Name: Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprende a aislar células estromales de ganglios linfáticos mediante digestión enzimática con colagenasa y DNasa seguida de disgregación mecánica. Este método estandarizado preserva la viabilidad celular y la expresión de moléculas de superficie para su caracterización por citometría de flujo.

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Los autores agradecen a Sanjiv Luther y sus colegas por las útiles discusiones para establecer el protocolo actual de digestión de ganglios linfáticos. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de SNF PPOOA-_119204 y PPOOP3_144918 a S.W.R.

En esta publicación de vídeo y el protocolo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con el protocolo de los animales aprobado por la Autoridad Cantonal Basel-Stadt, Suiza. 1. linfa Preparación de nodos y digestión <ol><li> Agua Pre-calor en un vaso de precipitados a 37 ° C en un agitador magnético con placa de calentamiento. </li><li> Preparar Básica Media de la siguiente manera: medio DMEM (sin piruvato) suplementado con FCS al 2%, 1,2 mM CaCl 2 y Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 mg de estreptomicina). </li><li> Esterilice todos los instrumentos de disección antes de su uso. </li><li> La eutanasia a los ratones donantes nodo linfático por asfixia con CO2 y asépticamente diseccionar los ganglios linfáticos. No diseccionar la grasa circundante. NOTA: Este protocolo está optimizado para el nodo periférico-el drenaje linfático de la piel (inguinal, braquial, axilar). </li><li> Coloque los ganglios linfáticos en una placa de Petri estéril que contiene 2 ml de hielo frío medio básico. </li><li> Interrumpir el ca ganglio linfáticopsule usando dos agujas 25 G fijos en 1 ml jeringa. </li><li> Transferir el tejido del ganglio linfático alterado en un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 750 l medio básico suplementado con 1 mg / ml de colagenasa IV y 40 mg / ml de DNAsa I. </li><li> Añadir un agitador magnético estéril en cada tubo. </li><li> Colocar el tubo en el vaso de precipitados con 37 ° C precalienta el agua y agitar los tubos a una velocidad lenta (1 ronda / seg) durante 30 min. </li><li> Retire el tubo del agitador magnético con placa calefactora y dejar fragmentos de ganglios linfáticos se asientan. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante enriquecido en &quot;células no estromal&quot;. NOTA: Si el análisis de T, B, células dendríticas y CD45 - GP38 - CD31 - se prevé, guarde el &quot;no-células estromales&quot; fracción. </li><li> Lave restante tejido de los ganglios linfáticos una vez con 750 l medio básico. NOTA: Este paso sólo es necesario si se trabaja con ratones inmunocompetentes. </li><li> Deje que los fragmentos de los ganglios linfáticos se asientan. </li><li> Quite elfracción de células flotantes no estromal. </li><li> Añadir a los fragmentos de los ganglios linfáticos medio básico suplementado con 750 l 3,5 mg / ml de colagenasa D y 40 mg / ml de DNasa I. </li><li> Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados que contiene el 37 ° C precalentado agua. </li><li> Digerir el tejido de los ganglios linfáticos durante 5 minutos mientras se agitaba lentamente. </li><li> Ganglios fragmentos de tejido nodo desagregados por pipeteo y la mezcla de 700 l para 10 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado. NOTA: Esto altera el tejido del ganglio linfático para mejorar la digestión. </li><li> Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados con 37 ° C el agua precalentado. </li><li> Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos Digest durante otros 10 minutos, mientras que poco a poco revolviendo. </li><li> Desglosar los fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos con la pipeta y mezclar durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizada. </li><li> Añadir 7,5 l de 0,5 M EDTA para asegurar el mantenimiento de la suspensión de células individuales. </li><li> Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos desagregados por tuberíatting y mezclando durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado. </li><li> Añadir medio básico 750 l y pasar las células a través de una malla de nylon 70 micras. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular 5 min a 1500 × g, 4 ° C. </li><li> Las células estromales se pueden utilizar ahora para su posterior análisis. </li></ol> 2. La tinción de células de ganglio linfático estromales <ol><li> Use una combinación de anti-CD45, anti-podoplanin (GP38), los anticuerpos anti-CD31 para reconocer con éxito las células TRC, LEC, BEC y DN. </li><li> Incubar el tejido del ganglio linfático digerido con vivo rastreador / Dead, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-GP38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) en 100 l de HBSS que contiene 2 % de FCS durante al menos 20 min, 4 ° C, en la oscuridad. </li><li> Lavar las células añadiendo 500 l de HBSS que contenía 2% de FCS </li><li> Se centrifuga la suspensión celular 3 min a 1500 × g, 4 ° C. </li><li> Vuelva a suspender en 100 l de HBSS que contenía 2% de FCS. </li><li> Ejecute las células teñidas en un citómetro de flujo equipped con las siguientes óptica: fuente de excitación con hasta tres láseres: azul (488 nm, enfriado por aire, 20 mW de estado sólido), rojo (633 nm, 17 mW HeNe), y violeta (405 nm, 30 mW estado sólido) . </li><li> Puerta de CD45 - células para excluir las células hematopoyéticas. </li><li> Interiores de puertas (FSC-W) y células vivas (live / perseguidor DEAD) para excluir dobletes y células muertas. </li><li> Terreno GP38 contra CD31 para visualizar TRC (GP38 + CD31 -), LEC (GP38 + CD31 +), BEC (GP38 - CD31 +) células (véase la figura 1) y DN (GP38 - - CD31). </li></ol>

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<li>Nichols, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+self-tolerance+to+a+melanocyte%2Fmelanoma+antigen+derived+from+tyrosinase+is+mediated+by+a+radio-resistant+cell+in+peripheral+and+mesenteric+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes.</a> J Immunol. 179, 993-1003 (2007).</li>
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<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El estudio de las células del estroma de los ganglios linfáticos se convirtió recientemente en un foco de investigación, debido al desarrollo de dos protocolos de digestión publicados 6,13. Ambos protocolos son adecuados para obtener las células del estroma sola ganglios nodo, pero difieren en el uso de enzimas de digestión y el tiempo de digestión. Dado que las células estromales y sus marcadores de superficie son sensibles a la digestión enzimática y la tensión mecánica, se requiere un protocolo optimizado....

Los ganglios linfáticos son compartimentos especializados donde se inician y coordinan la respuesta inmune adaptativa contra extranjeros y los antígenos propios. El procedimiento presentado aquí describe una digestión enzimática corto combinado con pipeteo automatizado mecánica para obtener los ganglios linfáticos suspensión de células individuales y obtener acceso a las células del estroma de ganglios linfáticos viables que mantienen la expresión en la superficie de varias moléculas. Células estromales de los ganglios linfáticos forman el andamiaje de los ganglios linfáticos y cumple tres funciones principales: en primer lugar que filtran los fluidos corporales para degustar antígenos, patógenos y sus patógenos asociados patrón molecular (PAMP), así como las citocinas y peligros asociados patrón molecular (apaga) presente en el cuerpo. En segundo lugar, que atraen e instruyen a las células presentadoras de antígeno (APC) y linfocitos de interactuar e iniciar la respuesta inmune adaptativa; y tercero, que proporcionan un entorno estructural para la homeostasis y la diferenciación de los linfocitos 1-3. Durante la inflamación de los ganglios linfáticos células estromales producen factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas, adaptarse a la hinchazón por lo tanto la organización de la interacción entre las células dendríticas (DCs), y células T B-. La orquestación de las respuestas inmunes sólo es posible debido a la compleja arquitectura estructural formada por diferentes poblaciones de células del estroma. Las células estromales son células de ganglios linfáticos negativos CD45 y se pueden distinguir por la expresión de CD31 o GP38 en las células endoteliales y fibroblásticas 1 -6. GP38 + CD31 - células de la zona T define reticulares (TRC, también conocidos como FRC: células reticulares fibroblásticas), GP38 + CD31 + define células linfáticas endoteliales (LEC), GP38 - CD31 + define las células endoteliales de sangre (BEC). Además, la caracterización de las subpoblaciones reveló la existencia de otras células del estroma de los ganglios linfáticos. De hecho, una pequeña población de células-pericitos se caracterizó como en elGP38 - CD31 - población 7. Por lo tanto, la adaptación del procedimiento de aislamiento es ventajoso para la identificación y caracterización de las propiedades funcionales de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos. Antes del desarrollo de los ganglios linfáticos digestión células estromales de los protocolos de estudio de las células del estroma de ganglios linfáticos se limita a las observaciones in situ usando sección de tejido y la microscopía. Sin embargo, los estudios estructurales y funcionales mostraron características importantes de las células del estroma de los ganglios linfáticos. Células del estroma de ganglios linfáticos están asociados con podoplanin, colágeno y matriz extracelular (ECM), las proteínas para formar un complejo 3 estructura dimensional llamado sistema de conductos, que transporta las proteínas de los ganglios y de masas moleculares asociados de baja desde el seno subcapsular del ganglio linfático a la alta endotelial vénulas en la zona de las células T 8. Países en desarrollo están en estrecho contacto con las células del estroma y puede observarse que sobresale en el aire tubularestructura de conducto a la muestra de fluido y detectar antígenos 8. La interacción de las células del estroma de ganglios linfáticos (TRC y LEC) con DCS es mediada por la liberación y la presentación de quimiocinas CCL21 y CCL19 9,10. CCL19 y CCL21 son reconocidos por el receptor CCR7 facilitar países en desarrollo y las células T de migrar al ganglio linfático zona de células T 4,11. A pesar de utilizar quimiocinas similares, las células DCs y T tienen diferentes rutas de migración hacia los ganglios linfáticos 12. Más tarde, usando digestión enzimática de los ganglios linfáticos y el aislamiento de las células estromales de ganglios linfáticos puros, se realizaron estudios funcionales sobre el papel de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y de su capacidad para interactuar con los DC y células T / B 6,13. En primer lugar, la diafonía entre IFN-γ que producen células T efectoras y las células del estroma de ganglios linfáticos induce la producción del óxido nítrico metabolito se muestra para amortiguar las respuestas de células T y la proliferación en los órganos linfoides secundarios 14-16. En segundo lugar, la linfa ncélulas estromales ode se han reportado para apoyar la diferenciación de subconjuntos de regulación de corriente continua a través de la producción de IL-10 17, y para modular la homeostasis de las células T naïve a través de la producción de IL-7 6,18. En tercer lugar, la expresión de TLR en las células del estroma de ganglios linfáticos sugiere que las células estromales son susceptibles a la señal derivada de una infección o de auto-moléculas liberado durante la lesión de los tejidos. De hecho, el tratamiento de las células del estroma de los ganglios linfáticos con el ligando de TLR3 poli (I: C) induce un modesto regulación positiva de la expresión principal de histocompatibilidad de clase I y la regulación positiva de la molécula inhibidora de la co-PD-L1, pero no de moléculas coestimuladoras, que resulta en cambios dramáticos en el tejido periférico antígenos expresión 19. Varios grupos han demostrado las células del estroma de los ganglios linfáticos expresan antígenos de tejidos periféricos e inducen la tolerancia de las células T autorreactivas 19,21-27. Por lo tanto, la comprensión de las interacciones entre las células del estroma de los ganglios linfáticos y la otra re migratoria ycélulas de nódulos linfáticos Sident ayudarán a encontrar nuevas moléculas diana para permitir la activación o supresión de las respuestas inmunes durante la inflamación. Por lo tanto, se necesita la aplicación de la separación enzimática publicada del ganglio linfático. Protocolos previamente publicados utilizan diferentes combinaciones de a base de colagenasa digestión enzimática con menores esfuerzos mecánicos 6,19,20. Sin embargo, las incubaciones largas con las enzimas de fermentación y de la diferente combinación de enzimas de digestión pueden degradar diversas moléculas de la superficie necesaria para analizar el estado de activación y la identificación de nuevas células del estroma de los ganglios linfáticos. Dependiendo del tipo del análisis de células del estroma, el Protocolo de Enlace o protocolo Fletcher podrían ser más adecuado. En el procedimiento descrito, una digestión enzimática ligeramente más corto se combina con desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación del marcador de superficie de los ganglios viable células estromales nodo. Este procedimiento permite el aislamiento y altamente reproducibledistinción de los ganglios linfáticos poblaciones de células del estroma con baja variabilidad y más de 95% de viabilidad. Las células del estroma de ganglios linfáticos recién aisladas se pueden utilizar directamente para la expresión de marcadores de superficie, el análisis de proteínas, y los estudios de la transcripción, así como el establecimiento de líneas de células estromales para llevar a cabo ensayos funcionales in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Concentración final 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>Concentración final 1,2 mM</td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>>160 unidades por mg de peso seco, uso a la concentración final de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche 11088882001</td><td></td><td>uso a 3,5 mg/ml</td></tr><tr><td>de ADNasa I</td><td>Roche &nbsp;</td><td>11284932001</td><td>uso a 40 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Imanes de agitación</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm de largo-2 mm y barra;</td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fondo redondo 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético con función</td><td>de calentamiento Estándar IKA-RCT</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 100 mm, estéril</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>agujas de 25 G Terumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti ratón CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>anti ratón CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>anti ratón Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>anti ratón CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clon MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, Multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &micro; l volumen máx.</td></tr><tr><td>anti ratón CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>anti ratón CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>anti ratón CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>anti ratón I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>anti ratón CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Reparable Kit de tinción de células muertas en infrarrojo cercano</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Los órganos linfoides secundarios, incluidos los ganglios linfáticos, están compuestos por células estromales que proporcionan un entorno estructural para la homeostasis, activación y diferenciación de los linfocitos. Se han identificado varios subconjuntos de células estromales por la expresión de la molécula de adhesión CD31 y la glicoproteína podoplanina (gp38), células reticulares de la zona T o células reticulares fibroblásticas, células endoteliales linfáticas, células endoteliales sanguíneas y pericitos similares a FRC dentro de la población de células dobles negativas. Para todas las poblaciones se describen diferentes funciones, entre ellas, la separación y el revestimiento de diferentes compartimentos, la atracción e interacción con diferentes tipos de células, la filtración de los fluídicos drenantes y la contracción de los vasos linfáticos. En los últimos años, diferentes grupos han descrito un papel adicional de las células estromales en la orquestación y regulación de las respuestas de las células T citotóxicas potencialmente peligrosas para el huésped. 
Los ganglios linfáticos son estructuras complejas con muchos tipos de células diferentes y, por lo tanto, requieren un procedimiento adecuado para el aislamiento de las poblaciones celulares deseadas. Actualmente, los protocolos para el aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos se basan en la digestión enzimática con tiempos de incubación variables; Sin embargo, las células estromales y sus moléculas de superficie son sensibles a estas enzimas, lo que provoca la pérdida de la expresión de marcadores de superficie y la muerte celular. En este caso, se propone un breve protocolo de digestión enzimática combinado con una disrupción mecánica automatizada para obtener una suspensión viable de células individuales de células estromales de ganglios linfáticos que mantengan su expresión de moléculas de superficie.

El presente protocolo es un protocolo de digestión modificado publicado por Link et al., 2007 6 con un tiempo de digestión más corto (45 min máximo) debido a la disgregación mecánica con una pipeta multicanal automatizada. Además, el procedimiento es más uniforme, minimiza la degradación de marcadores de superficie en diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y permite la manipulación de más de una muestra a la vez. La colagenasa IV y colagenasa D en Enlac...

El aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y la disgregación mecánica para obtener células reticulares fibroblásticas, células linfáticas y endoteliales sanguíneas. En el procedimiento descrito, se combina una digestión corta con una desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación de los marcadores de superficie de las células estromales de los ganglios linfáticos viables.

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células estromales de los ganglios linfáticos. Esto se logra interrumpiendo primero la cápsula de los ganglios linfáticos. En el segundo paso, los fragmentos de ganglios linfáticos se digieren con colagenasa cuatro y D nase uno.A continuación, las enzimas se sustituyen por colagenasa D y D nase uno, y los fragmentos se disgregan mecánicamente con una pipeta multicanal automatizada. En última instancia, la expresión de la molécula de la superficie celular de las células de los ganglios linfáticos aislados se puede caracterizar mediante citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente es que con este método, las células SHR de los ganglios linfáticos se digieren mediante un procedimiento enzimático estandarizado complementado con una disgregación mecánica que preserva la viabilidad y la expresión de las moléculas de superficie de las células.Comience colocando los ganglios linfáticos disecados en una placa de Petri estéril que contenga dos mililitros de medio helado. A continuación, utilice dos jeringas de un mililitro equipadas con agujas de calibre 25 para interrumpir las cápsulas de los ganglios linfáticos. A continuación, transfiera el tejido interrumpido a un tubo cónico de cinco mililitros que contenga 750 microlitros de medio, suplementado con colagenasa cuatro y ADN uno y un agitador magnético.A continuación, coloque el tubo en un vaso de precipitados que contenga agua precalentada a 37 grados centígrados en un agitador magnético y agite los lodos de celdas a una ronda por segundo durante 30 minutos. Después de agitar, deje que el fragmento de ganglio linfático se asiente y luego retire con cuidado el sobrenadante. Ahora enriquecido para células no estromales, transfiera a los fragmentos de ganglios linfáticos 750 microlitros de medio fresco, suplementado con colagenasa D y D nase uno, y luego agite el tejido durante otros cinco minutos a 37 grados centígrados.A continuación, utilice una pipeta multicanal automatizada para desagregar los fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos en un volumen de 700 microlitros durante 10 ciclos a la velocidad máxima y, a continuación, vuelva a agitar los fragmentos de tejido después de 10 minutos. Además, desagregue los grumos de tejido con la pipeta multicanal automatizada durante 99 ciclos a la velocidad máxima. A continuación, añada 7,5 microlitros de EDTA 0,5 molar al tubo y mezcle la suspensión de tejido durante otros 99 ciclos con la pipeta automática.Después del último ciclo de desagregación, agregue 750 microlitros de medio a la solución celular y filtre las células a través de una malla de nailon de 70 micrómetros. A continuación, pegue las células durante cinco minutos a 1500 Gs y cuatro grados centígrados. Para visualizar las poblaciones de células estromales de los ganglios linfáticos mediante citometría de flujo, tiñe las muestras de células apropiadas con un rastreador de muertos vivos y los anticuerpos de interés en 100 microlitros de HBSS que contienen 2% de FCS durante al menos 20 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad.A continuación, lavar las células en 500 microlitros de HBSS con FCS y volver a suspender. Los gránulos en 100 microlitros de HBSS y FCS hacen funcionar las células en un citómetro de flujo que expulsa las células CD 45 positivas para excluir las células hematopoyéticas, y luego marchan sobre la población de singletes vivos. Por último, grafique GP 38 frente a CD 31 para visualizar las células reticulares de la zona T, las células endoteliales linfáticas, las células endoteliales sanguíneas y las células dobles negativas.Poblaciones celulares. El número total de células recuperadas después de la digestión de los subconjuntos de células estromales de los ganglios linfáticos fue ligeramente mayor en el protocolo recién demostrado en comparación con los protocolos de enlace y Fletcher, lo que demuestra que la viabilidad de las células estromales de los ganglios linfáticos después del aislamiento por este protocolo es similar a la recuperada utilizando los protocolos publicados. Las células reticulares de la zona T y las células endoteliales linfáticas aisladas a través de esta y los protocolos de enlace y Fletcher se compararon para la expresión de IAB CD one 40, CD 80, PD L one y CD 40.La expresión de las cinco moléculas de superficie fue mayor en la digestión con el protocolo recién demostrado y el protocolo de enlace para ambos subconjuntos de células estromalas, lo que sugiere que la degradación de algunas moléculas de superficie por la colagenasa cuatro y D es menos robusta que con la colagenasa p y el espacio DYS. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar con éxito las cuatro subpoblaciones principales de células del estroma de los ganglios linfáticos mientras se conserva la expresión de varias moléculas de superficie útiles para su posterior caracterización y análisis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Un modo eficaz de aislar los linfocitos de ratón tracto genital se describe. Este método tiene la ventaja de digestión enzimática y separación por gradiente de Percoll para permitir el aislamiento eficiente. Esta técnica es también adaptable a para su uso en otras...

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Se describe la generación de quimeras de ganglios linfáticos/almohadillas de grasa para el estudio del origen de las células estromales de los ganglios linfáticos. El método implica el aislamiento de ganglios linfáticos de ratones recién nacidos y almohadillas de grasa embrionaria, la generación de almohadillas quiméricas de grasa de ganglios linfáticos y su transferencia debajo de la cápsula renal de un ratón huésped.

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía mesentérica murina segura y bien tolerada en cada una de las cuatro estaciones a lo largo de la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos. Este procedimiento es adaptable para permitir la interrupción selectiva de la comunicación linfática con el colon distal, el colon proximal y/o el intestino delgado.

Linfodenectomía mesentérica murina por alteración selectiva de la comunicación linfática con el intestino específico de la región

Aprende a aislar células estromales de ganglios linfáticos mediante digestión enzimática con colagenasa y DNasa seguida de disgregación mecánica. Este método estandarizado preserva la viabilidad celular y la expresión de moléculas de superficie para su caracterización por citometría de flujo.

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

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