Name: Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprende a visualizar la endocitosis mediada por clatrina en células vivas mediante microscopía TIRF. Este protocolo permite cuantificar la dinámica de vesículas individuales y estudiar receptores acoplados a proteínas G.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a los Dres. C. Szalinski, H. Teng y M. Bruchez por su ayuda con Imaris, R. Vistein y D. Shiwarski por su ayuda técnica y consejo, y al Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin y Dr. W Almers por los reactivos y la útil discusión. Los fondos proporcionados por la subvención T32 NS007433 a SLB y NIH DA024698 y DA036086 a MAP.

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li>
<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li>
<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe el uso de TIRFM para visualizar la endocitosis mediada por clatrina (CME) a ​​nivel de individuo PCC en las células vivas en tiempo real. CME es un evento rápido y muy dinámico mediada por el efecto acumulativo de muchos eventos espacial y temporalmente separados individuales. La mayoría de los ensayos que se utilizan actualmente, como las mediciones bioquímicas de internalización mediante biotinilación superficie o de unión del ligando, la citometría de flujo o ensayos de células fijas que miden la can...

El proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME) depende de la llegada oportuna de los muchos componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina para recoger y manipular la carga de la membrana plasmática en las vesículas 1-3. CME es iniciada por proteínas de deformación de la membrana y del adaptador de carga que se unen en sitios nacientes de endocitosis 1. Estas proteínas reclutan la proteína de la cubierta de clatrina, que se ensambla en una estructura en forma de jaula que forma la fosa revestidas de clatrina (CCP) 4. Una vez que el CCP está completamente montado en una forma esférica, la escisión de la membrana, principalmente a través de la acción de la gran GTPasa, dynamin, genera vesículas revestidas de clatrina libres (CCV) 5,6. Esta internalización desencadena un rápido desmontaje de la capa de clatrina, lo que permite a los componentes ser reutilizados para múltiples rondas de CME. El descubrimiento y caracterización de las proteínas implicadas en CME se ha basado en Bioch tradicional, y las técnicas de microscopía genéticos emical 4-6,8. Estos ensayos han aclarado las funciones y puntos de interacción de estos componentes endocítica. Aunque muy útil para definir los componentes esenciales de la maquinaria de tráfico, estos ensayos son muy limitados en capturar el comportamiento dinámico de los componentes de CME o concentración de carga. Esta es una limitación crítica, ya que CME es impulsada por el conjunto coreografiado de conjuntos de módulos de la proteína en pasos definidos, y puesto que los pequeños cambios en la dinámica de los acontecimientos endocíticas individuales puede tener grandes consecuencias acumulativas sobre la endocitosis. Además, datos recientes indican que los PCC individuales pueden diferir tanto en la composición como en el comportamiento, lo que sugiere que la regulación fisiológica de este proceso es altamente espacial y temporalmente limitado 9-14. Visualización de eventos endocíticas individuales, por lo tanto, es esencial para entender por qué hay múltiples proteínas redundantes involucrados en CME y b cómo podrían controlarse estas proteínasseñales fisiológicas Y para regular la internalización de carga. Aquí se describe el uso de Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) para observar CME en el nivel de la dinámica de los PCC individuales en las células vivas. TIRFM se basa en la diferencia en el índice de refracción entre el cubreobjetos de vidrio y el entorno fluido de células 15,16. Cuando la luz de excitación se dirige hacia las células en más que el ángulo crítico, se refleja internamente, creando una onda evanescente que mantiene un campo delgada de iluminación que se extiende aproximadamente 100 nm por encima del cubreobjetos. Esto garantiza que sólo las moléculas fluorescentes dentro de este estrecho campo están entusiasmados. Prácticamente, esto permite la excitación de las moléculas fluorescentes en o cerca de la membrana plasmática, y minimiza la fluorescencia de las partes interiores de la célula. Esto proporciona una relación señal-ruido y eje z significativamente mayor resolución para visualizar los eventos en la membrana plasmática, COmpared a los modos más comúnmente usados ​​tales como epifluorescencia convencional o microscopía de fluorescencia confocal. También describimos, en una introducción y nivel práctico, el uso de una plataforma de análisis de imagen comúnmente utilizado para analizar y cuantificar características y dinámica de los acontecimientos endocítica de carga individuales morfológicos simples.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Glucosa alta con L-glutamina y piruvato de sodio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3024301</tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco, de Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Ácido libre de EDTA</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco, de Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr> Medio <tr><td>L-15 de Leibovitz, sin rojo fenol</td><td>Gibco, de Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, de Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE de Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>de 25 mm cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Matraces tratados con cultivo celular Corning, 25 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-One, de VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG</td><td></td></tr><tr><td>[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sal de acetato de encefalina (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Kit</td> <td>de etiquetado de proteínasLife Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Imaris Software de análisis de imágenes</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, para análisis automatizado</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti y accesorios necesarios, incluidos cubos de filtro y filtros</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Brazo TIRF con los adaptadores necesarios para Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td> Para ajustar el <td></td><td>ángulo de incidencia</td></tr><tr><td>iXon+ EMCCD cámara y adaptadores</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de endocitosis mediada por clatrina de g receptores acoplados a proteínas en la resolución individual de eventos a través de tirf de microscopía

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Muchos receptores de señalización importantes se internalizan a través del bien estudiado proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME). Los ensayos biológicos celulares tradicionales, que miden los cambios globales en la endocitosis, han identificado más de 30 componentes conocidos que participan en CME, y los estudios bioquímicos han generado un mapa de interacción de muchos de estos componentes. Sin embargo, cada vez está más claro que la EMC es un proceso muy dinámico cuya regulación es compleja y delicada. En este manuscrito, describimos el uso de la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar directamente la dinámica de los componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina, en tiempo real en células vivas, a nivel de eventos individuales que median este proceso. Este enfoque es esencial para dilucidar los cambios sutiles que pueden alterar la endocitosis sin bloquearla globalmente, como se ve con la regulación fisiológica. Nos centraremos en el uso de esta técnica para analizar un área de interés emergente, el papel de la composición de la carga en la modulación de la dinámica de distintos pozos recubiertos de clatrina (CCP). Este protocolo es compatible con una variedad de sondas de fluorescencia ampliamente disponibles, y se puede aplicar para visualizar la dinámica de muchas moléculas de carga que se internalizan desde la superficie celular.

Uso de células vivas TIRF de Microscopía hemos registrado la dinámica endocítica de la μ-opioide-receptor (MOR), un receptor acoplado a proteína G (GPCR) y su endocítica proteína adaptadora β-arrestina. El constructo de β-arrestina se transfectó transitoriamente en una línea celular que expresa de forma estable MOR usando el protocolo descrito en la Figura 1, y la imagen 96 horas más tarde. El MOR en la línea celular estable es N-terminal marcado con una GFP sensible al pH. Esta proteína fluorescente só...

Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la dinámica de los hoyos individuales recubiertos de clatrina en células vivas. Esto se logra mediante la transección de proteínas endocíticas y de carga marcadas con fluorescencia en una línea celular de adherencia. El siguiente paso es obtener imágenes de las células con reflexión interna total, fluorescencia o microscopía de césped.A continuación, se cuantifica manualmente la vida útil de pequeños conjuntos de pozos recubiertos de clatrina mediante un programa de procesamiento y análisis de imágenes. El paso final es cuantificar la vida útil de los pozos recubiertos de clatrina mediante detección y análisis automatizados objetivos. En última instancia, la microscopía de césped se utiliza para cuantificar la dinámica de los hoyos individuales recubiertos de clatrina con una resolución de evento único para investigar la endocitosis mediada por clatrina de los receptores acoplados a proteínas G.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico de membranas, como por ejemplo cómo el ensamblaje y la dinámica de la endocitosis pueden cambiar en función de las diferentes proteínas endocíticas y proteínas de carga presentes. Para comenzar, transfecte células HEC 2 93 con plásmidos que codifican receptores acoplados a proteínas G tag o GPCR y/o componentes de la maquinaria Claro. En una placa de 12 pocillos, como se detalla en el protocolo de texto, al día siguiente de la transfección, agregue 0,5 mililitros de solución salina tamponada con fosfato, o PBS, con un milimolar de EDTA a cada una.Bueno, luego coloque tres rondas estériles de 25 milímetros de tapa en pozos separados de seis. Placa de pocillos: Llene cada pocillo con dos mililitros de medio. Empuje suavemente el cubreobjetos hasta el fondo del pocillo para evitar que las células crezcan en la parte inferior del cubreobjetos.A continuación, agite manualmente un pocillo de la placa de 12 pocillos para levantar las celdas del fondo del pocillo. Agregue un mililitro de DM EM con 10%FBS para reenviar. A continuación, distribuya las celdas levantadas de un pocillo de manera uniforme entre los tres cubreobjetos.Permita que las células crezcan en los cubreobjetos durante al menos 48 horas antes de la toma de imágenes. También asegúrese de que las células estén dispersas y planas para obtener imágenes de la fosa recubierta de clatrina y la dinámica de la carga. En primer lugar, preincube las células con anticuerpos como se describe en el protocolo de texto.Luego, prepárese para transferir el cubreobjetos a una cámara de imágenes de células vivas utilizando un par de pinzas y una aguja de calibre 25 doblada en la punta en un gancho. Sostenga el par de pinzas en la mano dominante. Sostenga la aguja doblada en la otra.Gire la aguja hasta que el gancho se curve hacia abajo hacia el vidrio. Arrastre suavemente el lado del gancho de la aguja hacia abajo a través de la parte inferior de una placa de seis pocillos hasta que se enganche en el cubreobjetos. Tenga cuidado de no rayar la superficie del cubreobjetos, ya que desprenderá las células.Levante suavemente la tapa desde el fondo del pozo. Equilibre el cubreobjetos contra la pared del pozo para apoyarlo. Use las pinzas para agarrar cerca del borde del cubreobjetos y mueva el lado de la celda del cubreobjetos hacia la cámara de imágenes.Ensamble la cámara y agregue 700 microlitros de medio de imagen precalentado. Después de transferir la cámara al microscopio, enfoque las células con un objetivo de inmersión en aceite de césped Visualice las células en los modos convencionales de iluminación epi, fluorescencia o confocal para identificar las células que expresan las construcciones apropiadas como una precaución de seguridad importante. Tenga siempre en cuenta el ángulo del rayo láser y diríjalo siempre lejos del observador.A continuación, concéntrese en la superficie inferior de una célula expresiva hasta que el contorno de la membrana plasmática alrededor de la célula desaparezca y aparezca la superficie inferior de la célula. Esto es más evidente con una proteína de carga localizada en la membrana plasmática, como el receptor opioide mu. Si se utilizan los mismos láseres para la obtención de imágenes en epifluorescencia convencional, aumente el ángulo de incidencia del láser hasta que esté fuera de foco.La fluorescencia en el interior de la célula desaparece y no se ve ningún contorno de la membrana plasmática alrededor de la célula. Una vez en el césped, asegúrese de que el láser de excitación se refleje a través del objetivo y no sea visible por encima del objetivo. Al verificar si el punto láser es visible, refina el enfoque para obtener una imagen nítida.Una vez identificadas las células, adquiera imágenes al menos cada tres segundos durante 10 minutos. Repita todos los pasos para obtener una imagen de celdas adicionales. Para comenzar el análisis de la dinámica endocítica, abra el archivo en la imagen J.Las imágenes se almacenan como una sola pila de archivos TIFF.Con canales intercalados. Convierta las imágenes en hiperpilas seleccionando hiperpilas de imágenes y pila en hiperpila en la ventana emergente. Introduzca el número de canales adquiridos.Introduzca uno para Zack e introduzca el número de fotogramas de la película. El formato hyper stack produce una ventana con dos barras de desplazamiento. Use la barra superior para moverse a través de los canales y la barra inferior para moverse a través del tiempo.Desplácese hasta el canal de la proteína cuyo tiempo de vida se analizará. Vaya más allá del primer fotograma de la película para reducir la inclusión de pozos recubiertos de clatrina preexistentes o CCP cuyas duraciones completas no son visibles. Dibuja una región de interés o ROI alrededor de un punto elegido al azar.Cuente el número de fotogramas que un punto está visible. Para comenzar el análisis con reconocimiento de objetos, abra el archivo de imagen sin procesar en el software de análisis de imágenes emergido de forma predeterminada. Aparece la imagen en color.Utilice la ventana de ajuste de pantalla para ajustar el brillo de un canal. Haga clic en el nombre de un canal para cambiar el color mostrado. Desmarque la casilla junto al canal para evitar que se muestre.Crea manchas haciendo clic en el icono con manchas naranjas. Seleccione un ROI alrededor de la celda utilizándola para excluir las áreas que detectarán incorrectamente los bordes delanteros brillantes y las placas. Mida el diámetro de una mancha para proporcionar estimaciones iniciales para el algoritmo.Cambie al modo de corte y haga clic en los extremos polares de un punto para medir su diámetro. Haga esto para cuatro o cinco manchas redondas que parezcan indicativas de un PCC en el apogeo de su estabilidad después de la formación antes de la cesión, use estas medidas para calcular el diámetro promedio hasta la décima de micra más cercana. Para detectar puntos que vuelven al modo de repaso, seleccione el canal adecuado para la detección.Introduzca el diámetro medio medido, normalmente de 0,3 o 0,4 micras. Haga clic en la flecha azul hacia adelante para cuantificar las manchas. Filtre los puntos por calidad ajustando el filtro para capturar tantos puntos como sea posible sin fondo.El filtro de calidad está seleccionado de forma predeterminada. Utilice la curva de calidad como guía para establecer un umbral adecuado. Mueva el umbral inferior del filtro con el botón izquierdo del ratón a esta primera caída en la curva.Este es un buen punto de partida para el filtro. Ya que esta posición generalmente refina la detección a solo puntos visibles. Eliminar las manchas de superficie en el punto de edición La pantalla cambia a seleccionar el modo y haga clic en el punto Después de que se vuelva amarillo, haga clic en eliminar.A continuación, haga clic en la flecha azul para continuar con la creación del algoritmo. Mide las pistas configurándolas en brownie en movimiento. El PCCh no debe exhibir ningún movimiento dirigido, solo una deriva mínima a través de la membrana plasmática.Este algoritmo es el más apropiado para ese movimiento. A continuación, establezca la distancia máxima en un valor pequeño, como 0,7 micras. Establecer una distancia pequeña minimiza la conexión de los puntos adyacentes y aún permite el seguimiento continuo de un punto de celda a través de CCP o movimiento de celda.A continuación, establezca el tamaño máximo del espacio en uno. Esto permite que la pista continúe si solo falta un fotograma. En sucesión, tamaños de espacio de más de tres hace que diferentes pistas se vinculen incorrectamente entre sí.El siguiente paso es cambiar la visualización de pistas a cola de dragón. Desplácese por la película observando la calidad de detección. Si se están conectando puntos adyacentes, disminuya la distancia máxima por debajo de 0,7 micras.Si los puntos se dividen con demasiada facilidad, aumente el tamaño máximo del espacio. Haga clic en la flecha azul para crear pistas. Esto lleva a la pantalla de filtro de pistas para filtrar pistas.Use un filtro de intensidad para eliminar las placas brillantes adicionales. A continuación, utilice un filtro de desplazamiento para eliminar los endosomas que entran en el campo de césped. Tenga cuidado, ya que los puntos más largos también tendrán un desplazamiento más largo.Haga clic en la doble flecha verde para completar el protocolo. Para exportar datos, vaya a la pestaña de estadísticas. Haga clic en el icono de un solo disquete para exportar la estadística seleccionada.Haga clic en el icono que parece una serie de disquetes para exportar todas las estadísticas. Al centrarse en la membrana plasmática adherente A y en el modo confocal, se revela una célula que está llena de fluorescencia tenue. Por el contrario, centrarse en el centro de la célula revela la membrana plasmática como un anillo de fluorescencia alrededor de la célula.La fluorescencia fuera de foco se hace evidente al cambiar a epi, fluorescencia o césped convencional con un ángulo incorrecto. Cuando el ángulo del césped es correcto, la membrana plasmática es muy nítida, clara y brillante, y está desenfocada. La fluorescencia ya no interrumpe la imagen.Cuando la beta arrestina está en una piscina citosólica, hay muy poco en el campo de césped y parece borroso y con foco externo. Una vez que el MOR es activado por el agonista, la beta, la arrestina se recluta a la membrana plasmática y tanto la beta arrestina como el receptor se redistribuyen a los CCP. La duración de estos clústeres se cuantifica manualmente.Usando los tres parámetros para la endocitosis completa, las manchas que denotan PCC pueden desaparecer por completo, parpadear y apagarse, o pellizcar una estructura más grande. Aquí se muestra un CCP detectado usando un MA Después de filtrar para eliminar las estructuras de placa no dinámicas, las esferas blancas superpuestas, denotan manchas detectadas, también se excluyeron con el filtro de calidad los puntos más tenues que no se pudieron detectar durante toda su vida útil. Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo visualizar pozos codificados por catéter individuales usando microscopía de césped.

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía es un enfoque poderoso para observar las estructuras cerca de la superficie celular en alto contraste y resolución temporal. Se demuestra cómo TIRF puede ser empleado para estudiar la dinámica de proteínas en la corteza de la pared celular-cerrados células bacterianas y fúngicas.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

Este video describe TIRF, una técnica basada en microscopía de reflexión interna total para visualizar la dinámica de polimerización de actina y microtúbulos. El método permite obtener imágenes de alta resolución de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos en tiempo real, lo cual es esencial para comprender las diafonías celulares.

Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Fuente: Winkle, C. C., et al. Utilización de metodologías combinadas para definir el papel de la administración de membrana plasmática durante la ramificación de axones y la morfogénesis neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos en neuronas corticales. Un marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensible al pH emite fluorescencia tras la fusión de vesículas, con excitación selectiva...

Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para la visualización de eventos exocíticos 

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Este artículo proporciona un método para investigar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma, utilizando una construcción de sinaptobrevina2-pHluorin y Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total. También se reporta la estrategia desarrollada para el procesamiento de imágenes y análisis de datos.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Aprende a visualizar la endocitosis mediada por clatrina en células vivas mediante microscopía TIRF. Este protocolo permite cuantificar la dinámica de vesículas individuales y estudiar receptores acoplados a proteínas G.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía (Video) | JoVE Journal

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Explorar más videos