Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos
19 de agosto de 2014
El aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y la disgregación mecánica para obtener células reticulares fibroblásticas, células linfáticas y endoteliales sanguíneas. En el procedimiento descrito, se combina una digestión corta con una desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación de los marcadores de superficie de las células estromales de los ganglios linfáticos viables.
El objetivo general de este procedimiento es aislar las células estromales de los ganglios linfáticos. Esto se logra interrumpiendo primero la cápsula de los ganglios linfáticos. En el segundo paso, los fragmentos de ganglios linfáticos se digieren con colagenasa cuatro y D nase uno.
A continuación, las enzimas se sustituyen por colagenasa D y D nase uno, y los fragmentos se disgregan mecánicamente con una pipeta multicanal automatizada. En última instancia, la expresión de la molécula de la superficie celular de las células de los ganglios linfáticos aislados se puede caracterizar mediante citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente es que con este método, las células SHR de los ganglios linfáticos se digieren mediante un procedimiento enzimático estandarizado complementado con una disgregación mecánica que preserva la viabilidad y la expresión de las moléculas de superficie de las células.
Comience colocando los ganglios linfáticos disecados en una placa de Petri estéril que contenga dos mililitros de medio helado. A continuación, utilice dos jeringas de un mililitro equipadas con agujas de calibre 25 para interrumpir las cápsulas de los ganglios linfáticos. A continuación, transfiera el tejido interrumpido a un tubo cónico de cinco mililitros que contenga 750 microlitros de medio, suplementado con colagenasa cuatro y ADN uno y un agitador magnético.
A continuación, coloque el tubo en un vaso de precipitados que contenga agua precalentada a 37 grados centígrados en un agitador magnético y agite los lodos de celdas a una ronda por segundo durante 30 minutos. Después de agitar, deje que el fragmento de ganglio linfático se asiente y luego retire con cuidado el sobrenadante. Ahora enriquecido para células no estromales, transfiera a los fragmentos de ganglios linfáticos 750 microlitros de medio fresco, suplementado con colagenasa D y D nase uno, y luego agite el tejido durante otros cinco minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, utilice una pipeta multicanal automatizada para desagregar los fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos en un volumen de 700 microlitros durante 10 ciclos a la velocidad máxima y, a continuación, vuelva a agitar los fragmentos de tejido después de 10 minutos. Además, desagregue los grumos de tejido con la pipeta multicanal automatizada durante 99 ciclos a la velocidad máxima. A continuación, añada 7,5 microlitros de EDTA 0,5 molar al tubo y mezcle la suspensión de tejido durante otros 99 ciclos con la pipeta automática.
Después del último ciclo de desagregación, agregue 750 microlitros de medio a la solución celular y filtre las células a través de una malla de nailon de 70 micrómetros. A continuación, pegue las células durante cinco minutos a 1500 Gs y cuatro grados centígrados. Para visualizar las poblaciones de células estromales de los ganglios linfáticos mediante citometría de flujo, tiñe las muestras de células apropiadas con un rastreador de muertos vivos y los anticuerpos de interés en 100 microlitros de HBSS que contienen 2% de FCS durante al menos 20 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad.
A continuación, lavar las células en 500 microlitros de HBSS con FCS y volver a suspender. Los gránulos en 100 microlitros de HBSS y FCS hacen funcionar las células en un citómetro de flujo que expulsa las células CD 45 positivas para excluir las células hematopoyéticas, y luego marchan sobre la población de singletes vivos. Por último, grafique GP 38 frente a CD 31 para visualizar las células reticulares de la zona T, las células endoteliales linfáticas, las células endoteliales sanguíneas y las células dobles negativas.
Poblaciones celulares. El número total de células recuperadas después de la digestión de los subconjuntos de células estromales de los ganglios linfáticos fue ligeramente mayor en el protocolo recién demostrado en comparación con los protocolos de enlace y Fletcher, lo que demuestra que la viabilidad de las células estromales de los ganglios linfáticos después del aislamiento por este protocolo es similar a la recuperada utilizando los protocolos publicados. Las células reticulares de la zona T y las células endoteliales linfáticas aisladas a través de esta y los protocolos de enlace y Fletcher se compararon para la expresión de IAB CD one 40, CD 80, PD L one y CD 40.
La expresión de las cinco moléculas de superficie fue mayor en la digestión con el protocolo recién demostrado y el protocolo de enlace para ambos subconjuntos de células estromalas, lo que sugiere que la degradación de algunas moléculas de superficie por la colagenasa cuatro y D es menos robusta que con la colagenasa p y el espacio DYS. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar con éxito las cuatro subpoblaciones principales de células del estroma de los ganglios linfáticos mientras se conserva la expresión de varias moléculas de superficie útiles para su posterior caracterización y análisis.
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Descripción general
Este procedimiento describe el aislamiento de células estromales de ganglios linfáticos mediante una combinación de digestión enzimática y disgregación mecánica. El método tiene como objetivo preservar la viabilidad y la expresión de marcadores superficiales de las células aisladas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Inmunología
- Investigación de células estromales
Antecedentes
- Las células estromales de los ganglios linfáticos desempeñan un papel fundamental en las respuestas inmunitarias.
- Las técnicas de aislamiento son esenciales para estudiar estas células.
- Los métodos existentes pueden comprometer la viabilidad celular y la integridad de los marcadores superficiales.
- Este estudio presenta una técnica perfeccionada para abordar estos problemas.
Objetivo del estudio
- Aislar eficazmente células estromales viables de ganglios linfáticos.
- Mantener la expresión de moléculas de superficie durante el proceso de aislamiento.
- Mejorar los métodos de aislamiento existentes.
Métodos Utilizados
- Alteración de la cápsula del ganglio linfático.
- Digestión con enzimas colagenasa y DNasa.
- Desagregación mecánica mediante una pipeta multicanal automatizada.
- Caracterización de moléculas de superficie celular mediante citometría de flujo.
Resultados principales
- El método aísla con éxito las células estromales de los ganglios linfáticos.
- Se conserva la viabilidad celular y la expresión de marcadores de superficie.
- La citometría de flujo confirma la integridad de las células aisladas.
- La técnica presenta ventajas frente a los métodos tradicionales.
Conclusiones
- Esta técnica refinada de aislamiento mejora el estudio de las células estromales de los ganglios linfáticos.
- Ofrece un enfoque estandarizado para el aislamiento de células.
- Las investigaciones futuras pueden basarse en estos hallazgos para estudios inmunológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar células estromales de ganglios linfáticos viables con expresión conservada de marcadores de superficie permite reducir mecanismamente los riesgos en la validación de objetivos inmunomoduladores. Este método respalda la confianza predictiva en modelos preclínicos al mantener la fidelidad de la comunicación cruzada entre estroma e inmunidad. Aborda un punto crítico de descubrimiento en el que la integridad de las células estromales influye en el alineamiento de biomarcadores traslacionales y en las decisiones de selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las interacciones estroma-inmunes en la regulación de la respuesta de los linfocitos T citotóxicos.
- Valor operativo: Conserva la expresión de las moléculas superficiales CD31 y gp38 para una identificación precisa de subpoblaciones.
- Valor científico: Facilita la reducción biológica de riesgos de dianas estromales en las vías de homeostasis del tejido linfático.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera suspensiones estandarizadas de células individuales para ensayos basados en citometría de flujo reproducibles.
- Valor operativo: Combina la digestión enzimática con la desagregación mecánica automatizada para mejorar el rendimiento y la viabilidad.
- Valor científico: Proporciona métricas cuantitativas de recuperación de células estromales para la estandarización de ensayos y la reproducibilidad entre laboratorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la funcionalidad de las células estromales para el análisis posterior de la activación y diferenciación de linfocitos.
- Valor operativo: Permite el aislamiento consistente de células reticulares de la zona T, células endoteliales linfáticas, células endoteliales sanguíneas y subpoblaciones doble negativas.
- Valor científico: Facilita la alineación de biomarcadores traslacionales al preservar moléculas de superficie relevantes para la comunicación estroma-inmune.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano donde la viabilidad de las células estromales y la preservación de marcadores son fundamentales para la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en estudios de inmunomodulación.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el aislamiento de células estromales para la validación funcional de dianas en el microentorno del tejido linfático.
- Cribado: Proporciona suspensiones de células individuales reproducibles que permiten ensayos estandarizados basados en células estromales.
- Análisis: Genera muestras listas para citometría de flujo para el análisis cuantitativo de marcadores de superficie y la discriminación de subpoblaciones.
- Investigación Traducional: Mantiene la integridad de la interfaz estromal-inmune para garantizar continuidad preclínica en modelos de tejido linfático.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo enzimático-mecánico estandarizado adaptable a diversos flujos de trabajo de aislamiento de células estromales de tejido linfático.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas estromales mediante la expresión conservada de moléculas superficiales.
- Valor operativo: El protocolo estandarizado reduce la variabilidad en el aislamiento de células estromales entre experimentos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar al reducir la ambigüedad mecanicista en los estudios de interacción estroma-inmune.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas estromales basada en datos preclínicos confiables de células estromales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en digestión enzimática de tejidos y protocolos de tinción para citometría de flujo.
- Depende de una pipeta multicanal automatizada para la disagregación mecánica y de la disponibilidad de enzimas colagenasa/DNasa.
- Necesita la estandarización de los tiempos de digestión y ciclos mecánicos entre usuarios y laboratorios.
- Requiere adaptar las concentraciones de enzimas según la fuente de tejido linfático o los subconjuntos estromales.
- Limitado por la sensibilidad de las células estromales a exposiciones enzimáticas prolongadas, lo que exige pasos de interrupción temporizados.
