Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la inestabilidad genómica en linfocitos B de ratón. Esto se logra aislando primero las células B para el cultivo celular primario. A continuación, se fijan las células facilitando la preparación de las propagaciones de la metafase.

Por último, se realiza un análisis de los telómeros PNA para la visualización de los telómeros marcados con fluorescencia. En última instancia, el nivel de varios tipos de aberraciones cromosómicas se puede cuantificar mediante microscopía fluorescente. Las implicaciones de esta técnica pueden ampliar nuestra comprensión de las vías de reparación del ADN, ya que puede ayudar a identificar genes que promueven la estabilidad genómica en nuestros modelos de ratón objetivo.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las roturas cromosómicas y otros grandes reordenamientos cromosómicos, también se puede adaptar para medir otras formas de inestabilidad genómica, como las translocaciones. Para aislar las células B, comience colocando un bazo recién aislado en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contenga dos mililitros de tampón de lavado en una campana de flujo laminar. A continuación, utilice la parte trasera del émbolo de una jeringa de cinco mililitros para macerar suavemente el bazo.

A continuación, filtre la lechada de tejido a través de un colador de malla de nailon de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros utilizando el émbolo para presionar suavemente los trozos más grandes de tejido a través del colador. Enjuague la placa y la jeringa con ocho mililitros de tampón de lavado y filtre el lavado a través del colador. Luego, después de girar las celdas, pipetee el pellet hacia arriba y hacia abajo varias veces en tres mililitros de un tampón de lisis CK.

Después de cinco minutos, detenga la reacción con 10 mililitros de tampón de lavado. Luego, después de volver a girar las celdas, golpee la parte inferior del tubo para volver a suspender el pellet y agregue un mililitro de tampón de lavado a las celdas. A continuación, incube las células con 50 microlitros de micro perlas anti CD 43 max en hielo.

Después de 30 minutos, lave suavemente las células con 10 mililitros de tampón de lavado. Durante la centrifugación, coloque una columna minimax en el imán y un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado debajo de la columna. A continuación, añada un mililitro de tampón de lavado a la columna, recogiendo el EIT en el tubo.

Vuelva a suspender el gránulo de celda en un mililitro de tampón de lavado y luego cargue las celdas en la columna Después de que la muestra haya pasado, enjuague la columna con un mililitro de tampón de lavado y agregue siete mililitros de tampón de lavado directamente a la muestra recolectada. Después de contar las células recolectadas, transfiéralas a un tubo de 50 mililitros para centrifugarlas. Luego, para activar las células B, vuelva a suspender el pellet a una vez 10 de las seis células por mililitro en un medio de células B suplementado e incube las células en placas de seis pocillos a cinco mililitros de células por pocillo en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para fijar las células B.

A continuación, a 50 microlitros de smid a cada uno de los pocillos. Después de una incubación de una hora a 37 grados centígrados, transfiera las células B a un tubo marcado de 15 mililitros. Cubre la etiqueta con cinta adhesiva y gira las celdas.

A continuación, aspire todo menos un mililitro de sobrenadante y vuelva a suspender el pellet mediante pipeteo. Agregue cinco mililitros de 37 grados centígrados, cloruro de potasio, gota a gota mientras pulsa en un vórtice. A continuación, añada 10 mililitros adicionales de cloruro de potasio y mezcle la solución celular por inversión.

A continuación, incuba las células en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, añade cinco gotas de mezclado fijador fresco una vez más invirtiendo. A continuación, girar las células después de resus suspendiendo el pellet en un mililitro de sobrenadante, añadir cinco mililitros de fijador fresco, gota a gota mientras pulsa en un vórtice e incubar las células y 10 mililitros adicionales de fijador a temperatura ambiente.

Después de 30 minutos, granule las células y retire todo menos un mililitro del fijador. Luego, después de lavar las células, dos veces más en 15 mililitros de fijador, vuelva a suspender el pellet en los últimos 70 microlitros del sobrenadante. Ahora coloque los portaobjetos etiquetados en un ángulo de 35 grados en una cámara de humedad ajustada a 22,9 grados Celsius y 52% de humedad.

Deje caer 35 microlitros de las células B resuspendidas en cada portaobjetos, preparando dos portaobjetos por muestra. Luego, después de dejar que los portaobjetos se sequen en la cámara de humedad durante 30 minutos, guarde los portaobjetos en una caja de portaobjetos a 37 grados centígrados hasta que estén completamente secos. Una vez seco, use un bolígrafo de diamante para marcar un área de 18 por 18 milímetros para la hibridación en la parte posterior de cada portaobjetos para desnaturalizar los portaobjetos para los peces.

A continuación, aplique 120 microlitros de amida en forma desionizada al 70% en cubreobjetos de 24 milímetros por 60 milímetros y, a continuación, toque cada portaobjetos con un cubreobjetos. Desnaturalice los portaobjetos en una placa calefactora a 80 grados centígrados durante 90 segundos y, a continuación, deslícelos rápida y cuidadosamente por los portaobjetos de la cubierta y consecutivamente. Coloque los portaobjetos en etanol helado al 70, 90 y 100% etanol cada uno durante tres minutos Después de que los portaobjetos se hayan secado, colóquelos en una cámara húmeda y aplique la mezcla de sonda previa a la necesidad en las áreas marcadas en los portaobjetos.

Cubra la mezcla de la sonda con un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros e incube los portaobjetos a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, lave las diapositivas en dos XSSC previamente advertidas con agitación. Después de cinco minutos, aplique 35 microlitros de medio de montaje moyal a los portaobjetos.

Cubra el medio con cubreobjetos de 24 milímetros por 60 milímetros y guarde los portaobjetos a cuatro grados centígrados. Por último, analice los portaobjetos de metafase utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar. Los cromosomas en metafase derivados de una célula de ratón deben formar un grupo discreto que contenga 40 cromosomas.

Cada cromosoma tiene un centrómero en un extremo, cerca de dos señales de telómeros, así como dos señales de telómeros adicionales en el otro extremo del cromosoma. Las roturas de cromátidas son roturas en una de las dos cromátidas hermanas que componen cada cromosoma en metafase. En algunos casos, el extremo roto del cromosoma se puede observar como un fragmento con señales de telómeros en la misma metafase distendida.

Los radiocromosomas son reordenamientos complejos que involucran dos cromosomas. Los cromosomas también pueden unirse para formar cromosomas dicéntricos, que aparecen como fusiones de extremo a extremo de cromosomas con centrómeros en ambos extremos. Las translocaciones robertsonianas son un tipo de translocación entre los centrómeros de dos cromosomas, que aparecen como cuatro brazos cromáticos hermanos unidos a un solo centrómero.

En esta última imagen, se muestra una metafase que no tiene señales de telómeros presentes. La ausencia de señales de telómeros puede ocurrir por errores en la preparación de la sonda o por burbujas de aire debajo del cubreobjetos durante la hibridación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis del ciclo celular y la información del colon, para responder a preguntas adicionales, como si el aumento de la inestabilidad genómica afecta a la viabilidad celular.