Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la dinámica de los hoyos individuales recubiertos de clatrina en células vivas. Esto se logra mediante la transección de proteínas endocíticas y de carga marcadas con fluorescencia en una línea celular de adherencia. El siguiente paso es obtener imágenes de las células con reflexión interna total, fluorescencia o microscopía de césped.

A continuación, se cuantifica manualmente la vida útil de pequeños conjuntos de pozos recubiertos de clatrina mediante un programa de procesamiento y análisis de imágenes. El paso final es cuantificar la vida útil de los pozos recubiertos de clatrina mediante detección y análisis automatizados objetivos. En última instancia, la microscopía de césped se utiliza para cuantificar la dinámica de los hoyos individuales recubiertos de clatrina con una resolución de evento único para investigar la endocitosis mediada por clatrina de los receptores acoplados a proteínas G.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico de membranas, como por ejemplo cómo el ensamblaje y la dinámica de la endocitosis pueden cambiar en función de las diferentes proteínas endocíticas y proteínas de carga presentes. Para comenzar, transfecte células HEC 2 93 con plásmidos que codifican receptores acoplados a proteínas G tag o GPCR y/o componentes de la maquinaria Claro. En una placa de 12 pocillos, como se detalla en el protocolo de texto, al día siguiente de la transfección, agregue 0,5 mililitros de solución salina tamponada con fosfato, o PBS, con un milimolar de EDTA a cada una.

Bueno, luego coloque tres rondas estériles de 25 milímetros de tapa en pozos separados de seis. Placa de pocillos: Llene cada pocillo con dos mililitros de medio. Empuje suavemente el cubreobjetos hasta el fondo del pocillo para evitar que las células crezcan en la parte inferior del cubreobjetos.

A continuación, agite manualmente un pocillo de la placa de 12 pocillos para levantar las celdas del fondo del pocillo. Agregue un mililitro de DM EM con 10%FBS para reenviar. A continuación, distribuya las celdas levantadas de un pocillo de manera uniforme entre los tres cubreobjetos.

Permita que las células crezcan en los cubreobjetos durante al menos 48 horas antes de la toma de imágenes. También asegúrese de que las células estén dispersas y planas para obtener imágenes de la fosa recubierta de clatrina y la dinámica de la carga. En primer lugar, preincube las células con anticuerpos como se describe en el protocolo de texto.

Luego, prepárese para transferir el cubreobjetos a una cámara de imágenes de células vivas utilizando un par de pinzas y una aguja de calibre 25 doblada en la punta en un gancho. Sostenga el par de pinzas en la mano dominante. Sostenga la aguja doblada en la otra.

Gire la aguja hasta que el gancho se curve hacia abajo hacia el vidrio. Arrastre suavemente el lado del gancho de la aguja hacia abajo a través de la parte inferior de una placa de seis pocillos hasta que se enganche en el cubreobjetos. Tenga cuidado de no rayar la superficie del cubreobjetos, ya que desprenderá las células.

Levante suavemente la tapa desde el fondo del pozo. Equilibre el cubreobjetos contra la pared del pozo para apoyarlo. Use las pinzas para agarrar cerca del borde del cubreobjetos y mueva el lado de la celda del cubreobjetos hacia la cámara de imágenes.

Ensamble la cámara y agregue 700 microlitros de medio de imagen precalentado. Después de transferir la cámara al microscopio, enfoque las células con un objetivo de inmersión en aceite de césped Visualice las células en los modos convencionales de iluminación epi, fluorescencia o confocal para identificar las células que expresan las construcciones apropiadas como una precaución de seguridad importante. Tenga siempre en cuenta el ángulo del rayo láser y diríjalo siempre lejos del observador.

A continuación, concéntrese en la superficie inferior de una célula expresiva hasta que el contorno de la membrana plasmática alrededor de la célula desaparezca y aparezca la superficie inferior de la célula. Esto es más evidente con una proteína de carga localizada en la membrana plasmática, como el receptor opioide mu. Si se utilizan los mismos láseres para la obtención de imágenes en epifluorescencia convencional, aumente el ángulo de incidencia del láser hasta que esté fuera de foco.

La fluorescencia en el interior de la célula desaparece y no se ve ningún contorno de la membrana plasmática alrededor de la célula. Una vez en el césped, asegúrese de que el láser de excitación se refleje a través del objetivo y no sea visible por encima del objetivo. Al verificar si el punto láser es visible, refina el enfoque para obtener una imagen nítida.

Una vez identificadas las células, adquiera imágenes al menos cada tres segundos durante 10 minutos. Repita todos los pasos para obtener una imagen de celdas adicionales. Para comenzar el análisis de la dinámica endocítica, abra el archivo en la imagen J.Las imágenes se almacenan como una sola pila de archivos TIFF.

Con canales intercalados. Convierta las imágenes en hiperpilas seleccionando hiperpilas de imágenes y pila en hiperpila en la ventana emergente. Introduzca el número de canales adquiridos.

Introduzca uno para Zack e introduzca el número de fotogramas de la película. El formato hyper stack produce una ventana con dos barras de desplazamiento. Use la barra superior para moverse a través de los canales y la barra inferior para moverse a través del tiempo.

Desplácese hasta el canal de la proteína cuyo tiempo de vida se analizará. Vaya más allá del primer fotograma de la película para reducir la inclusión de pozos recubiertos de clatrina preexistentes o CCP cuyas duraciones completas no son visibles. Dibuja una región de interés o ROI alrededor de un punto elegido al azar.

Cuente el número de fotogramas que un punto está visible. Para comenzar el análisis con reconocimiento de objetos, abra el archivo de imagen sin procesar en el software de análisis de imágenes emergido de forma predeterminada. Aparece la imagen en color.

Utilice la ventana de ajuste de pantalla para ajustar el brillo de un canal. Haga clic en el nombre de un canal para cambiar el color mostrado. Desmarque la casilla junto al canal para evitar que se muestre.

Crea manchas haciendo clic en el icono con manchas naranjas. Seleccione un ROI alrededor de la celda utilizándola para excluir las áreas que detectarán incorrectamente los bordes delanteros brillantes y las placas. Mida el diámetro de una mancha para proporcionar estimaciones iniciales para el algoritmo.

Cambie al modo de corte y haga clic en los extremos polares de un punto para medir su diámetro. Haga esto para cuatro o cinco manchas redondas que parezcan indicativas de un PCC en el apogeo de su estabilidad después de la formación antes de la cesión, use estas medidas para calcular el diámetro promedio hasta la décima de micra más cercana. Para detectar puntos que vuelven al modo de repaso, seleccione el canal adecuado para la detección.

Introduzca el diámetro medio medido, normalmente de 0,3 o 0,4 micras. Haga clic en la flecha azul hacia adelante para cuantificar las manchas. Filtre los puntos por calidad ajustando el filtro para capturar tantos puntos como sea posible sin fondo.

El filtro de calidad está seleccionado de forma predeterminada. Utilice la curva de calidad como guía para establecer un umbral adecuado. Mueva el umbral inferior del filtro con el botón izquierdo del ratón a esta primera caída en la curva.

Este es un buen punto de partida para el filtro. Ya que esta posición generalmente refina la detección a solo puntos visibles. Eliminar las manchas de superficie en el punto de edición La pantalla cambia a seleccionar el modo y haga clic en el punto Después de que se vuelva amarillo, haga clic en eliminar.

A continuación, haga clic en la flecha azul para continuar con la creación del algoritmo. Mide las pistas configurándolas en brownie en movimiento. El PCCh no debe exhibir ningún movimiento dirigido, solo una deriva mínima a través de la membrana plasmática.

Este algoritmo es el más apropiado para ese movimiento. A continuación, establezca la distancia máxima en un valor pequeño, como 0,7 micras. Establecer una distancia pequeña minimiza la conexión de los puntos adyacentes y aún permite el seguimiento continuo de un punto de celda a través de CCP o movimiento de celda.

A continuación, establezca el tamaño máximo del espacio en uno. Esto permite que la pista continúe si solo falta un fotograma. En sucesión, tamaños de espacio de más de tres hace que diferentes pistas se vinculen incorrectamente entre sí.

El siguiente paso es cambiar la visualización de pistas a cola de dragón. Desplácese por la película observando la calidad de detección. Si se están conectando puntos adyacentes, disminuya la distancia máxima por debajo de 0,7 micras.

Si los puntos se dividen con demasiada facilidad, aumente el tamaño máximo del espacio. Haga clic en la flecha azul para crear pistas. Esto lleva a la pantalla de filtro de pistas para filtrar pistas.

Use un filtro de intensidad para eliminar las placas brillantes adicionales. A continuación, utilice un filtro de desplazamiento para eliminar los endosomas que entran en el campo de césped. Tenga cuidado, ya que los puntos más largos también tendrán un desplazamiento más largo.

Haga clic en la doble flecha verde para completar el protocolo. Para exportar datos, vaya a la pestaña de estadísticas. Haga clic en el icono de un solo disquete para exportar la estadística seleccionada.

Haga clic en el icono que parece una serie de disquetes para exportar todas las estadísticas. Al centrarse en la membrana plasmática adherente A y en el modo confocal, se revela una célula que está llena de fluorescencia tenue. Por el contrario, centrarse en el centro de la célula revela la membrana plasmática como un anillo de fluorescencia alrededor de la célula.

La fluorescencia fuera de foco se hace evidente al cambiar a epi, fluorescencia o césped convencional con un ángulo incorrecto. Cuando el ángulo del césped es correcto, la membrana plasmática es muy nítida, clara y brillante, y está desenfocada. La fluorescencia ya no interrumpe la imagen.

Cuando la beta arrestina está en una piscina citosólica, hay muy poco en el campo de césped y parece borroso y con foco externo. Una vez que el MOR es activado por el agonista, la beta, la arrestina se recluta a la membrana plasmática y tanto la beta arrestina como el receptor se redistribuyen a los CCP. La duración de estos clústeres se cuantifica manualmente.

Usando los tres parámetros para la endocitosis completa, las manchas que denotan PCC pueden desaparecer por completo, parpadear y apagarse, o pellizcar una estructura más grande. Aquí se muestra un CCP detectado usando un MA Después de filtrar para eliminar las estructuras de placa no dinámicas, las esferas blancas superpuestas, denotan manchas detectadas, también se excluyeron con el filtro de calidad los puntos más tenues que no se pudieron detectar durante toda su vida útil. Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo visualizar pozos codificados por catéter individuales usando microscopía de césped.