Name: Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a cuantificar inestabilidad genómica en linfocitos B de ratón mediante PNA-FISH. Este protocolo utiliza hibridación fluorescente in situ para visualizar telómeros y detectar aberraciones cromosómicas.

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Este trabajo es apoyado por el NIH subvención R00 CA160574 (SFB) y por una beca del Programa de Entrenamiento de Biotecnología Rutgers (a SMM).

Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en Rutgers, la Universidad Estatal de Nueva Jersey. Los ratones fueron tratados de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los científicos deberían consultar a sus organizaciones animalistas nacionales e institucionales de las normas establecidas y aprobadas. Antes de comenzar, preparar las soluciones enumeradas en la Tabla 1. Aislamiento Celular 1 B y Activación La eutanasia a un ratón utilizando CO 2 seguido por dislocación cervical. Coloque el ratón para que el lado izquierdo del cuerpo está en marcha y rociar el ratón con etanol al 70% hasta que la piel está húmeda. Diseccionar el bazo y el lugar en un 35 mm placa de cultivo de tejidos con tampón de lavado 2 ml. En una campana de flujo laminar, romper suavemente el bazo en la placa de cultivo de tejidos utilizando el extremo plano de una jeringa de 5 ml. <ol><li> Inserte una malla de nylon de 70 micras en un 50tubo ml y transferir la muestra de bazo en 2 ml de tampón de lavado al interior de la malla de nylon. Interrumpir suavemente el bazo en la malla utilizando el extremo plano de la jeringa. </li><li> Enjuague la parte posterior de la jeringa y la placa de 35 mm con 8 ml de tampón de lavado y filtrado a través de la malla de nylon 70 micras. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 ml de tampón de lisis ACK. Pipetear hacia arriba y abajo para interrumpir brevemente montones e incubar durante 5 min. Añadir 10 ml de tampón de lavado y se centrifuga a 300 g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado tocando el fondo del tubo y luego con la pipeta en 1 ml de tampón de lavado. Añadir 50 l de anti-CD43 MACS micro-cuentas e incubar en hielo durante 30 min. Añadir 10 ml de tampón de lavado, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Añadir 10 ml de tampón de lavado, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Establecer unColumna Mini-MACS mediante la colocación de una columna en el imán MACS. Coloque un tubo cónico de 15 ml etiquetados bajo la columna. Añadir 1 ml de tampón de lavado a la columna y dejar correr a través de al tubo de 15 ml. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de lavado. Cargar la muestra en la columna después el tampón de lavado se ha ejecutado a través. </li><li> Después de que la muestra ha ejecutar a través de la columna, añadir 1 ml de tampón de lavado para lavar la columna. Añadir 7 ml de tampón de lavado directamente a la muestra recogida en el tubo de 15 ml. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Transferir el volumen requerido de células necesarias para 5.000.000 células / pocillo en un tubo de 50 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suplemento medio de células B con LPS 1: 500 y 1 IL4: 1000. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir el volumen apropiado de medio de células B suplementado necesaria para la concentración final de 1.000.000 células / ml. </li><li> Células de la placa en placas de 6 pocillos con 5 ml de células a 1.000.000 de células / ml y colocar en un humidified incubadora de cultivo celular a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Fijación Cell 2 B <ol><li> Añadir 50 l de colcemid al pozo que contiene 5 ml de las células B (para una concentración final de 100 ng / ml) y se incuba 1 hora a 37 ° C. Precalentar 75 mM KCl solución en un baño a 37 ° C. Transferencia de las células B a un tubo de 15 ml etiquetados. Cubra la etiqueta con cinta y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo y resuspender el pellet mediante pipeteo. Añadir 5 ml de la caída de KCl precalentado a gota mientras golpea o pulsante en un vórtice. </li><li> Añadir 10 ml de KCl y mezclar invirtiendo. Incubar en un 37 ° C baño de agua durante 15 min. Añadir 5 gotas de fijador fresco y mezcla por inversión. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo y resuspender el pellet pipeteando arriba y abajo. </li><li> Añadir 5 ml de fijador fresco gota a gota mientras golpea o pulsante en un vortex. Añadir otros 10 ml de fijador y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en tubo y resuspender con la pipeta. Añadir 14 ml de fijador fresco y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Repita el paso 2.7 en dos ocasiones más. </li><li> Añadir 14 ml de fijador. Selle los tapones con Parafilm y almacenar toda la noche a -20 ° C. </li></ol> 3 Preparación de las extensiones de cromosomas en metafase <ol><li> Establezca una cámara ambiental regulada a 22,9 ° C y 52% de humedad. </li><li> Centrifugar las células B fijado a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar fijador dejando 70 l en el tubo y resuspender mediante pipeteo. </li><li> Coloque las diapositivas marcadas en la cámara de humedad en un ángulo de 35 °. Gota 35 l de las células B resuspendidas en un portaobjetos y soltar dos portaobjetos por muestra. Deje que los portaobjetos se sequen en la cámara de humedad durante 30 minutos y luego guardar las diapositivasen una caja de portaobjetos a 37 ° C. </li></ol> 4. telómeros PNA FISH <ol><li> Preparación de la sonda <ol><li> Pre-caliente formamida desionizada a 37 ° C. Mezclar 2 l de sonda de APN de los telómeros con 7 l de formamida desionizada precalentada y se incuba a 37 ° C con agitación durante 1 hr. </li><li> Pre-caliente mezcla maestra FISH a 37 ° C. Añadir 7 l precalentado mezcla maestra FISH a la mezcla del paso 4.1.1 y se incuba a 37 ° C durante 1-3 horas. </li><li> Desnaturalizar la mezcla de la sonda durante 8 minutos a 80 ° C. Pre-hibridar la sonda durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol></li><li> Pretratamiento de portaobjetos cromosómicos <ol><li> Pre-calentar un tarro de cristal deslizable tinción que contiene 50 ml de HCl 0,01 M a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Colocar los portaobjetos en un tarro de cristal deslizable tinción diferente que contiene 2x SSC durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2 l de pepsina de stock al vidrio precalentado slide-tinción frasco y mezclar invirtiendo. Transferir las diapositivas a este sl vidriojar ide-tinción e incubar 90 segundos a 37 ° C. </li><li> Lave las diapositivas 2x en un frasco de vidrio deslizable tinción diferente que contiene 1x PBS durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente, agitando. A continuación, lavar los portaobjetos durante 5 minutos en 1x PBS / MgCl2 a temperatura ambiente, agitando. </li><li> Transferir los portaobjetos a un tarro de cristal deslizante de tinción recién preparada que contenía 1% de formaldehído-/ 1x PBS / MgCl $ 2 durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en un frasco de vidrio deslizable tinción diferente que contiene 1x PBS a temperatura ambiente, agitando. </li><li> Preparar una serie de deshidratación de etanol por tener vidrio separada frascos de deslizamiento de tinción que contienen 70%, 90% y 100% de etanol. </li><li> Transferir los portaobjetos a cada frasco durante 3 min, empezando con etanol al 70%, luego 90% de etanol, y luego etanol al 100%. Coloque los tarros de etanol a -20 ° C cuando haya terminado. </li><li> Permitir las diapositivas se sequen al aire tocando el exceso de etanol en una toalla de papel y apuntalar las diapositivas en un ángulo de 35 °. Una vez seco, mark un área de 18 x 18 mm para la hibridación en la parte posterior de las diapositivas utilizando una pluma de diamante. </li></ol></li><li> La desnaturalización de las diapositivas para FISH <ol><li> Aplicar formamida 120 l 70% desionizada / 2X SSC a un cubreobjetos de 24 x 60 mm. Toca la diapositiva a la cubreobjetos. Desnaturalizar la diapositiva a 80 ° C en una placa caliente durante 90 segundos. </li><li> Rápida y cuidadosamente deslice el cubreobjetos y colocar el portaobjetos en hielo frío etanol al 70% durante 3 min, seguido de etanol 90% y etanol al 100% durante 3 min cada uno. Permitir las diapositivas se sequen al aire. </li><li> Preparar una cámara húmeda por el forro una caja de plástico con tapa hermética y un pañuelo de papel mojado. El papel debe estar húmedo, pero no saturado con agua. </li><li> En una cámara húmeda, aplique la mezcla de sondas pre-recocido desde el paso 4.1.3 a la zona marcada en el portaobjetos, cubra con una tapa deslizante mm 18 x 18 y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. </li></ol></li><li> Los lavados post-incubación <ol><li> Pre-caliente 50% de formamida / SSC 2x, 1x SSC, y 4x SSC / 0,1% de Tween-20 en unos 45 °; C baño de agua. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos y lavar los portaobjetos en pre-calentado 50% formamida / 2 × SSC 3xfor 5 minutos cada uno en la oscuridad y temblando. Se lavan los portas en pre-calentado 1x SSC 3xfor 5 minutos cada uno, temblando. Finalmente, lavar los portaobjetos en pre-calentado 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min cada uno. </li><li> Teñir las diapositivas durante 3 min en DAPI en una luz protegida vidrio deslizable tinción frasco. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en 2x SSC, temblando. Aplique 35 l de medio de montaje Mowiol, cubrir con 24 x 60 mm cubreobjetos y almacenar las diapositivas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. microscópica Análisis de Cromosomas <ol><li> Analizar las diapositivas en metafase utilizando un microscopio de epi-fluorescencia estándar. Utilice una plataforma de imágenes con una etapa automatizada como la plataforma MetaSystems Metafer para obtener mejores resultados. Para cada extensión metafase, recoger una imagen de fluorescencia DAPI para visualizar los cromosomas, y una imagen de la señal fluorescente del telómero pbata. (Por ejemplo, Cy3 otros compuestos fluorescentes están disponibles y funcionan igual de bien.) </li><li> Superposición de las imágenes con un programa de análisis de imagen y analizar. </li></ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses en conflicto.

Mientras que los linfocitos B activados son particularmente adecuados para la preparación de extensiones de cromosomas mitóticos, también se pueden utilizar otros tipos de células. Linfocitos T compartir muchas de las ventajas de las células B, ya que pueden ser purificados a partir de los nodos de bazo o de los ganglios, y tienen un alto índice mitótico cuando son estimuladas por el crecimiento en medio que contiene mitógenos apropiados 8. Las células madre embrionarias (células ES) también son adecuados par...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

El cáncer es causado por la acumulación de mutaciones que afectan a genes que regulan el crecimiento celular normal. La mutación es una consecuencia de cambios en la estructura y la secuencia del genoma causado por el daño al ADN. Daño del ADN puede ocurrir a través de una variedad de procesos, incluyendo agentes exógenos tales como la radiación ionizante y, como un subproducto del metabolismo celular normal, tales como desaminación espontánea de bases de nucleótidos o daños que se producen por el contacto con especies reactivas de oxígeno 1. Aunque las células de mamíferos poseen una gama de actividades de reparación que puede revertir el daño de ADN o restaurar la secuencia en los sitios de ruptura, sin embargo, las mutaciones se acumulan durante toda la vida de una célula. Daño del ADN puede contribuir además a senescencia y pérdida de potencia de las células madre, dos procesos que están asociados con la enfermedad de envejecimiento asociado 2. La comprensión de la reparación del daño en el ADN es, por tanto, de vital importancia en el tratamiento de dos signocuestiones ificant en la salud pública. La evidencia creciente sugiere que las vías de reparación del ADN de mamíferos pueden contribuir a la evolución del genoma de células de cáncer 3,4, lo que hace aún más imprescindible para entender los procesos implicados en la supresión de la mutación a nivel molecular. La visualización directa de las aberraciones cromosómicas es un potente y cuantitativos medio de determinar el grado de inestabilidad genómica en un tipo de célula particular. Cromosomas condensados ​​a partir de células en metafase se pueden aislar e inspeccionados usando luz o microscopía fluorescente. Tales enfoques citogenéticos han sido en la práctica desde hace varias décadas y se pueden utilizar para demostrar la aparición de translocaciones o tipos específicos de aberraciones cromosómicas asociadas con la pérdida de las actividades de reparación del ADN. El protocolo se presta a varias prórrogas posibles: los cromosomas se pueden marcar con sondas para cariotipo espectral (SKY) o fluorescente multicolor de hibridación in situ(MFISH) para identificar las translocaciones 5,6. Estas técnicas permiten también la frecuencia de las translocaciones cromosómicas y la estructura de las translocaciones cromosómicas complejas por determinar, que proporciona información adicional más allá de lo que es posible con este protocolo. Alternativamente, las sondas específicas de secuencia pueden ser generados y utilizados para probar la frecuencia de rotura del ADN en sitios genómicos seleccionados 7. En este protocolo, se describe la preparación de los cromosomas en metafase se propaga a partir de linfocitos B. Se utiliza un ácido nucleico (PNA) péptido-sonda marcada con fluorescencia para las repeticiones teloméricas, que marca de manera eficiente los telómeros en el cromosoma en metafase se extiende Este protocolo tiene varias ventajas. Las células B pueden ser inducidas a crecer a alto índice mitótico de modo que los diferenciales de alta calidad consistentemente pueden ser producidos. Células B de ratones genéticamente modificados son también mucho menos probable que contenga mutaciones genéticas secundarias que pueden confundir el análisis de la contribuciónde genes específicos a la integridad genómica. El enfoque PNA-FISH se puede completar en un día, y permite anotar más precisa de roturas cromosómicas. Mediante el uso de este enfoque, sobre todo en combinación con el equipo específico que se describe en este protocolo, es posible producir, los diferenciales de alta calidad muy consistentes y analizar rápidamente la velocidad y el tipo de inestabilidad genómica.

<table><tbody><tr><td>50% Sulfato de dextrano</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu; g)</td> <td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Sonda de telómeros</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td> <td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr> <tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) micro-perlas</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Cámara de secado citogenético</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos b de ratón por pna-fish

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Reparación del ADN defectuoso provoca un aumento de la inestabilidad genómica, que es la causa raíz de las mutaciones que conducen a la tumorigénesis. Análisis de la frecuencia y tipo de aberraciones cromosómicas en diferentes tipos de células permite defectos en las vías de reparación del ADN no se ha dilucidado. Entender la biología de reparación del ADN de los mamíferos se ha ayudado en gran medida por la producción de ratones con nocauts en genes específicos. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica en los linfocitos B de ratón. Etiquetado de los telómeros con sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico - hibridación fluorescente in situ) facilita el análisis rápido de la inestabilidad genómica en las extensiones de cromosomas en metafase. Células B tienen ventajas específicas relativas a los fibroblastos, porque tienen la ploidía normal y un índice mitótico superior. Cultivo a corto plazo de las células B, por tanto, permite la medición precisa de la inestabilidad genómica en una población celular primaria que es probable que tenga mutación genética secundaria menoss de lo que se encuentra típicamente en fibroblastos transformados o líneas de células de pacientes.

Los cromosomas en metafase de una célula derivados deben formar un clúster discreta que contiene 40 cromosomas (si usando células de ratón) (Figura 1A). Cada cromosoma tiene un centrómero en un extremo, que es visible como una esfera de color azul claro. En cromosomas normales, dos señales de los telómeros son vistos en el extremo de las cromátidas y dos señales por cada centrómero. Núcleos en interfase estarán presentes en la diapositiva también. Estos serán visibles como esferas azul, con señales de t...

Vías de reparación del ADN son esenciales para el mantenimiento de la integridad genómica y la prevención de la mutación y el cáncer. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica mediante la observación directa de las aberraciones cromosómicas en metafase se propaga a partir de células B de ratón utilizando hibridación in situ fluorescente (FISH) para las repeticiones teloméricas de ADN.

Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la inestabilidad genómica en linfocitos B de ratón. Esto se logra aislando primero las células B para el cultivo celular primario. A continuación, se fijan las células facilitando la preparación de las propagaciones de la metafase.Por último, se realiza un análisis de los telómeros PNA para la visualización de los telómeros marcados con fluorescencia. En última instancia, el nivel de varios tipos de aberraciones cromosómicas se puede cuantificar mediante microscopía fluorescente. Las implicaciones de esta técnica pueden ampliar nuestra comprensión de las vías de reparación del ADN, ya que puede ayudar a identificar genes que promueven la estabilidad genómica en nuestros modelos de ratón objetivo.Aunque este método puede proporcionar información sobre las roturas cromosómicas y otros grandes reordenamientos cromosómicos, también se puede adaptar para medir otras formas de inestabilidad genómica, como las translocaciones. Para aislar las células B, comience colocando un bazo recién aislado en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contenga dos mililitros de tampón de lavado en una campana de flujo laminar. A c

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

Chromosomics: Detección de alteraciones numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos de manera simultánea utilizando un nuevo ensayo FISH OctoChrome

Los cromosomas se pueden aislar de las células vivas, tales como linfocitos o fibroblastos de la piel, y a partir de organismos, incluyendo seres humanos o ratones. Estas preparaciones cromosómicas se pueden utilizar más de rutina bandeo G y procedimientos citogenéticos moleculares como la hibridación fluorescente in situ (FISH), la hibridación genómica comparada (CGH) y cariotipo espectral (SKY).

Cromosoma Preparación de las células cultivadas

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Este protocolo describe las técnicas para la cuantificación y caracterización de aberraciones cromosómicas in vitro en macrófagos de ratón RAW264.7 después del tratamiento con la materia en partículas del aire ambiente.

El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

El presente protocolo describe la utilidad de la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH) y el cariotipo espectral (SKY) en la identificación de aberraciones estables intercromosómicas en las células de la médula ósea de ratones después de la exposición a la irradiación corporal total.

La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

El objetivo de esta técnica de squash del túbulo es rápidamente evaluar características citológicas de desarrollo espermatocitos de ratón mientras que preserva la integridad celular. Este método permite el estudio de todas las etapas de la espermatogénesis y puede implementarse fácilmente junto a otros enfoques biológicos bioquímicos y moleculares para el estudio de la meiosis de ratón.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Las propagaciones de superficies nucleares son una herramienta indispensable para estudiar los eventos cromosómicos durante la meiosis. Aquí demostramos un método para preparar y visualizar cromosomas meióticos durante la profase I a partir de espermacitos de peces brabra.

Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

Aquí se presenta un ensayo para cuantificar la hipermutación somática dentro del locus genético de cadena pesada de inmunoglobulina utilizando células del centro germinal B de los parches del ratón Peyer.

Análisis de la hipermutación somática en el intron JH4 de células germinales del centro B de parches de Mouse Peyer

El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Aprende a cuantificar inestabilidad genómica en linfocitos B de ratón mediante PNA-FISH. Este protocolo utiliza hibridación fluorescente in situ para visualizar telómeros y detectar aberraciones cromosómicas.

Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

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