsius a 300 grados Celsius por hora.

Luego manténgalo a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Aumente hasta 95 grados Celsius a 300 grados Celsius por hora y luego mantenga presionado durante 30 minutos. Exponga la oblea con 2.500 milijulios por centímetro cuadrado a una longitud de onda de 405 nanómetros a través de una máscara fotográfica.

Luego, coloque la oblea en un plato caliente y hornee la oblea aumentando desde la temperatura ambiente hasta los 95 grados centígrados a 300 grados centígrados por hora. Mantenga la posición a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Sumerja la oblea en un plato de vidrio que contenga propilenglicol, acetato de éter monometílico o revelador P-G-M-E-A y deje que se desarrolle durante 10 minutos.

Enjuague la oblea con isopropanol y séquela con una pistola de nitrógeno para fabricar canales de ensayo para encontrar un recinto alrededor de la oblea del molde con papel de aluminio y vierta lentamente el polidimetilsuboxano sin curar o PDMS sobre el molde. Hornee el molde con el PDMS en un horno de caja utilizando un procedimiento de horneado de dos pasos en el que la temperatura aumenta de temperatura ambiente a 80 grados centígrados durante cinco minutos y permanece a 80 grados centígrados durante 17 minutos. Después de que el molde se haya enfriado, retire el PDMS del molde y colóquelo sobre papel de aluminio.

Corte los chips de ensayo con un bisturí quirúrgico y defina los orificios con una herramienta de punzonado de biopsia como se muestra aquí. Alinee manualmente los canales de ensayo PDMS con los electrodos de trabajo en el chip electroquímico. El PDMS se adhiere bien al chip electroquímico, sellando los canales y evitando fugas.

Conecte el tubo flexible a un codo de plástico o a un conector recto utilizando un tubo corto y flexible como adaptador para funcionalizar los microcanales verticales. Conecte una jeringa que contenga la sonda de ADN monocatenaria al tubo y colóquela en una bomba de jeringa. Conecte los conectores a cada una de las entradas perforadas completas del dispositivo.

El aspecto más difícil de este procedimiento es hacer fluir la solución en los microcanales sin generar burbujas. Para garantizar el éxito, fluya la solución muy lentamente Para lograr un llenado homogéneo del canal, encienda la bomba a un caudal de 200 microlitros por hora para llenar lentamente cada uno de los tres microcanales separados con una solución de incubación de sonda de ADN monocatenaria diferente. Después de incubar durante una hora, cambie el tubo de la jeringa y el conector para enjuagar los microcanales con PBS A continuación, cambie el tubo de la jeringa y los conectores para llenar el microcanal con una solución que consta de un milimolar seis mer, CAPTO, un H, etanol, MCH en PBS 10 milimolares, 100 milimolares de cloruro de sodio y 1,395 milimolares TCEP incubar durante una hora.

Luego enjuague con PBS como antes usando pinzas. Levante el PDMS girado 90 grados a una orientación horizontal y colóquelo hacia abajo. Esto expondrá filas separadas de cámaras de reacción con cada fila conteniendo un contador único y un electrodo de referencia para el análisis de hibridación de ADN.

Intercambio, el tubo de la jeringa y los conectores para llenar los micro canales con una solución de medición de control de tampón SSC de citrato de sodio salino concentrado Forex incubar durante 20 minutos después de la incubación cambiar la jeringa para llenar los micro canales con cianuro de Ferris de cinco milimolares cinco milmolares de cianuro de Faraón en solución de PBS. Luego, para registrar los valores de impedancia de fondo del sistema electroquímico para diferentes frecuencias mediante espectroscopia de impedancia electroquímica o EIS, conecte un estado de potencial al contador de trabajo y los electrodos de referencia usando puntas de sonda. Introduzca los parámetros de la medición del EIS en el software del ordenador y, a continuación, inicie la medición.

Repita esta medición para cada electrodo de trabajo en los microcanales para medir la hibridación de ADN para cada intercambio de dianas de ADN monocatenario no complementario y complementario. El tubo de la jeringa y el conector. Llene los microcanales con un tampón SSC concentrado de cuatro veces que contenga un micromolar del ADN monocatenario objetivo e incube durante 20 minutos.

Tome medidas iniciando la medición de EIS con un software en la computadora para cada solución de ADN monocatenario objetivo para validar la actividad electroquímica del bio chipp vol cíclico. Las mediciones de telemetría se tomaron en los microcanales llenos de un cianuro redox electroactivo que se muestra aquí son telegramas de vol cíclico de nueve electrodos de trabajo. La forma similar, las alturas de los picos y la separación de los picos de todos los electrodos demuestran una alta reproducibilidad para demostrar la capacidad de los biochips para detectar eventos de hibridación de ADN.

Se midieron las variaciones de impedancia electroquímica para los eventos de hibridación entre tres sondas de ADN monocatenario y sus objetivos de ADN monocatenario complementarios y no complementarios, se observaron cambios más altos en la resistencia a la transferencia de carga cuando se introdujo un objetivo de ADN monocatenario complementario e hibridado con la sonda, en comparación con la introducción de objetivos de ADN monocatenario no complementarios para demostrar la sensibilidad del biosensor. Se introdujeron diferentes concentraciones de ADN monocatenario complementario en la sonda de detección, que se muestra aquí es un diagrama de Nyquist de mediciones de espectroscopia de impedancia electroquímica después de la introducción de concentraciones crecientes de ADN monocatenario objetivo indicadas por la flecha en el gráfico. Se observaron valores de impedancia aumentados a bajas frecuencias de alrededor de 15 hercios para concentraciones de ADN monocatenario objetivo más altas debido a las fuerzas de repulsión más fuertes entre el ADN bicatenario y las moléculas de cianuro ferrociuro.

En general, los BIOCHIPS muestran la capacidad de detectar rápidamente la presencia de eventos de hibridación de ADN. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo desarrollar y fabricar un dispositivo electroquímico microfluídico y usarlo para detectar eventos de hibridación de ADN. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar varios parámetros del BIOS, como la relación señal-enfermera, la estabilidad y la sensibilidad.

Se pueden realizar otros métodos, como la introducción de dianas de ADN monocatenario con secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes, para responder a preguntas adicionales como la combinación de mutaciones en el ADN y la competencia. No olvide que trabajar con soluciones de procesos de microfabricación puede ser extremadamente peligroso, y la protección del cuerpo, los ojos y las manos siempre debe advertir mientras realiza este procedimiento.