Name: Un Modelo de Aprendizaje lateralizado de Olor en ratas recién nacidas para disecar Formación Neural Circuito Recalces Memoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende un modelo de aprendizaje lateralizado de olor en ratas recién nacidas mediante oclusión nasal unilateral aguda. Este método permite examinar resultados conductuales y mecanismos biológicos en los mismos sujetos, reduciendo la variabilidad entre animales.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención operativa del CIHR (MOP-102624) a Q. Y. Agradecemos a la Dra. Carolyn Harley por las útiles discusiones a lo largo del estudio, al Dr. Qinlong Hou, Amin Shakhawat y Andrea Darby-King por su apoyo técnico.

Se utilizan ratas Sprague Dawley (Charles River) crías de ambos sexos. Las camadas son sacrificados a 12 en PD1 (siendo nacimiento PD0). Las presas se mantienen en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con acceso ad libitum a alimento y agua. Procedimientos experimentales han sido aprobados por el Comité de Cuidado de Animales Institucional de la Universidad Memorial. Plug 1. Nariz Construcción NOTA:. Este procedimiento fue adaptado y modificado a partir de Cummings et al (1997) 35. <ol><li> Aquire tubo de polietileno-20 y 3-0 hilo de sutura de seda. </li><li> Corte un pequeño trozo de polietileno de 20 tubos de aproximadamente 0,8 mm. </li><li> Hilo de sutura de seda a través del tubo dispuesto de tal manera que no hay hilo en cada lado de la sección de tubo. </li><li> En un extremo de la rosca exterior del tapón, un nudo en el hilo. </li><li> Tire de la sección del tubo por encima del nudo en el hilo. El nudo debe presentar dentro de la tubería.</li><li> Recorte ambos extremos de la rosca tal que ~ 2 mm de hilo sobresale de un extremo de la tubería (véase la Figura 1A). </li></ol> 2. Naris Oclusión antes de Capacitación <ol><li> Retire cachorro de presa y colocar en un plato seguro cubierto con ropa de cama regular. </li><li> Utilice una aplicación de punta de algodón para secarse un gel anestésico local 2% Xylocaine, en los INIA a ser ocluido. </li><li> Deje que el cachorro para descansar en el plato para ~ 3 min. </li><li> Mantenga el cachorro con suavidad pero firmemente en la mano no dominante. </li><li> Con la mano dominante, recoger una nariguera y aplique el mismo gel anestésico local alrededor de la punta de la que el hilo no sobresale. Esto actuar tanto como un anestésico para cualquier dolores menores asociados con la inserción del tapón y actuará como un lubricante dentro de la fosa nasal. NOTA: El efecto de xilocaína comienza en un par de minutos y dura 20-30 min. Los cachorros en general muestran buena tolerancia para la inserción del tapón después de la aplicación de la jalea xilocaína (mÍNIMOS luchando y vocalización). </li><li> Inserte con cuidado el tapón de la nariz manteniendo al cachorro firmemente y lentamente girar el enchufe con las pulsaciones muy suaves hasta que el enchufe esté bien conectado y sólo el hilo 2 mm sobresale de la fosa nasal (véase la Figura 1B). No debe haber sangrado de cualquiera de fosa nasal durante este proceso. Los cachorros con hemorragia durante la inserción del tapón nariz se excluyen y se devuelven a las represas </li><li> Permitir que el animal descanse en este plato durante 5 min con el fin de habituar al enchufe. </li><li> Retire el cachorro del plato habituación y comenzar el paradigma de condicionamiento 24. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51808/51808fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1. Construcción de un tapón de nariz. A) Esquema que muestra las etapas de hacer un tapón de nariz. Un hilo pasa a través de un tubo de polietileno; se hace un nudo y Pulconducido en el centro de la tubería para bloquearlo; dos extremos se cortan con un residuo de 2 mm en un extremo de la tubería. B) Vista frontal y lateral de una rata con un enchufe de la nariz en una fosa nasal. 3. perfumado Preparación de cama <ol><li> El uso de guantes nuevos y en una campana de extracción para evitar la contaminación de olores, coloque 500 ml de ropa de cama de viruta de madera en una bolsa de plástico. </li><li> Utilice una jeringa para extraer hasta 0,3 ml de extracto de menta, y rociar este sobre la ropa de cama en la bolsa de plástico. </li><li> Ate la bolsa para cerrarla, agitar la bolsa con fuerza, y deje que la ropa de cama para descansar en la bolsa durante 5 min. </li><li> Coloque la ropa de cama perfumada en una caja transparente, poco profunda, acrílico formación (20 x 20 x 5 cm 3, Figura 2A) descubierto en una campana de extracción durante 5 minutos antes de su uso. Una vez preparada la ropa de cama, deseche estos guantes, y no permita que estos guantes entren en contacto con los animales. </li><li> Coloque la ropa de cama sin perfume en una caja de plástico transparente idéntica, y enAsegúrese de que no entre en contacto con la ropa de cama perfumada o guantes utilizados. </li></ol> 4. Olor acondicionado Paradigm (ver foto en la Figura 2A) Los cachorros son sometidos ya sea una sola sesión de condicionamiento, el PD 6, o múltiples sesiones de prueba (una sesión por día, PD 3-6). <ol><li> Coloque el cachorro habituado en cama perfumada. Para el control de olores sólo (O / S -) crías, deje estos cachorros en la ropa durante 10 minutos, a continuación, vaya al paso 4.5. Para experimental golpe olor + (O / S +) cachorros, siguen los siguientes pasos de esta sección. </li><li> Carrera al cachorro durante 30 segundos utilizando un pincel pequeño. Use movimientos circulares rápidos principalmente en torno a la región posterior del cachorro. </li><li> Deje que el cachorro para descansar durante 30 segundos. </li><li> Repita los pasos 4.2 y 4.3 para un total de 10 minutos (es decir, 10 parejas de caricias + olor). </li><li> Retire las crías de la caja acondicionado, quitar el tapón de la nariz y devolver el cachorro a la presa. </li></ol> &lt;p class = "jove_title"&gt; 5. Lateralizado Olor Preferencia Testing (ver foto en la Figura 2B) Pruebas se produce en varios puntos de tiempo (por ejemplo, 24 o 48 h) después de la última sesión de entrenamiento. La prueba se llevó a cabo en una cámara de acero inoxidable de prueba (30 x 20 x 18 cm 3), que se coloca en la parte superior de dos cajas de formación (caja de formación se describe en 3.4), separadas por una zona neutral 2 cm. Una caja de capacitación contiene la ropa de cama con olor a menta, mientras que la otra caja contiene ropa de cama limpia, sin olor. El suelo de la cámara de pruebas es una rejilla de metal, que luego es cubierto por una hoja extraíble de malla de plástico (Figura 2B). <ol><li> Preparar una menta y una cama sin perfume según la Sección 3, y colocar cada caja en lados opuestos de la cámara de pruebas, 2 cm. Coloque la malla de plástico en el suelo metálico de la red de la cámara de prueba. </li><li> Retire el cachorro de la presa y colocar una gota firma de grasa de silicona inodora en los INIAque se ocluye durante el entrenamiento. Volver a aplicar la grasa durante todo el primer procedimiento de prueba según sea necesario. NOTA: oclusión INIA aleatoria durante el entrenamiento y las pruebas pueden ser consideradas para evitar sesgos. </li><li> Coloque las crías en la zona neutral de la cámara de prueba. </li><li> Deje que el cachorro para explorar la cámara durante 1 min, registrando el tiempo que el cachorro pasó más de los dos lados de la cámara (es decir, más de la hierbabuena o ropa de cama neutra perfumada). </li><li> Deje que el cachorro para descansar durante 1 min en una cámara de retención de plástico cubierto. </li><li> Repetir los pasos 5.2 y 5.3 para un total de 10 min (es decir, 5 ensayos de prueba separadas por 5 ensayos de descanso) de conmutación de la orientación inicial de la cría en la cámara con el fin de controlar para las preferencias de dirección. </li><li> Inmediatamente después de la prueba, limpie la grasa de la fosa nasal. </li><li> Inserte un noseplug polietileno en la fosa nasal opuesta según la sección 2 y que el animal pueda descansar durante 10 minutos. </li><li> Pruebe el cachorro una vez más como en 5.3 -5.6, quitar el tapón, y regresar al cachorro a la presa. Retire y limpie la malla de plástico de la cámara de pruebas con etanol al 95% y deje que el líquido se evapore. Coloque la malla de vuelta antes de probar la próxima cachorro. NOTA: La aplicación de grasa de silicona en la primera oclusión fosa nasal durante la prueba evita el riesgo de sangrado y el estrés asociado con la inserción del tapón nariz. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51808/51808fig2highres.jpg" width="500"> Figura formación preferencia 2. olor temprana y pruebas. A) la formación de olores Early preferencia usando olor + acariciando paradigma. B) Dos elección olor pruebas de preferencia con ropa de cama de menta en un lado, el control de las camas sin aroma en el lado opuesto. Una zona neutral 2 cm se coloca en el medio. 6. Prueba de la eficacia de los sistemas Naris Oclusión nt "&gt; Este experimento se realiza para determinar si sola oclusión INIA conduce a la activación lateralizado del sistema olfativo. <ol><li> Realizar oclusiones naris unilaterales en PD 6 o 7 cachorros como se describe en la sección 2. </li><li> Después de ~ 5 min habituación, coloque el cachorro en un recipiente de plástico cubierto y lo exponga a 30 l de aceite de menta puro empapadas en un pedazo de tejido durante 10 minutos. </li><li> Inmediatamente después de la exposición de menta olor, el cachorro inyectar por vía intraperitoneal (ip) con hidrato de cloral (400 mg / kg) como anestésico general, o pentobarbital, (150 mg / kg). </li><li> Una vez anestesiados completamente (que no muestran respuesta a la cola o pellizco pie), transcardially perfundir el cachorro con soluciones frías de solución salina (0,9%) para ~ 1 min, seguido de paraformaldehído (4%, disuelto en solución tampón 0,1 M de fosfato, PBS ). </li><li> Después de 10 minutos de perfusión de paraformaldehído, recoger el cerebro y lo coloca en paraformaldehído la noche a 4 ° C, y luego transfer el cerebro a una solución de sacarosa (20% en PBS) durante 24 h más. </li><li> Cortar rodajas de cerebro coronal a 30 micras de espesor con un criostato. Recoger OB y PC rodajas y montar en portaobjetos recubiertos de gelatina, seguido por tinción inmunohistoquímica para el anticuerpo estándar pCREB 21,25,30. </li></ol> 7. Prueba de la reversibilidad de Soltero Naris Oclusión Este experimento prueba si el efecto de bloqueo es reversible a las 24 h después de la extracción del tapón de la nariz. <ol><li> Realizar oclusiones naris unilaterales en PD 6 o 7 cachorros como se describe en la sección 2. </li><li> Después de 15 min (equivalente a la duración de la oclusión fosa nasal durante el entrenamiento - 5 habituación + 10 min de entrenamiento min), retire el tapón de la nariz, y devolver el cachorro a la presa. </li><li> 24 horas más tarde, exponer al cachorro al olor de menta en un recipiente de plástico cubierto durante 10 minutos como se describe en el apartado 6.2. </li><li> Siga mismos pasos en sectaiones 6.3 a 6.6. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de aprendizaje del olor y la memoria lateralizado en crías de rata dentro de una ventana de tiempo crítica fue establecida por primera vez por Hall y colegas. En una serie de estudios 33,34,36, demostraron que una memoria preferencia olor podría ser lateralizado por el olor de la leche + emparejamientos a una fosa nasal en PD 6 en crías de rata. Memoria Preferencia era robusta cuando la misma fosa nasal estaba abierto durante el entrenamiento y las pruebas, pero no se observa cuando la fosa nasal oc...

El olfato es la modalidad sensorial primaria en los roedores, sin la cual no sería capaz de navegar con éxito o sobrevivir en su medio ambiente. Es especialmente importante para los cachorros recién nacidos, los cuales no pueden ver, ni oír, durante la primera semana posterior al parto, para usar el olfato para localizar a su madre para alimentar a 1. Como resultado, las crías de ratas neonatales pueden estar condicionados a preferir los olores con manipulaciones experimentales sencillos. Una variedad de estímulos se han utilizado como estímulo incondicionado (UCS) para inducir respuestas condicionadas a nuevos olores (estímulo condicionado, CS) en los recién nacidos, incluyendo el medio ambiente de anidación 2,3, la succión de la leche 4-6, acariciando o estimulación táctil de 7 12, pellizcar la cola 13, saliva materna 13, pie de choque leve 14-18, y la estimulación cerebral intracraneal 19. El presente estudio emplea un paradigma de preferencia olor principios bien establecido en el que un olor, en este caso, menta, is combinado con estimulación táctil con el fin de producir una preferencia por de menta 24 horas más tarde 10,11,20. Estos recuerdos olores dependen de circuitos olfativa intacta, incluyendo principalmente los bulbos olfatorios (OB) 21-23 y la corteza piriforme anterior (APC) 24,25. Las investigaciones experimentales de principios del aprendizaje olor preferencia han profundizado y ampliado nuestra comprensión de las bases moleculares y fisiológicas de una memoria de los mamíferos. Este modelo de mamífero tiene varias ventajas en el estudio de los mecanismos de la memoria. En primer lugar, se han identificado las fuentes neuronales de la señal de UCS. Diversos estímulos como se mencionó anteriormente estimulan locus coeruleus la liberación de norepinefrina 26, que a su vez activa múltiples receptores adrenérgicos en el OB y apc, causando efectos celulares y fisiológicos que apoyan el aprendizaje 22,27,28. En segundo lugar, los mecanismos de memoria de apoyo tienen lugar en las estructuras neurales laminares bien definidos. Elsimplicidad del circuito olfatorio en ratas recién nacidas ofrece a los investigadores un marco ideal con el que descubrir los intrincados procesos relacionados con la plasticidad sináptica. Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) en el proyecto epitelio olfativo Onto mitrales / células pelo insertado en el OB y estas células mitrales / pelo insertado en el proyecto a su vez ipsilateralmente a corteza piriforme (PC) a través del tracto olfatorio lateral (LOT), entre otras estructuras 29. Tanto las sinapsis OSN en el OB 30,31 y el 24,25 LOT sinapsis en APC han sido identificados como lugares críticos para cambios sinápticos que apoyan el aprendizaje y la memoria. En tercer lugar, en una edad temprana en ratas, insumos olfativas pueden fácilmente ser lateralizado. Cada PCa tiene acceso a la información bilateral olor a través de la comisura anterior una vez que esta sustancia blanca está completamente formado en postnatal día 12 (PD12) 32. Antes de la EP 12, entrada de olor puede ser aislado a ipisilateral OB y APC a través de un solo orificio nasal oclusión 24,25,31,33,34 &lt;/ Sup&gt;. Soltero INIA oclusión permite la formación de la memoria el olor de la fosa nasal abierta, y evita que el mismo recuerdo de los INIA ocluidos antes de PD 12 33. Memoria Olor está aislado en el hemisferio ipsilateral incluyendo tanto OB y APC. Por lo tanto, cada una cría de rata puede ser su propio control para el aprendizaje y que sustenta la fisiología. En el presente estudio, se introduce el protocolo de aprendizaje preferencia olor temprana lateralizado. Este método sirve como una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos neuronales que sustentan el aprendizaje de olores, proporcionando un control intra-animales 24,25,31, lo que reduce tanto el número de animales necesarios y la variación general. Naris oclusión es reversible en que el tapón de grasa o la nariz puede ser aplicado y retirado con un mínimo de estrés o daño al animal. Aquí, en primer lugar, se describen los procedimientos detallados de formación preferencia olor temprana y pruebas, con un enfoque en el protocolo lateralizado usando solo oclusión fosa nasal con un nne enchufe. Entonces resultados se presentan para demostrar la eficacia de la oclusión sola fosa nasal en el aislamiento de entrada de olor y producir olor lateralizado memoria. Por último, se analizan los potenciales de la utilización de este modelo de aprendizaje lateralizado para estudiar los cambios fisiológicos en el sistema olfativo que ambos generan el aprendizaje y la memoria soporte para expresiones.

<table><tbody><tr><td>Tubo de polietileno 20</td><td>Intramedic</td><td>427406</td><td>No radiopaco, No tóxico</td></tr><tr><td>3-0 Hilo de sutura de seda</td><td>Syneture</td><td>Sofsilk</td><td>No absorbente</td></tr><tr><td>Grasa de silicona</td><td>Warner Instrument</td><td>64-0378</td><td>Gel de</td></tr><tr><td>xilocaína al 2%</td> inodoro <td>AstraZeneca</td><td>Prod. No 061</td><td>Gelatina de clorhidrato de lidocaína, comprada en una farmacia local</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Dynasty</td><td>206R</td><td>Tamaño similar/otras marcas también funcionan</td></tr><tr><td>Extracto de menta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W284807</td><td>Otras marcas también deberían estar bien</td></tr><tr><td>Caja de entrenamiento Caja</td> de acrílico <td>N/A</td><td>hecha a medida</td> (<td>20 x 20 x 5 cm3), ver Figura 2A. Los parámetros y el material de la caja no son críticos y se pueden modificar. El material utilizado debe ser inodoro y no absorber olores</td></tr><tr><td>Cámara de pruebas</td><td>Hecho a medida</td><td>N/A</td><td>Acero inoxidable (30 x 20 x 18 cm3), ver Figura 2B. Los parámetros y el material de la cámara no son críticos y se pueden modificar. Por ejemplo, se puede utilizar una cámara acrílica en lugar de una de acero inoxidable</td></tr><tr><td>anticuerpo pCREB</td><td>Señalización celular</td><td>9198</td><td>Ser 133 (87G3) mAb</td></tr><tr><td>de conejo Hidrato de cloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8383</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Paraformaldehype</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

un modelo de aprendizaje lateralizado de olor en ratas recién nacidas para disecar formación neural circuito recalces memoria

A Lateralized Odor Learning Model in Neonatal Rats for Dissecting Neural Circuitry Underpinning Memory Formation

Las crías de rata durante un período postnatal crítico (≤ 10 días) forman fácilmente una preferencia por un olor que se asocia con estímulos que imitan el cuidado materno. Esta memoria de preferencias puede durar desde horas hasta días, incluso toda la vida, dependiendo de los parámetros de entrenamiento. El aprendizaje temprano de la preferencia por el olor nos proporciona un modelo en el que los cambios críticos para una forma natural de aprendizaje ocurren en los circuitos olfativos. Una característica adicional que lo convierte en una herramienta poderosa para el análisis de los procesos de memoria es que el aprendizaje temprano de la preferencia por el olor se puede lateralizar a través de la oclusión de una sola nariz dentro del período crítico. Esto se debe a la falta de conexiones comisurales anteriores maduras de los hemisferios olfativos a esta temprana edad. Este trabajo describe los protocolos de comportamiento para el aprendizaje lateralizado del olor utilizando tapones nasales. La oclusión aguda y reversible de la narina minimiza los daños tisulares y neuronales asociados con la oclusión a largo plazo y métodos más agresivos como la cauterización. El modelo de aprendizaje de olores lateralizado permite la comparación dentro de los animales, lo que reduce en gran medida la varianza en comparación con los diseños entre animales. Este método se ha utilizado con éxito para sondear los cambios de circuito en el sistema olfativo producidos por el entrenamiento. Las direcciones futuras incluyen la exploración de los fundamentos moleculares de la memoria de olores utilizando este modelo de aprendizaje lateralizado; y correlacionar el cambio fisiológico con la fuerza y la duración de la memoria.

En este artículo revisamos algunos de los resultados previamente establecidos 24 para demostrar la eficacia de la oclusión INIA en el aislamiento de la entrada de olores y aprender a un hemisferio, y la reversibilidad de este método. Soltero oclusión fosa nasal durante el entrenamiento olor preferencia temprana conduce a una memoria olfativa lateralizado 24. La memoria se limita a la fosa nasal para sustitución (Figura 3). Cuando los cachorros son la pr...

Este protocolo introduce el aprendizaje temprano lateralizado de la preferencia por el olor en ratas utilizando la oclusión aguda de naris única. El aprendizaje lateralizado permite examinar los resultados conductuales y los mecanismos biológicos subyacentes dentro de los mismos animales, reduciendo la varianza inducida por los diseños entre animales. Este protocolo se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares que sustentan el aprendizaje temprano de los olores.

Un Modelo de Aprendizaje lateralizado de Olor en ratas recién nacidas para disecar Formación Neural Circuito Recalces Memoria

Rat pups during a critical postnatal period (&#8804; 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal ...

Este protocolo introduce el aprendizaje lateral temprano de la preferencia por el olor en ratas utilizando oclusiones agudas de una sola nariz. Esto se logra construyendo primero tapones nasales de polietileno extraíbles. El segundo paso es ocluir el Aries deseado antes del entrenamiento conductual.A continuación, prepare la ropa de cama perfumada y luego entrene al animal en la ropa de cama perfumada mientras lo acaricia con un pincel. El paso final es probar la preferencia de olor lateralizada utilizando un aparato de prueba de dos opciones. En última instancia, la inmunohistoquímica de la proteína de unión al elemento de respuesta al amplificador C fosforilada o P crib se utiliza para demostrar el silenciamiento unilateral de la actividad neuronal debido a la reclusión única y la reversibilidad del método.La principal ventaja de esta técnica que existe entre los métodos de control animal es que somos capaces de reducir la variabilidad y el número de animales a través de la naturaleza de nuestro diseño experimental de control intraanimal antes de la capa postnatal 11, debido a la falta de proyecciones de composiciones anteriores maduras de MA, que dos hemisferios olfativos no están conectados. Esto nos permite manipular un hemisferio independientemente del otro a través de la oclusión de nutrición única. Los hemisferios ocluidos sirven como control intraanimal.Aunque esta técnica se centra en el aprendizaje olfativo en ratas neonatas, las implicaciones nos permitirán responder a preguntas fundamentales sobre los procesos neuronales durante el aprendizaje y la memoria, como la plasticidad sináptica, la metaplásica y sus mecanismos moleculares subyacentes. Las conclusiones extraídas de los estudios que utilizan este método pueden generalizarse a los principios básicos del aprendizaje y la memoria y a los mamíferos, especialmente durante los períodos críticos postnatales. Esto nos ayudará a construir un fondo prometedor para posibles terapias para la pérdida de memoria asociada con condiciones fisiopatológicas.Este método también es muy adecuado para otros procesos relacionados con el olfato, como la percepción de olores y el recubrimiento de olores. El tapón nasal está construido con tubos de polietileno 20 y tres hilos de sutura de seda cero. Primero, corte un pequeño trozo de polietileno 22 a aproximadamente 0,8 centímetros.A continuación, pase la sutura de seda a través del tubo preparado de modo que quede hilo a ambos lados de la sección del tubo. En un extremo de la rosca fuera del tapón, haz un nudo. Tira de la sección del tubo hacia abajo sobre el nudo de la rosca.El nudo debe alojarse dentro del tubo. Recorta ambos extremos de la rosca, de modo que sobresalgan unos dos milímetros de rosca de un extremo del tubo. Para comenzar este procedimiento, retire al cachorro de la madre y colóquelo en un plato seguro cubierto con ropa de cama regular.Con un aplicador de punta de algodón, frote una gelatina anestésica local, 2% de xilocaína en el Aries que se va a ocluir. Deje que el cachorro descanse en el plato durante unos tres minutos. Lucin en el cachorro es el paso más crítico en este procedimiento.La cura debe tomarse durante la inserción del tapón nasal para prevenir el sangrado y el daño tisular. A continuación, levante al cachorro y sujételo suave pero firmemente en la mano no dominante con la mano dominante, levante una nariz, tape y frote la misma gelatina anestésica local alrededor de la punta de la que no sobresale el hilo. Esto actuará como un anestésico para cualquier dolor menor asociado con la inserción del tapón y un lubricante dentro del nes.Inserte suavemente el tapón nasal sujetando firmemente el cachorro y girando lentamente el tapón con empujones muy suaves hasta que el tapón esté completamente insertado y solo sobresalga la rosca de dos milímetros del Aries. No debe haber sangrado de ninguno de los dos Aries durante este proceso. Las crías con sangrado durante la inserción del tapón nasal no se pueden usar para el experimento.Deje que el animal descanse en el plato durante cinco minutos para que se habitúe al tapón Antes de comenzar el entrenamiento para evitar la contaminación por olores, prepare la ropa de cama perfumada en una campana extractora y, mientras usa guantes nuevos, coloque 500 mililitros de ropa de cama de astillas de madera en una bolsa de plástico. Use una jeringa para extraer 0,3 mililitros de extracto de menta y rocíelo sobre la ropa de cama en la bolsa de plástico. Ate la bolsa para cerrarla, agite la bolsa vigorosamente y deje que la ropa de cama descanse en la bolsa durante cinco minutos, coloque la ropa de cama perfumada en una caja de entrenamiento acrílica transparente y poco profunda de 20 por 20 por cinco centímetros descubierta en la campana extractora durante cinco minutos antes de usarla.Una vez que la ropa de cama esté preparada, deseche los guantes usados. No permita que los guantes entren en contacto con los animales. Coloque 500 mililitros de ropa de cama sin perfume en otra caja de entrenamiento acrílica limpia y asegúrese de que no entre en contacto con ropa de cama perfumada o guantes usados.Comience el paradigma de condicionamiento del olor colocando al cachorro habituado en la ropa de cama perfumada para obtener un olor experimental. Además de cachorros positivos para OS en el accidente cerebrovascular. Acaricia al cachorro durante 30 segundos.Con un pincel pequeño, use movimientos circulares rápidos principalmente alrededor de la región trasera del cachorro. Las caricias inducen la liberación de norepinefrina al bulbo olfatorio y a la corteza olfativa. Esto sirve como un estímulo incondicional.Deje que el cachorro descanse durante 30 segundos. Repite los 30 segundos de caricias, seguidos de 30 segundos de descanso para un total de 10 minutos. Cuando se completen los 10 emparejamientos de caricias más olor, retire al cachorro de la caja de acondicionamiento.Retire el tapón nasal y devuelva el cachorro a la madre para su control. Cachorros negativos para el sistema operativo solo con olor. Coloque al cachorro habituado en la ropa de cama perfumada durante 10 minutos sin acariciarlo.Después de 10 minutos, retire al cachorro de la caja de acondicionamiento. Retire el tapón nasal y devuelva al cachorro a la madre. La prueba de preferencia de olor lateralizada se realiza en varios puntos de tiempo después de la sesión de entrenamiento final.Las pruebas se llevan a cabo en una cámara de pruebas de acero inoxidable de 30 por 20 por 18 centímetros que se coloca encima de dos cajas de entrenamiento acrílicas separadas por una zona neutral de dos centímetros. Una caja de entrenamiento contiene ropa de cama perfumada, mientras que la otra caja contiene ropa de cama limpia y sin perfume. Prepare una ropa de cama con aroma a menta y una ropa de cama sin perfume como se muestra anteriormente, y coloque cada caja debajo de los lados opuestos de la cámara de prueba.A dos centímetros de distancia. Coloque la malla de plástico en el piso de rejilla metálica de la cámara de prueba. Retire la P de la presa y coloque un poco de grasa de silicona inodora en el Aries que está ocluido.Durante el entrenamiento, la grasa se puede volver a aplicar durante el primer procedimiento de prueba según sea necesario. Coloque al cachorro en la zona neutral de la cámara de prueba. Permita que el cachorro explore la cámara durante un minuto registrando cuánto tiempo pasó el cachorro en los dos lados de la cámara, es decir, sobre menta o ropa de cama con aroma neutro.Transfiera al cachorro a una cámara de retención de plástico cubierta y déjelo reposar durante un minuto. Repita las pruebas de prueba durante un total de 10 minutos, cambiando la orientación inicial del cachorro en la cámara para controlar las preferencias de dirección. Inmediatamente después de la prueba, limpie la grasa del Aries.Inserte un tapón nasal de polietileno en el Aries opuesto, siguiendo el mismo procedimiento de reclusión RY demostrado anteriormente, y permita que el animal descanse durante 10 minutos. Posteriormente, se realiza una prueba de preferencia de olor lateralizada en el cachorro. Otra vez. Cuando termine la prueba, retire el tapón y devuelva el cachorro a la presa.La reclusión estrecha durante el entrenamiento de olores más caricias conduce a una memoria de olor lateralizada que se limita a los NRI ahorrados. Cuando se evalúa a los cachorros para determinar su preferencia de olor con el mismo aislamiento que durante el entrenamiento, muestran una preferencia por el olor condicionado. Esto no se observó cuando las pruebas se realizaron con el opuesto sin aislamiento.Por el contrario, los grupos de control de solo olor no muestran preferencia por el olor, independientemente de la enfermedad que esté ocluida. Durante las pruebas, el entrenamiento de olores lateralizado da como resultado la activación lateralizada del sistema olfativo durante la exposición al olor, la inmunohistoquímica del bulbo olfatorio u OB y la corteza piriforme anterior o un PC mostraron significativamente menos Creb fosforilado en el hemisferio ocluido después de la exposición al olor en comparación con el hemisferio contralateral preservado. La tinción de Nissel muestra cuerpos celulares comparables en la capa de células mitrales del OB y en la capa de células piramidales del PC de ambos hemisferios.24 horas después de la extracción del tapón nasal, la expresión del cangrejo guisante después de la exposición al olor en las células mitrales del OB y las células piramidales en el PC son comparables entre los hemisferios ocluidos y preservados. Esto indica que el efecto de una sola reclusión en un solo ensayo es transitorio y reversible y no da lugar a un daño neuronal visible a largo plazo que pueda afectar a la percepción de los olores y a la activación neuronal de los olores durante las pruebas. Una vez dominada, la oclusión de NA se puede realizar en menos de cinco minutos si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante tener mucho cuidado al taponar la fosa nasal. Cualquier fuerza excesiva o técnica incorrecta puede causar sangrado y, por lo tanto, daño a la fosa nasal después de este procedimiento. Otros métodos, como la electrofisiología ex vivo y las técnicas moleculares, pueden utilizarse para responder a preguntas adicionales sobre la plasticidad sináptica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar oclusiones estrechas unilaterales temporales para lateralizar el aprendizaje del olor y diseccionar los circuitos neuronales que sustentan la formación de la memoria.

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Investigación

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Neurociencia

Larvas de Drosophila son capaces de asociarse con estímulos de olor recompensa gustativa. Aquí se describe un sencillo paradigma de comportamiento que permite el análisis de apetito aprendizaje olfativo asociativo.

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

El objetivo de este protocolo es investigar la cognición espacial en roedores. El laberinto acuático de doble H es una prueba novedosa, que es particularmente útil para dilucidar los diferentes componentes del aprendizaje, la consolidación y la memoria, así como la interacción de los sistemas de memoria.

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Aquí capacitamos a ratones en una tarea de aprendizaje asociativo para probar la discriminación de olor. Este protocolo permite también estudios sobre cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro.

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Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Hemos desarrollado previamente protocolos para Caenorhabditis elegans para formar memorias asociativas a corto y largo plazo mediante entrenamiento masivo y espaciado, respectivamente. Aquí, se describen protocolos detallados para el acondicionamiento de C. elegans emparejando 1-propanol y ácido clorhídrico como estímulos condicionados y no condicionados, respectivamente, para formar memoria asociativa aversiva.

Aprendizaje asociativo aversivo y formación de la memoria mediante el emparejamiento de dos sustancias químicas en Caenorhabditis elegans

Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Este protocolo describe la construcción de un olfatómetro para experimentos de comportamiento olfativo de pasa/no pasa. Se proporcionan instrucciones paso a paso, junto con imágenes, para garantizar la construcción exitosa del olfatómetro. También se incluye información para solucionar los problemas encontrados durante el proceso.

Construcción de un olfatómetro para estudios de comportamiento olfativo de roedores

Un obstáculo importante para el estudio de la actividad celular durante los procesos cognitivos, como el aprendizaje y la memoria, es el uso de anestésicos para la preparación de imágenes in vivo . La anestesia afecta la memoria a corto plazo y la cognición en múltiples modelos, incluida Drosophila. Este estudio presenta un método único para preparar Drosophila adulta para imágenes in vivo sin anestesia.

In vivo Imágenes de la actividad neuronal en moscas adultas de Drosophila no anestesiadas

A continuación se describen los métodos de ensayo C. elegans aprendizaje asociativo y la memoria a corto y largo plazo asociativo. Estos ensayos se emplean las habilidades de la población de gusanos chemotax hacia olores volátiles, y la forma de asociaciones positivas en maridaje con el butanona chemoattractant. Aumentar el número de períodos acondicionado induce memoria a largo plazo.

C. elegans de aprendizaje positivo butanona, a corto plazo y largo plazo Ensayos de la memoria asociativa

Aprende un modelo de aprendizaje lateralizado de olor en ratas recién nacidas mediante oclusión nasal unilateral aguda. Este método permite examinar resultados conductuales y mecanismos biológicos en los mismos sujetos, reduciendo la variabilidad entre animales.

Un Modelo de Aprendizaje lateralizado de Olor en ratas recién nacidas para disecar Formación Neural Circuito Recalces Memoria

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