Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

El aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y la disgregación mecánica para obtener células reticulares fibroblásticas, células linfáticas y endoteliales sanguíneas. En el procedimiento descrito, se combina una digestión corta con una desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación de los marcadores de superficie de las células estromales de los ganglios linfáticos viables.

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células estromales de los ganglios linfáticos. Esto se logra interrumpiendo primero la cápsula de los ganglios linfáticos. En el segundo paso, los fragmentos de ganglios linfáticos se digieren con colagenasa cuatro y D nase uno.

A continuación, las enzimas se sustituyen por colagenasa D y D nase uno, y los fragmentos se disgregan mecánicamente con una pipeta multicanal automatizada. En última instancia, la expresión de la molécula de la superficie celular de las células de los ganglios linfáticos aislados se puede caracterizar mediante citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente es que con este método, las células SHR de los ganglios linfáticos se digieren mediante un procedimiento enzimático estandarizado complementado con una disgregación mecánica que preserva la viabilidad y la expresión de las moléculas de superficie de las células.

Comience colocando los ganglios linfáticos disecados en una placa de Petri estéril que contenga dos mililitros de medio helado. A continuación, utilice dos jeringas de un mililitro equipadas con agujas de calibre 25 para interrumpir las cápsulas de los ganglios linfáticos. A continuación, transfiera el tejido interrumpido a un tubo cónico de cinco mililitros que contenga 750 microlitros de medio, suplementado con colagenasa cuatro y ADN uno y un agitador magnético.

A continuación, coloque el tubo en un vaso de precipitados que contenga agua precalentada a 37 grados centígrados en un agitador magnético y agite los lodos de celdas a una ronda por segundo durante 30 minutos. Después de agitar, deje que el fragmento de ganglio linfático se asiente y luego retire con cuidado el sobrenadante. Ahora enriquecido para células no estromales, transfiera a los fragmentos de ganglios linfáticos 750 microlitros de medio fresco, suplementado con colagenasa D y D nase uno, y luego agite el tejido durante otros cinco minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, utilice una pipeta multicanal automatizada para desagregar los fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos en un volumen de 700 microlitros durante 10 ciclos a la velocidad máxima y, a continuación, vuelva a agitar los fragmentos de tejido después de 10 minutos. Además, desagregue los grumos de tejido con la pipeta multicanal automatizada durante 99 ciclos a la velocidad máxima. A continuación, añada 7,5 microlitros de EDTA 0,5 molar al tubo y mezcle la suspensión de tejido durante otros 99 ciclos con la pipeta automática.

Después del último ciclo de desagregación, agregue 750 microlitros de medio a la solución celular y filtre las células a través de una malla de nailon de 70 micrómetros. A continuación, pegue las células durante cinco minutos a 1500 Gs y cuatro grados centígrados. Para visualizar las poblaciones de células estromales de los ganglios linfáticos mediante citometría de flujo, tiñe las muestras de células apropiadas con un rastreador de muertos vivos y los anticuerpos de interés en 100 microlitros de HBSS que contienen 2% de FCS durante al menos 20 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad.

A continuación, lavar las células en 500 microlitros de HBSS con FCS y volver a suspender. Los gránulos en 100 microlitros de HBSS y FCS hacen funcionar las células en un citómetro de flujo que expulsa las células CD 45 positivas para excluir las células hematopoyéticas, y luego marchan sobre la población de singletes vivos. Por último, grafique GP 38 frente a CD 31 para visualizar las células reticulares de la zona T, las células endoteliales linfáticas, las células endoteliales sanguíneas y las células dobles negativas.

Poblaciones celulares. El número total de células recuperadas después de la digestión de los subconjuntos de células estromales de los ganglios linfáticos fue ligeramente mayor en el protocolo recién demostrado en comparación con los protocolos de enlace y Fletcher, lo que demuestra que la viabilidad de las células estromales de los ganglios linfáticos después del aislamiento por este protocolo es similar a la recuperada utilizando los protocolos publicados. Las células reticulares de la zona T y las células endoteliales linfáticas aisladas a través de esta y los protocolos de enlace y Fletcher se compararon para la expresión de IAB CD one 40, CD 80, PD L one y CD 40.

La expresión de las cinco moléculas de superficie fue mayor en la digestión con el protocolo recién demostrado y el protocolo de enlace para ambos subconjuntos de células estromalas, lo que sugiere que la degradación de algunas moléculas de superficie por la colagenasa cuatro y D es menos robusta que con la colagenasa p y el espacio DYS. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar con éxito las cuatro subpoblaciones principales de células del estroma de los ganglios linfáticos mientras se conserva la expresión de varias moléculas de superficie útiles para su posterior caracterización y análisis.