Name: Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprende a cultivar intestinos fetales de ratón ex vivo para estudiar el desarrollo de vellosidades mediante imágenes tridimensionales en tiempo real. Este método permite modular vías de señalización celular.

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Reconocemos con gratitud a la Dra. Deborah L. Gumucio como nuestra asesora y por su inestimable apoyo en la definición de los métodos de cultivo e imagen. También agradecemos al Dr. Jim Brodie, al Dr. Hong-Xiang Lu, a la Dra. Charlotte Mistretta y a la Dra. Ann Grosse por sus contribuciones al desarrollo de todo el sistema de cultivo de órganos intestinales. Las útiles discusiones sobre imágenes proporcionaron excelentes consejos del Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski y Sasha Meshinchi. Todas las imágenes se realizaron en el Laboratorio de Microscopía y Análisis de Imágenes de la Universidad de Michigan. El apoyo financiero fue proporcionado por NIH R01 DK065850.

NOTA: Todos los ratones fueron manejados con humanidad utilizando los protocolos aprobados por la Universidad de Michigan Medical School Unidad de Laboratorio de Medicina Animal y de acuerdo con las directrices del Comité de la Universidad sobre el uso y cuidado de los animales. 1. System Organ Culture Whole <ol><li> Preparación de medios de comunicación y placas de cultivo <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, eliminar 5 ml de medio BGJb de la botella stock y añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina. Prepare una solución de trabajo de los medios de comunicación en un tubo cónico de 50 ml, mediante la adición de 1 ml de 5 mg / ml de ácido ascórbico a 49 ml de medio BGJb (con Pen / Strep). </li><li> Preparar una placa de cultivo de 6 pocillos mediante la adición de 1 ml por debajo de cada uno de los cultivos polarizados. NOTA: Si no se utilizan los 6 transwells, mover transwells adicionales en una placa de 6 pocillos estéril fresco para su uso posterior. Añadir 3 ml de los medios de trabajo BGJb a cada una de tres placas de Petri de 10 cm estériles. </li></ol></li><li> Preparación para la disección <ol><li> Remoje las herramientas de disección en el 70% ethanol y asegúrese de mantener las herramientas limpias durante el trabajo. </li><li> Configurar la zona de disección con un gran cubo de hielo y colocar la placa de cultivo de 6 pocillos y 10 cm placas de Petri con medios BGJb sobre hielo. Trabajar en el hielo tanto como sea posible mientras que la disección y preparación de los intestinos para la cultura. </li><li> Anestesiar a los ratones hembra adulta en una cámara con isofluorano (100 l) antes de la eutanasia por dislocación cervical para la recolección de los intestinos fetales. </li><li> Después de cosechar los fetos de su madre, etapa cada feto cuidadosamente según la Theiler puesta en escena gráfica 13. No confíe en los días post-coito para determinar la edad de cada feto como variaciones de hasta 24 horas en la etapa de desarrollo se observan habitualmente en una sola camada. </li></ol></li><li> La disección de los intestinos fetales <ol><li> La eutanasia a los fetos por decapitación antes de la extracción de los intestinos. </li><li> Diseccionar cada intestino en 1x de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) y luego place en una placa de Petri de 10 cm con el trabajo de medios BGJb. </li><li> Retire cuidadosamente el bazo desde el estómago y el páncreas desde el estómago y el duodeno superior. </li><li> Separar suavemente el epiplón teniendo cuidado de dejar el epiplón adjunta tanto como sea posible y la separación de las conexiones sólo lo suficiente para permitir que el intestino para ser enderezada. NOTA: Para intestinos mayores de E14.5 o los que están siendo cultivados más de 24 horas, separar suavemente el intestino en 3 segmentos iguales para permitir el contenido luminal fluyan a través del intestino y ser expulsados ​​de los extremos cortados. Sin embargo, para que las culturas se inició antes de E13.5, espere hasta después de 24 horas de cultivo antes de la separación de los 3 segmentos del intestino para permitir la serosa crezca adecuadamente en toda la longitud del intestino. </li><li> Usar una pipeta de boca para transferir las piezas intestinales en los cultivos polarizados de la placa de cultivo (1.1.2). </li><li> Reposicionar suavemente los intestinos a medida que sea necesario para que estén en línea recta la Transwell. NOTA: Una vez que los intestinos comienzan a moverse contenido luminal a través del tubo, cualquier torcedura en el intestino provocarán una copia de seguridad y daños en el intestino. </li></ol></li><li> Cultura y tratamiento <ol><li> Retire el papel de debajo de la transwell, añadir 700 l de medio de tratamiento (los medios de comunicación que trabajan con proteínas recombinantes añadidos o inhibidores farmacológicos) bajo la transwell. </li><li> Añadir 300 l de medio de tratamiento gota a gota en la parte superior de los intestinos y deje que penetre a través de la transwell. Vuelva a colocar el intestino en caso necesario. </li><li> Cambie medio de tratamiento por lo menos una vez al día o más a menudo, dependiendo de la vida media del reactivo de tratamiento. </li></ol></li><li> Preparación de proteínas empapado perlas de agarosa para una fuente localizada de reactivo de tratamiento <ol><li> Resuspender las perlas de agarosa en su recipiente de almacenamiento y la transferencia de 100 l de perlas de agarosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Llenar el volumen restante del tubo con 1x estéril Phosphate-Buffered Saline (PBS) y mezclar las perlas para lavarlos. Colocar el tubo de microcentrífuga en un bastidor por unos pocos minutos para permitir que las perlas se depositan en el fondo y luego pipetee de la PBS en la parte superior de la de las perlas. Vuelva a llenar el tubo de microcentrífuga con 1x PBS estéril y repetir el proceso de lavado dos veces más. </li><li> Preparar la proteína de interés a dos veces la concentración deseada para el tratamiento. </li><li> Mezclar 5 l de perlas de agarosa lavadas con 5 l de la proteína de stock 2x y agite suavemente las perlas en la proteína. Se coloca el tubo en hielo durante 1 hora, mezclando suavemente cada 10-15 min. </li><li> Enjuague las perlas brevemente en PBS 1x estéril antes de colocar las perlas en los intestinos. </li></ol></li><li> La colocación de perlas de agarosa <ol><li> Con suavidad, coloque las bolas de agarosa en la parte superior de los intestinos usando una pipeta de boca con agujas capilares tirados. Coloca las bolitas con extremo cuidado ya que el manejo brusco puede dañar el intestino y prevenir el desarrollo de vellosidades en el área lesionada. </li><li> Coloque el doble de cuentas que sean necesarios para el análisis, ya que los intestinos se someterán a los movimientos peristálticos y aproximadamente la mitad de los granos colocados rodará fuera de los intestinos durante el tiempo de cultivo. </li></ol></li><li> La fijación de los intestinos cultivadas <ol><li> Retire con cuidado los medios de tratamiento de debajo de la transwell y permitir que los intestinos se sequen al aire durante 3 min. </li><li> Añadir 1 ml de fijador bajo el transwell durante 2 min, luego cubrir la parte superior del intestino con 2 ml de fijador para el resto del tiempo de fijación. Fijar con paraformaldehído al 4% O / N a 4 ° C o durante 2 horas a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 2. Imaging de intestinos fijos <ol><li> Imágenes Wholemount <ol><li> Coloque el conjunto de los intestinos (con fluorescencia endógena) en un portaobjetos con 100 l de 1x DPBS. El uso de fórceps para arreglar suavemente los intestinos. </li><li> Utilice un pañuelo de papel de laboratorio para retirar cuidadosamente los DPBS y añadir inmediatamente 100 l de 70% de glicerol para hacer el mo tejidovolver transparente y aumentar la posible profundidad de formación de imágenes. NOTA: Si se desea una mayor penetración del intestino, en lugar de montar el intestino en un 70% de glicerol, empape el intestino en unas gotas de Focus Claro solución para 10-30 min. Pipeta de fuera de la solución de enfoque claro y montar el intestino con el Monte Claro. </li><li> Sumerja cada una de las cuatro esquinas de un cubreobjetos en plastilina y recoger una pequeña cantidad de arcilla para usar como separadores entre el portaobjetos y cubreobjetos para mantener el cubreobjetos de aplanamiento del intestino. </li><li> Sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con valap derretida aplicada con un bastoncillo de algodón. </li><li> Imagen de los intestinos a ambos un microscopio confocal en posición vertical o invertida. Por favor refiérase a la discusión para más detalles. </li></ol></li><li> Seccionamiento Vibratome de intestinos fijos (para vista en sección transversal de las estructuras intestinales) <ol><li> Intestinos Insertar en el 7% de agarosa en pequeños moldes de plástico (10 x 10 x 15 mm) y permitir que los bloques de agarosa aenfriar y solidificar. </li><li> Retire los bloques de agarosa de los moldes de plástico y pegamento bloques de agarosa a la etapa de recolección vibratome con pegamento instantáneo. </li><li> Llenar la etapa de recolección de frío hielo 1x DPBS. </li><li> Cortar secciones con un espesor de entre 100-150 micras. Por secciones más gruesas utilizan las soluciones de compensación (que se describen en la sección 2.1.2) para visualizar más en la sección transversal. </li><li> Vierta vibratome secciones de la etapa de recolección en un pocillo de una placa de 6 pocillos para el almacenamiento a 4 ° C. </li></ol></li><li> La tinción de inmunofluorescencia de tejidos, vibratome seccionadas fijos <ol><li> Coloque 5-12 secciones vibratome por pocillo en una placa de 24 pocillos con 1x DPBS. </li><li> Retire 1x DPBS y añadir 500 l de solución de permeabilización por pocillo. Agite suavemente las muestras durante 25 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de permeabilización, lavar las muestras 3 veces con 1 × PBS. </li><li> Bloquee las muestras durante al menos 30 min en 500 l de disolución de bloqueo. </li><li> Después del bloqueo, eXchange la solución de bloqueo con 500 l de anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo y mantener las muestras a 4 ° CO / N. NOTA: Las diluciones de anticuerpos primarios que funcionan bien en las secciones congeladas y parafina generalmente funcionan bien en vibratome secciones también, sin embargo, los anticuerpos que requiere la recuperación de antígeno nuclear generalmente no funcionan bien con este protocolo (por ejemplo, BrdU). </li><li> El día siguiente, se lavan las muestras 3 veces durante 15 min cada vez con solución de bloqueo. </li><li> Después del lavado, se aplican 500 l del anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo. Envolver la placa de 24 pocillos en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz y el rock las muestras durante 45 min a 2 horas a RT. </li><li> Lávese las muestras 3 veces con 1 × PBS durante 15 minutos cada uno y montar las secciones vibratome en las diapositivas como se describe en la Sección 2.4. </li></ol></li><li> Montaje vibratome secciones <ol><li> Preparar en otro portaobjetos para vibratome montaje cortando lonchas finas de doble stick y la colocación de la cinta a lo largo de los lados largos de las diapositivas. </li><li> Coloque cuidadosamente 5-10 secciones vibratome entre la cinta de doble cara en las diapositivas en una gota de 100 l de PBS 1x. </li><li> Desplegar todas las secciones y se extendió a cabo en una sola capa en toda la diapositiva. </li><li> Elimine cualquier exceso de agarosa o trozos irregulares que impida un cubreobjetos de sentarse plana. </li><li> Con cuidado, usar un pañuelo desechable de laboratorio para absorber el exceso de 1x PBS desde alrededor de las secciones vibratome. </li><li> Añadir una gota de medio de montaje acuoso en la parte superior de las secciones de vibratome y luego cubreobjetos. </li><li> Sellar el cubreobjetos sobre los portaobjetos con derretida valap aplica con un algodón. </li><li> Imagen secciones vibratome a ambos un microscopio confocal vertical o invertida. Por favor refiérase a la discusión para más detalles sobre la selección de un sistema de imágenes. </li></ol></li></ol> 3. imágenes en vivo de los intestinos enteros Intestinos cosechado de fetuses después de E12.5, con el epiplón conectado deja intacto, desarrollar con éxito las vellosidades en la cultura con el sistema anterior. Por lo tanto, este sistema ex vivo permite la captura de imágenes de sección z vivo de los intestinos en desarrollo que pueden ser reconstruidas para una vista tridimensional de la morfogénesis en el tiempo. <ol><li> La creación de imágenes en directo <ol><li> Utilice pegamento instantáneo para adherir una membrana de policarbonato individuo a una pantalla de malla fina. Esto proporciona un andamio de apoyo para mantener el intestino en su lugar debajo de la lente de inmersión de microscopio confocal vertical. Por favor refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la selección de los microscopios de imágenes en directo. </li><li> Coloque la pantalla de malla en el centro de los pocillos de una placa de cultivo. </li><li> Coloque el intestino diseccionado sobre la membrana de policarbonato y añadir una gota de pegamento instantáneo en cada extremo. Utilice sólo el pegamento suficiente para colocar el intestino, pero no abrigo! </li><li> Añadir cultura libre medios de rojo fenol por debajo del policarbonatomembrana en el centro pocillo de la placa de cultivo. </li><li> Añadir agua hasta el borde exterior de la placa de cultivo para proporcionar humedad. </li><li> Desde el intestino fetal se somete a ondas peristálticas-como de contracción en cultivo, añadir 100 ml de una solución 1: 5 de xilazina en 1x PBS a 3 ml de medio para controlar el movimiento del intestino mientras que las imágenes. Esta dosis será controlar los movimientos intestinales por alrededor de 8-10 horas sin comprometer el desarrollo de las vellosidades. </li><li> Para una vista transversal del intestino, incrustar los intestinos vivos en una solución de agarosa al 3-4% y cortar secciones gruesas (150-500 M) en un vibratome. Coincidir con la rigidez de la agarosa con la rigidez del intestino de ser cortado y determinado empíricamente la etapa de desarrollo. Por lo general, una solución de agarosa al 3% funciona bien para los intestinos menores de E14.5 y una solución al 4% funciona bien para los intestinos E15-E16. </li><li> Pega las secciones vibratome a una membrana de policarbonato colocada en un tamiz de malla (como en la Sección 3.1.1) yla cultura como se describe en la Sección 3.1.2-3.1.6. </li><li> Llevar a cabo la formación de imágenes en vivo usando un microscopio confocal de fluorescencia de dos fotones (láser de excitación entre 690-1,040 nm) en un soporte vertical con una tabla ajustable. </li><li> Láser de dos fotones sintonizado a 900 nm proporciona una penetración profunda con la mejor resolución para las señales de las buenas prácticas agrarias. Reduce el daño a los tejidos, mientras que la formación de imágenes. Además, el establecimiento de la potencia del láser para la emisión más bajo posible reduce el daño del tejido. Típicamente para obtener una buena excitación de GFP, utilizar la energía 12% en el láser de dos fotones. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos financieros que revelar.

La naturaleza dinámica e interacciones de tejidos complejos del intestino en desarrollo requiere la visualización en 3D para tener una apreciación más completa de estos eventos morfogenéticos. Con la evolución de la tecnología de imagen, la capacidad de examinar las vellosidades morfogénesis en detalle está desarrollando / mejora y con ello, la comprensión de la comunicación espacial y la interacción durante la organogénesis es mucho mayor. Los métodos alternativos para el cultivo de los int...

Cada vellosidad intestinal está compuesta por dos compartimentos principales de tejido: una capa superficial epitelial y un núcleo mesenquimatoso. El intestino delgado del ratón se forma en el día embrionario 10 cuando una lámina de endodermo se cierra y se sella para formar un tubo de epitelio rodeado de células mesenquimales3. Este tubo plano de epitelio experimenta una rápida proliferación, creciendo tanto en longitud como en circunferencia, y sufre reordenamientos dramáticos queinvolucran cambios dinámicos en la forma de las células. Al mismo tiempo, el mesénquima circundante también experimenta muchos procesos de desarrollo, incluida la formación del plexo vascular, la diferenciación del músculo liso y el reclutamiento de neuronas entéricas4. En el intestino delgado proximal, en el día embrionario 14,5, comienzan a formarse condensaciones (grupos) de células que responden a Hedgehog y PDGF adyacentes al epitelio2,5. La formación de grupos mesenquimales continúa extendiéndose a lo largo del intestino, de modo que cubren la totalidad del intestino delgado en el día embrionario 16,52. A medida que se forman grupos mesenquimales, las células epiteliales más cercanas a los grupos comienzan a retirarse del ciclo celular, mientras que las otras células epiteliales continúan proliferando. Las células directamente sobre el grupo mesenquimal que se han retirado del ciclo celular comienzan a cambiar de forma a medida que las vellosidades emergentes se unen en el lumen. El crecimiento posterior de las vellosidades es impulsado en parte por la continua proliferación del epitelio entre las vellosidades emergentes. Los grupos mesenquimales permanecen firmemente adheridos al epitelio de las vellosidades en crecimiento y continúan expresando una variedad de moléculas de señalización. La ola de aparición de vellosidades se propaga a lo largo del intestino delgado siguiendo la formación de grupos mesenquimales. A medida que el intestino continúa creciendo y la región de las vellosidades se extiende entre las vellosidades emergentes, se forman nuevos grupos mesenquimales adyacentes al epitelio de las vellosidades y se producen nuevas rondas de aparición y crecimiento de lasvellosidades 6.
El desarrollo sincronizado del epitelio y el mesénquima es esencial para la morfogénesis de las vellosidades. Las moléculas de señalización se secretan de una capa a la otra, donde los receptores reciben y transducen el mensaje de señal para coordinar el desarrollo entre el epitelio y el mesénquima. Los grupos mesenquimales actúan como centros de señalización y expresan una variedad de morfógenos del desarrollo7-10. La interrupción de la formación o el patrón de los racimos da lugar a la pérdida de la aparición y el patrón de las vellosidades. La inhibición de la señalización de PDGF da como resultado menos grupos y menos vellosidades, y las vellosidades que se forman se deforman siguiendo los grupos anormales11. La pérdida de la señalización del erizo da lugar a la pérdida completa de la formación de racimos y al fracaso de la emergencia de las vellosidades2,12. En conjunto, estos datos demuestran que los grupos coordinan el desarrollo del epitelio de las vellosidades con su núcleo mesenquimatoso.
Utilizando todo este sistema de cultivo de órganos, somos capaces de alterar la señalización involucrada en la diafonía epitelio-mesenquimal para determinar el papel de esas señales en la morfogénesis de las vellosidades. El seccionamiento y la reconstrucción óptica confocal de dos fotones permiten visualizar la formación de clústeres y la aparición de vellosidades en tres dimensiones y comprender mejor las relaciones espaciales entre los grupos mesenquimales y su epitelio suprayacente. Extendiendo el sistema de cultivo a cuatro dimensiones, podemos capturar pilas z de grupos y vellosidades en desarrollo a lo largo del tiempo y observar estas interacciones. En última instancia, la capacidad de seguir el desarrollo de las vellosidades de esta manera y observar los cambios que ocurren con la señalización alterada revolucionará la comprensión de las interacciones epiteliales mesenquimales en la morfogénesis de las vellosidades.

<table><tbody><tr><td>Pinzas de disección fina&nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias</td><td>&nbsp; 11254-20</td><td>2 pares de</td></tr><tr><td>etanol</td><td></td><td></td><td></td>al 70%</tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) estéril de DulbeccoGibco</td><td>&nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 60 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>&nbsp; </td><td></td>451007</tr><tr><td>Placas Transwell, insertos de 24 mm, membranas de policarbonato de 8,0 mm</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>6 insertos por placa</td></tr><tr><td>BGJb media</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000U/ml de Penicilina; 10.000 mg/ml de Estreptomicina)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 15140</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A0278</td><td>hacer 5 mg/ml de caldo, filtrar, alícuota y almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Pipeta de boca (conjunto de tubo de aspiración Drummond de 1-15 pulgadas)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 21-180-10</td><td>Retire el conjunto del aspirador y reemplácelo con un 1,000 &micro; l punta de pipeta que actúa como adaptador para enchufar una pipeta Pasteur de vidrio de 6 pulgadas.</td></tr><tr>Pipetas <td></td><td></td><td></td><td>de vidrio pasteur de 6 pulgadas</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>tirar a las agujas</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído</td><td></td><td></td><td>hecho en 1 x PBS, pH a 7.3</td></tr><tr><td>Placas de cultivo</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>Pantalla de acero inoxidable de malla fina</td><td>compra en ferretería</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato</td><td>Thomas scientific&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>alternativamente, corte las membranas Corning Costar 3428 de los soportes transwell Compra instantánea</td></tr><tr>de<td>pegamento</td><td>en la ferretería</td> a <td>base de gel preferiblemente</td><td></td></tr><tr><td>placas de 35 x 10 mm</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7% agarosa</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; A9414</td><td>preparar w/v en 1x DPBS, calentando para disolver en un baño</td></tr><tr><td>de agua minutien pins Fine</td><td>Science Tools&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Medios libres de rojo de fenol (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>matriz de membrana basal, factor de crecimiento reducido, sin rojo fenol</td></tr><tr><td>3-4% agarosa</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414</td><td>preparar w/v en 1x DPBS, calentar para disolver en un baño</td></tr><tr><td>de agua Imágenes de intestinos fijos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre del material/equipo Número de</td><td>catálogo</td> de <td>la empresa</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>vaselina</td><td>comprada</td><td></td> en farmacia <td>utilizada para hacer VALAP: partes iguales de vaselina, lanolina, parafina</td></tr><tr><td>lanolina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L7387</td><td>utilizado para hacer VALAP: partes iguales de vaselina, lanolina, parafina</td></tr><tr><td>parafina</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>utilizado para hacer VALAP: partes iguales de vaselina, lanolina, parafina</td></tr><tr><td>70% glicerol en 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear y Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Compra de arcilla para modelar</td><td>en la tienda</td><td></td><td></td>de suministros de arte</tr>, cinta <tr><td></td><td></td><td></td><td></td>adhesiva doble</tr>, <tr><td>hisopos aplicadores de algodón, moldes de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plástico, 10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Tissue Tek&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr> diapositivas <tr><td>cubreobjetos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>toallita de laboratorio</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>toallita para tareas delicadas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> sin pelusa <tr><td>Tabla de etapas Theiler&nbsp;</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ descargas/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Leica SP5X&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>utilizada para llevar a cabo las imágenes en vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Soporte Leica DMI 6000&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>utilizada para llevar a cabo las imágenes en vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Medio de montaje acuoso (Prolong Gold)</td><td>Sondas moleculares&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Nombre del Material/Equipo</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo Comentarios</td><td>/Descripción</td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Costar</td><td>&nbsp; 3524</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T-8787</td><td>utilizado para hacer Solución de permeabilización: 0.5% Triton X-100 en 1 x PBS</td></tr><tr><td>Suero</td><td></td><td></td><td>de cabra utilizado para hacer Solución de bloqueo: 4% Suero de cabra, 0.1% Tween20 en 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema de cultura ratón fetal whole intestino para ex vivo manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

La mayoría de los procesos morfogenéticos en el intestino fetal se han deducido a partir de secciones finas de tejidos fijados, proporcionando instantáneas de los cambios más etapas de desarrollo. Información tridimensional a partir de secciones delgadas de serie puede ser difícil de interpretar debido a la dificultad de la reconstrucción de las secciones de serie perfectamente y mantener la orientación adecuada de los tejidos en las secciones de serie. Las investigaciones recientes de Grosse et al., 2011 ponen de manifiesto la importancia de la información dimensional tres en la comprensión de la morfogénesis de las vellosidades del intestino en desarrollo 1. Reconstrucción tridimensional de las células intestinales individualmente etiquetados demostró que la mayoría de las células epiteliales intestinales en contacto con ambas superficies apicales y basales. Además, la reconstrucción tridimensional del citoesqueleto de actina en la superficie apical del epitelio demostró que el lumen intestinal es continua y que los lúmenes secundarios son un artefacto de sectioning. Esos dos puntos, junto con la demostración de la migración nuclear interkinetic en el epitelio intestinal, definen el epitelio intestinal como el desarrollo de un epitelio pseudoestratificado y no estratificados como se pensaba anteriormente 1. La capacidad de observar el epitelio tridimensionalmente era seminal a demostrar este punto y la redefinición de la morfogénesis epitelial en el intestino fetal. Con la evolución de la tecnología de imágenes multi-fotón y software de reconstrucción en tres dimensiones, la capacidad de visualizar intacta, el desarrollo de órganos está mejorando rápidamente. Excitación de dos fotones permite la penetración más profunda menos perjudiciales en los tejidos con alta resolución. Dos fotones de imágenes y reconstrucción 3D de todo el intestino del feto de ratón en Walton et al., 2012 ayudaron a definir el patrón de vellosidades consecuencia 2. Aquí se describe un sistema de cultivo de órgano entero que permite ex vivo el desarrollo de las vellosidades y las extensiones de ese sistema de cultivo para permitirlos intestinos sean tridimensionalmente fotografiado durante su desarrollo.

Cultura de explantes enteros de intestinos fetales permite el análisis de la ubicación, la distribución, y la duración de las moléculas de señalización que coordinan el desarrollo intestinal, ya que este sistema permite la manipulación de la señalización con reactivos farmacológicos o proteínas recombinantes. El sistema de cultivo transwell (Figura 1A, reproducida de Walton et al., 2012) 2 proporciona una interfaz aire-líquido, lo que hace posible colocar de drogas o de proteínas emp...

La tecnología de imagen mejorada está permitiendo la obtención de imágenes tridimensionales de los órganos durante el desarrollo. Aquí describimos un sistema de cultivo de órganos completo que permite obtener imágenes en vivo de las vellosidades en desarrollo en el intestino fetal del ratón.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar órganos enteros de intestinos embrionarios de ratón, ex vivo, lo que permite la modulación de las vías de señalización celular. Esto se logra primero recolectando intestinos de ratón de fetos entre el día embrionario 12,5 y 18,5. El segundo paso consiste en colocar los intestinos en una placa de cultivo tipo transwell o en una placa de cultivo para imágenes en vivo.A continuación, trate los intestinos con medio preparado con inhibidores farmacológicos de las vías de señalización celular o coloque proteínas recombinantes absorbidas en discos sobre los intestinos para alterar la señalización celular. El último paso consiste en obtener imágenes de los intestinos cultivados, ya sea en cortes histológicos gruesos o en preparaciones de montaje completo.En última instancia, la imagen confocal seguida de la reconstrucción tridimensional se utiliza para visualizar cómo la modulación de las vías de señalización celular ha afectado el desarrollo de las capas del tejido durante la formación de las vellosidades. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el tejido embrionario es muy delicado y requiere un gran cuidado duran

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un...

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

Este artículo y el vídeo de acompañamiento presentar nuestro protocolo para la generación de tejido de ingeniería intestino en el ratón, utilizando un organoide unidades-on-andamio enfoque.

Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Aquí, se describe un protocolo para la cosecha, mantener y tratar de ratón pequeñas organoides intestinales con patrones patógenos asociados moleculares (PAMPs) y Listeria monocytogenes, así como énfasis en la expresión génica y las técnicas de normalización adecuados para las proteínas.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos. Estos cultivos primarios intestinales permiten la investigación de vías de señalización subyacentes secreción de péptido intestinal usando un número de técnicas.

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

Este protocolo describe cómo imitar la transición de succión a destete in vitro utilizando organoides intestinales fetales tardíos de ratón cultivados durante 30 días.

Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Aquí describimos la construcción de un sistema modelo básico tridimensional (3D) de líneas celulares intestinales y un protocolo de inclusión de parafina para la evaluación microscópica óptica de equivalentes intestinales fijos. La tinción de proteínas seleccionadas permite el análisis de múltiples parámetros visuales de un solo experimento para su uso potencial en estudios preclínicos de detección de fármacos.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

Aprende a cultivar intestinos fetales de ratón ex vivo para estudiar el desarrollo de vellosidades mediante imágenes tridimensionales en tiempo real. Este método permite modular vías de señalización celular.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades (Video) | JoVE Journal

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

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