Un Modelo de Aprendizaje lateralizado de Olor en ratas recién nacidas para disecar Formación Neural Circuito Recalces Memoria

Este protocolo introduce el aprendizaje lateral temprano de la preferencia por el olor en ratas utilizando oclusiones agudas de una sola nariz. Esto se logra construyendo primero tapones nasales de polietileno extraíbles. El segundo paso es ocluir el Aries deseado antes del entrenamiento conductual.

A continuación, prepare la ropa de cama perfumada y luego entrene al animal en la ropa de cama perfumada mientras lo acaricia con un pincel. El paso final es probar la preferencia de olor lateralizada utilizando un aparato de prueba de dos opciones. En última instancia, la inmunohistoquímica de la proteína de unión al elemento de respuesta al amplificador C fosforilada o P crib se utiliza para demostrar el silenciamiento unilateral de la actividad neuronal debido a la reclusión única y la reversibilidad del método.

La principal ventaja de esta técnica que existe entre los métodos de control animal es que somos capaces de reducir la variabilidad y el número de animales a través de la naturaleza de nuestro diseño experimental de control intraanimal antes de la capa postnatal 11, debido a la falta de proyecciones de composiciones anteriores maduras de MA, que dos hemisferios olfativos no están conectados. Esto nos permite manipular un hemisferio independientemente del otro a través de la oclusión de nutrición única. Los hemisferios ocluidos sirven como control intraanimal.

Aunque esta técnica se centra en el aprendizaje olfativo en ratas neonatas, las implicaciones nos permitirán responder a preguntas fundamentales sobre los procesos neuronales durante el aprendizaje y la memoria, como la plasticidad sináptica, la metaplásica y sus mecanismos moleculares subyacentes. Las conclusiones extraídas de los estudios que utilizan este método pueden generalizarse a los principios básicos del aprendizaje y la memoria y a los mamíferos, especialmente durante los períodos críticos postnatales. Esto nos ayudará a construir un fondo prometedor para posibles terapias para la pérdida de memoria asociada con condiciones fisiopatológicas.

Este método también es muy adecuado para otros procesos relacionados con el olfato, como la percepción de olores y el recubrimiento de olores. El tapón nasal está construido con tubos de polietileno 20 y tres hilos de sutura de seda cero. Primero, corte un pequeño trozo de polietileno 22 a aproximadamente 0,8 centímetros.

A continuación, pase la sutura de seda a través del tubo preparado de modo que quede hilo a ambos lados de la sección del tubo. En un extremo de la rosca fuera del tapón, haz un nudo. Tira de la sección del tubo hacia abajo sobre el nudo de la rosca.

El nudo debe alojarse dentro del tubo. Recorta ambos extremos de la rosca, de modo que sobresalgan unos dos milímetros de rosca de un extremo del tubo. Para comenzar este procedimiento, retire al cachorro de la madre y colóquelo en un plato seguro cubierto con ropa de cama regular.

Con un aplicador de punta de algodón, frote una gelatina anestésica local, 2% de xilocaína en el Aries que se va a ocluir. Deje que el cachorro descanse en el plato durante unos tres minutos. Lucin en el cachorro es el paso más crítico en este procedimiento.

La cura debe tomarse durante la inserción del tapón nasal para prevenir el sangrado y el daño tisular. A continuación, levante al cachorro y sujételo suave pero firmemente en la mano no dominante con la mano dominante, levante una nariz, tape y frote la misma gelatina anestésica local alrededor de la punta de la que no sobresale el hilo. Esto actuará como un anestésico para cualquier dolor menor asociado con la inserción del tapón y un lubricante dentro del nes.

Inserte suavemente el tapón nasal sujetando firmemente el cachorro y girando lentamente el tapón con empujones muy suaves hasta que el tapón esté completamente insertado y solo sobresalga la rosca de dos milímetros del Aries. No debe haber sangrado de ninguno de los dos Aries durante este proceso. Las crías con sangrado durante la inserción del tapón nasal no se pueden usar para el experimento.

Deje que el animal descanse en el plato durante cinco minutos para que se habitúe al tapón Antes de comenzar el entrenamiento para evitar la contaminación por olores, prepare la ropa de cama perfumada en una campana extractora y, mientras usa guantes nuevos, coloque 500 mililitros de ropa de cama de astillas de madera en una bolsa de plástico. Use una jeringa para extraer 0,3 mililitros de extracto de menta y rocíelo sobre la ropa de cama en la bolsa de plástico. Ate la bolsa para cerrarla, agite la bolsa vigorosamente y deje que la ropa de cama descanse en la bolsa durante cinco minutos, coloque la ropa de cama perfumada en una caja de entrenamiento acrílica transparente y poco profunda de 20 por 20 por cinco centímetros descubierta en la campana extractora durante cinco minutos antes de usarla.

Una vez que la ropa de cama esté preparada, deseche los guantes usados. No permita que los guantes entren en contacto con los animales. Coloque 500 mililitros de ropa de cama sin perfume en otra caja de entrenamiento acrílica limpia y asegúrese de que no entre en contacto con ropa de cama perfumada o guantes usados.

Comience el paradigma de condicionamiento del olor colocando al cachorro habituado en la ropa de cama perfumada para obtener un olor experimental. Además de cachorros positivos para OS en el accidente cerebrovascular. Acaricia al cachorro durante 30 segundos.

Con un pincel pequeño, use movimientos circulares rápidos principalmente alrededor de la región trasera del cachorro. Las caricias inducen la liberación de norepinefrina al bulbo olfatorio y a la corteza olfativa. Esto sirve como un estímulo incondicional.

Deje que el cachorro descanse durante 30 segundos. Repite los 30 segundos de caricias, seguidos de 30 segundos de descanso para un total de 10 minutos. Cuando se completen los 10 emparejamientos de caricias más olor, retire al cachorro de la caja de acondicionamiento.

Retire el tapón nasal y devuelva el cachorro a la madre para su control. Cachorros negativos para el sistema operativo solo con olor. Coloque al cachorro habituado en la ropa de cama perfumada durante 10 minutos sin acariciarlo.

Después de 10 minutos, retire al cachorro de la caja de acondicionamiento. Retire el tapón nasal y devuelva al cachorro a la madre. La prueba de preferencia de olor lateralizada se realiza en varios puntos de tiempo después de la sesión de entrenamiento final.

Las pruebas se llevan a cabo en una cámara de pruebas de acero inoxidable de 30 por 20 por 18 centímetros que se coloca encima de dos cajas de entrenamiento acrílicas separadas por una zona neutral de dos centímetros. Una caja de entrenamiento contiene ropa de cama perfumada, mientras que la otra caja contiene ropa de cama limpia y sin perfume. Prepare una ropa de cama con aroma a menta y una ropa de cama sin perfume como se muestra anteriormente, y coloque cada caja debajo de los lados opuestos de la cámara de prueba.

A dos centímetros de distancia. Coloque la malla de plástico en el piso de rejilla metálica de la cámara de prueba. Retire la P de la presa y coloque un poco de grasa de silicona inodora en el Aries que está ocluido.

Durante el entrenamiento, la grasa se puede volver a aplicar durante el primer procedimiento de prueba según sea necesario. Coloque al cachorro en la zona neutral de la cámara de prueba. Permita que el cachorro explore la cámara durante un minuto registrando cuánto tiempo pasó el cachorro en los dos lados de la cámara, es decir, sobre menta o ropa de cama con aroma neutro.

Transfiera al cachorro a una cámara de retención de plástico cubierta y déjelo reposar durante un minuto. Repita las pruebas de prueba durante un total de 10 minutos, cambiando la orientación inicial del cachorro en la cámara para controlar las preferencias de dirección. Inmediatamente después de la prueba, limpie la grasa del Aries.

Inserte un tapón nasal de polietileno en el Aries opuesto, siguiendo el mismo procedimiento de reclusión RY demostrado anteriormente, y permita que el animal descanse durante 10 minutos. Posteriormente, se realiza una prueba de preferencia de olor lateralizada en el cachorro. Otra vez. Cuando termine la prueba, retire el tapón y devuelva el cachorro a la presa.

La reclusión estrecha durante el entrenamiento de olores más caricias conduce a una memoria de olor lateralizada que se limita a los NRI ahorrados. Cuando se evalúa a los cachorros para determinar su preferencia de olor con el mismo aislamiento que durante el entrenamiento, muestran una preferencia por el olor condicionado. Esto no se observó cuando las pruebas se realizaron con el opuesto sin aislamiento.

Por el contrario, los grupos de control de solo olor no muestran preferencia por el olor, independientemente de la enfermedad que esté ocluida. Durante las pruebas, el entrenamiento de olores lateralizado da como resultado la activación lateralizada del sistema olfativo durante la exposición al olor, la inmunohistoquímica del bulbo olfatorio u OB y la corteza piriforme anterior o un PC mostraron significativamente menos Creb fosforilado en el hemisferio ocluido después de la exposición al olor en comparación con el hemisferio contralateral preservado. La tinción de Nissel muestra cuerpos celulares comparables en la capa de células mitrales del OB y en la capa de células piramidales del PC de ambos hemisferios.

24 horas después de la extracción del tapón nasal, la expresión del cangrejo guisante después de la exposición al olor en las células mitrales del OB y las células piramidales en el PC son comparables entre los hemisferios ocluidos y preservados. Esto indica que el efecto de una sola reclusión en un solo ensayo es transitorio y reversible y no da lugar a un daño neuronal visible a largo plazo que pueda afectar a la percepción de los olores y a la activación neuronal de los olores durante las pruebas. Una vez dominada, la oclusión de NA se puede realizar en menos de cinco minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante tener mucho cuidado al taponar la fosa nasal. Cualquier fuerza excesiva o técnica incorrecta puede causar sangrado y, por lo tanto, daño a la fosa nasal después de este procedimiento. Otros métodos, como la electrofisiología ex vivo y las técnicas moleculares, pueden utilizarse para responder a preguntas adicionales sobre la plasticidad sináptica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar oclusiones estrechas unilaterales temporales para lateralizar el aprendizaje del olor y diseccionar los circuitos neuronales que sustentan la formación de la memoria.