Multimodales ópticos Métodos Microscopía Reveal Polyp Tissue Morfología y Estructura del Caribe del filón de construcción corales

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de pólipos de coral de uno a dos milímetros de grosor en 3D para comprender la estructura fina, así como los pigmentos de coral y su localización. Esto se logra primero incrustando la muestra en cera, luego cortando la muestra en secciones de una micra usando un micrótomo. A continuación, se utiliza una técnica de cara de bloque en serie diseñada a medida para obtener imágenes de los pólipos de coral y reconstruir la imagen en 3D.

Utilizando múltiples imágenes 2D, se obtienen resultados que muestran la capacidad de la técnica para resolver detalles estructurales finos del tejido coralino sin comprometer su integridad estructural. Demostración del procedimiento. Hoy será el Dr. Maunde Siva guru, colaborador de mi grupo de investigación.

Para preparar la cera de prefiltración, derrita 3,6 gramos de novillo en copos en un vaso de vidrio en una placa caliente. A continuación, agregue 400 miligramos de Sudán. Cuatro para minimizar la fluorescencia de fondo de cera, mezcle bien y espere hasta que se logre una solución roja translúcida.

Luego agregue 81 gramos de parafina y mezcle bien. Posteriormente, agregue 15 gramos de barra VI granular blanca y derrita completamente en el mismo vaso de precipitados. Una vez derretido, mézclalo de nuevo para obtener una solución de cera completamente mezclada.

Ahora agregue la mezcla a una botella de vidrio y cierre sin apretar con una tapa. Coloque la botella de vidrio en un horno de convección a 60 grados centígrados para mantener los ingredientes en estado líquido y que se produzcan todas las infiltraciones. Esta solución se puede hacer a 200 mililitros y dividir en dos botellas de 100 mililitros.

Se recolectaron muestras de coral de la UA y otra para la infiltración final de los arrecifes del Caribe y se fijaron en formaldehído en el campo. Para incrustar los tejidos de coral para SBFI, primero lave los pólipos de coral recolectados en el campo y guárdelos a cuatro grados Celsius en para formaldehído. Después, lávelos en PB S3 veces durante cinco minutos cada vez que estén listos para ser fotografiados.

Descalcifique los pólipos en una solución ex Cal 2 durante 24 horas o hasta que los pólipos estén totalmente desprovistos de carbonato de calcio. Incubar varios pólipos de coral descalcificados como un solo bloque en una serie de 25, 50, 75 y 100% etanol seguido de un x xileno. Sustituir por 30 minutos en cada sesión para deshidratar las muestras.

A continuación, coloque los pólipos procesados en xileno al 100%. Sustituya en un horno a 65 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, reemplácelo con solución fresca e incube durante otros 30 minutos.

Oriente los pólipos con la parte superior hacia abajo y la superficie lo más plana posible. Haz soluciones de dos a uno, de uno a uno y de uno a dos. Sustituto de xileno y cera de prefiltración.

En tubos Falcon de 50 mililitros incuban los pólipos de coral con estas tres concentraciones crecientes de cera de prefiltración, seguidas de tres incubaciones en cera de prefiltración al 100% durante 30 minutos a una hora cada vez. Ahora transfiera la muestra a la cera de inclusión. Retire la cera de inclusión después de 30 minutos, luego reemplácela con cera de inclusión nueva y continúe la incubación durante un mínimo de cuatro horas a 65 grados centígrados.

Después, fotografía la cuadra. Esto es necesario porque una vez incrustada en la cera, la ubicación de la muestra se volverá invisible ya que la cera roja incrustada es opaca. A continuación, coloque pequeñas gotas de cera de alto punto de fusión alrededor del nuevo molde de inclusión de acero inoxidable precalentado y deje que se enfríe.

Vierta rápidamente un pequeño volumen de cera recién derretida y de lecho de la segunda alícuota y coloque el pólipo de coral boca abajo sobre el punto de cera blanca. A continuación, coloque un portamuestras de plástico en la bandeja de acero inoxidable y vierta más cera de incrustación para que la cera llegue a la superficie del molde de plástico. Ahora saque toda la configuración del horno a 65 grados centígrados y deje que se enfríe en un banco o una superficie fría hasta que la cera se endurezca por completo.

Después de eso, coloque el bloque desecado en un refrigerador a cuatro grados centígrados, protegido de la luz para el almacenamiento a largo plazo para seccionar el bloque. Primero, recórtalo y corta secciones de una micra. Con un micrótomo, capture la imagen de la cara lisa del bloque, que contiene la muestra.

cada vez. Cuando se retira una sección, la muestra aparece cuando la cera blanca comienza a desaparecer. A continuación, capture las imágenes con una cámara monocromática utilizando un filtro fluorescente fitzy para captar la autofluorescencia de los cromatóforos o la imagen de pólipos de coral, tres o cuatro núcleos descalcificados de cada muestra.

Para realizar dos imágenes de fluorescencia de fotones, coloque los núcleos de pólipos de coral lavados en formaldehído al 4% boca abajo en un plato con fondo de vidrio cubierto usando un láser de dos fotones a 780 nanómetros con una imagen de excitación de tres a cuatro pólipos a dos aumentos diferentes usando un objetivo de 10 x. A continuación, utilice el modo de escaneo de mosaicos para recopilar aproximadamente de 25 a 100 imágenes por plano focal en XY a intervalos de 10 o 20 micras. A continuación, recoja de 50 a 100 imágenes a través del eje Z a intervalos de 10 o 20 micras, lo que supondrá un total de 5.000 a 10.000 imágenes por pólipo de coral.

Después de esa imagen, tres o cuatro áreas de pólipos para representar un núcleo y una especie de coral. A continuación, almacene todas las imágenes en formato de datos sin procesar en el disco duro del sistema. En este procedimiento, recorte los datos 2D para reducir el tamaño del archivo centrándose en un solo pólipo con la herramienta de recorte cuadrado y compílelo como un único archivo TIF.

En el software de adquisición. Abra los archivos ensamblados de los datos SBFI o las pilas Z múltiples en mosaico de dos secciones ópticas de fotones en el módulo del programa EMERIS superan bajo el proyecto de algoritmo de volumen, los datos SBFI renderizados en 3D. Con una proyección de sombra, cree un modo ISOSURFACE en el que los vóxeles sean umbral para crear un patrón de superficie sólida.

Visualice las proyecciones 3D utilizando un algoritmo de recorte plano en los modos ortogonales XY, xz e YZ para revelar la estructura y la forma 3D de los corales. A continuación, anime las proyecciones utilizando un módulo de animación de fotogramas clave. En el mismo programa de erris, genere archivos de vídeo con una compresión del 5% y genere clips de película en formato VI utilizando las modalidades de volumen 3D e isosuperficie.

Aquí están las dos imágenes 3D de fluorescencia de fotones de pólipos de coral de M Anis y M fa Lata. Estas dos imágenes se capturaron sin separación espectral de los componentes utilizando una excitación de 780 nanómetros del láser de dos fotones con la señal óptica recogida de 450 a 700 nanómetros, y estas dos imágenes se recogieron con la misma excitación, pero se utilizaron simultáneamente dos detectores de tubos fotomultiplicadores para recoger los datos de dos componentes, uno de 500 a 550 nanómetros y el otro de 650 a 720 nanómetros. Se trata de imágenes con recubrimiento de profundidad.

El rojo son los componentes más superficiales y el azul son los componentes más profundos en 2D. Sí. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar correctamente la muestra incrustada en cera roja. La combinación de imágenes faciales en bloque en serie y microscopía fluorescente de dos pies permite el análisis de la pigmentación del coral y la estructura celular en una variedad de escalas de lentes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manejar e imaginar los corales constructores de arrecifes y sus propiedades espectrales en tres dimensiones.