Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

El objetivo general de este procedimiento es cultivar órganos enteros de intestinos embrionarios de ratón, ex vivo, permitiendo así la modulación de las vías de señalización celular. Esto se logra cosechando primero intestinos de ratón de fetos entre el día embrionario 12,5 y 18,5. El segundo paso es colocar los intestinos en un cultivo transwell o en una placa de cultivo de imágenes vivas.

A continuación, trate los intestinos con medios preparados con los inhibidores farmacológicos de las vías de señalización celular o local. El aro se empapa de proteínas recombinantes para alterar la señalización celular en la parte superior de los intestinos. El paso final es obtener imágenes de los intestinos cultivados, ya sea en secciones gruesas de vioma o en montaje en orificio.

En última instancia, las imágenes confocales seguidas de la reconstrucción tridimensional se utilizan para visualizar cómo la modulación de las vías de señalización celular ha afectado el desarrollo de las capas de tejido durante la formación de vellosidades. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el tejido embrionario es muy delicado y requiere mucho cuidado durante la disección y la manipulación. Para prepararse para la disección, remoje las herramientas de disección en etanol al 70%.

Coloque la placa de cultivo de seis pocillos y las placas de Petri de 10 centímetros con medios BGJB en hielo. A continuación, extraiga los intestinos de los fetos eutanasiados. Diseccionarlos uno por uno en uno X-D-P-B-S.

Retire con cuidado el bazo del estómago, luego el páncreas del estómago y el duodeno superior. Después de eso, separe suavemente el epiplón, dejándolo unido tanto como sea posible, y separe las conexiones solo lo suficiente para permitir que el intestino se enderece. A continuación, coloque las muestras en una placa de Petri de 10 centímetros con medios BGJB que funcionen.

A continuación, utilice una pipeta bucal para transferir las piezas intestinales a los transpocillos de la placa de cultivo. Retire el medio de debajo del transpozo. A continuación, añada 700 microlitros de medios de tratamiento bajo el trans.

Posteriormente, agregue 300 microlitros de medio de tratamiento gota a gota en los intestinos y deje que penetre a través del transwell. Cambie el medio de tratamiento al menos una vez al día o con más frecuencia en función de la vida media del reactivo de tratamiento. Alternativamente, coloque suavemente las perlas agrícolas en los intestinos con una pipeta bucal con una aguja capilar estirada.

Coloque las cuentas con extrema precaución, ya que un manejo brusco dañará el intestino y evitará el desarrollo de vellosidades en el área lesionada. En este procedimiento, incruste los intestinos en 7%aros en pequeños moldes de plástico y deje que los bloques de aros se enfríen y solidifiquen. Luego, retire los bloques de aros de los moldes de plástico.

Pega los bloques aros a la etapa de recolección de Vibram con pegamento instantáneo. A continuación, llene la etapa de recolección con hielo X-D-P-B-S. Corta las secciones con un grosor de 100 a 150 micrómetros.

A continuación, transfiera las secciones de la etapa de recolección a un pozo de la placa de seis pocillos para su almacenamiento a cuatro grados centígrados. Para preparar los portaobjetos para el montaje, coloque cinta adhesiva de doble cara a lo largo del portaobjetos largo de cada portaobjetos. Coloque una gota de un XPBS sobre él.

Luego, coloque con cuidado de cinco a 10 secciones en el portaobjetos. Despliega todas las secciones y extiéndelas en una sola capa. A través de la diapositiva.

Retire cualquier exceso de aros o partes irregulares que impidan que la cubierta quede plana. Use con cuidado un pañuelo de papel de laboratorio para absorber el exceso de un XPBS alrededor de las secciones. A continuación, una gota de medio de montaje acuoso en la parte superior de las secciones.

A continuación, coloque el cubreobjetos sobre él y séllelo en el portaobjetos con vap derretido. Después, tome imágenes de las secciones de vioma en un microscopio confocal vertical o invertido. Ahora use pegamento instantáneo para adherir una membrana de policarbonato individual a una pantalla de malla fina.

Coloque la pantalla de malla en el pocillo central de una placa de cultivo. A continuación, coloca el intestino diseccionado sobre la membrana de policarbonato y añade una gota de pegamento instantáneo en cada uno de los extremos. A continuación, agregue medios de cultivo libres de rojo fenol debajo de la membrana de policarbonato en el pocillo central de la placa de cultivo.

Agregue agua al borde exterior de la placa de cultivo para proporcionar humedad. Dado que el intestino fetal experimenta ondas peristálticas de contracción en el cultivo, agregue 100 microlitros de solución de xilacina a tres mililitros de medio en el pocillo central de la placa para controlar el movimiento del intestino mientras se toman las imágenes. Realice las imágenes en vivo utilizando un microscopio de fluorescencia confocal de dos fotones en un soporte vertical.

Aquí se muestran las secciones transversales de tejido duodenal E 14, E 15 y E 16 recién cosechado teñido con ecat aquí y dpi. Este segmento intestinal se recolectó en E 14 y se cultivó durante dos días. En E 14, el epitelio no modelado todavía estaba pseudoestratificado.

Después de dos días en cultivo, los VII son visibles, aunque se retrasan ligeramente en comparación con los VII. En E 16, aquí está la reconstrucción tridimensional de las secciones ópticas de la vasculatura teñida con pcam en el duodeno E 14, y esta figura muestra las reconstrucciones tridimensionales de imágenes confocales de intestinos seccionados con E 15.5 vioma que fueron teñidos con inmunofluorescencia de anticuerpos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar el tejido embrionario, configurar los intestinos para el cultivo de órganos completos y preparar el tejido para imágenes tridimensionales de alta calidad.