Combinación de Microstereolithography y electrospinning para Fabricación de membranas Equipado con nichos para la regeneración de la córnea

El objetivo general del siguiente experimento es introducir la complejidad espacial 3D dentro de los andamios de ingeniería de tejidos mediante la combinación del uso de técnicas de fabricación aditiva y electrohilado. Esto se logra mediante la creación de una plantilla no degradable hecha de polietilenglicol, D acrl o PEG DA, utilizando una técnica de fotocurado capa por capa llamada microestereolitografía. Como segundo paso.

Las plantillas se unen a un sustrato metálico y se utiliza un electrohilado para producir una membrana biodegradable que imita la morfología subyacente. A continuación, se estudian los procedimientos de empaquetado y la degradación de las membranas electrohiladas. La degradación prematura de las membranas almacenadas se evita mediante el control de la temperatura y la humedad.

El paso final consiste en colocar las membranas biodegradables en un modelo 3D de córnea herida para estudiar su potencial uso como dispositivos de regeneración corneal. Los resultados muestran la versatilidad del uso de técnicas de fabricación aditiva y electrohilatura para crear membranas complejas que contienen microbolsas que imitan hasta cierto punto el nicho de las células madre naturales. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad.

Dado que los moldes no biodegradables se pueden crear nuevos, utilizando una amplia gama de técnicas de fabricación, este método sería de interés tanto en el campo de la fabricación como en el de la regeneración de tejidos, y ayudaría a responder preguntas clave relacionadas con el comportamiento de las células madre y el nicho de las células madre. Este método de fabricación de andamios microfabricados puede proporcionar información sobre la regeneración de la córnea. También se puede aplicar a otros tejidos epiteliales con nichos de células madre, como la piel y la mucosa oral, o para proporcionar otras características 3D y andamios para la ingeniería de una amplia gama de tejidos.

Tanto el líder Ortega como Thomas Patterson harán una demostración del procedimiento. Comience este procedimiento creando L uno, la primera capa. Eso se convertirá en la base de la estructura utilizando cualquier programa de dibujo adecuado para un círculo negro de 1,2 centímetros.

A continuación, crea L dos. La segunda capa, dibuja otro círculo negro de 1,2 centímetros, pero incluye de seis a ocho estructuras blancas en forma de herradura de 0,5 por 0,35 milímetros. Distribuye las pequeñas formas de herradura blanca dentro de la estructura del círculo negro.

Guarde L uno y L dos en formato JPEG para configurarlos para la microestereolitografía. Primero, ajuste y limpie cuidadosamente la óptica del sistema. Coloque 300 microlitros de polietilenglicol di acrl, o mezcla de PEG D en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos.

El pozo debe estar prerrecubierto con teflón u otro material antiadherente o de fácil extracción de la estructura. Después del curado, encienda el láser azul y cargue L one en el software básico ALP three. Este software es una interfaz USP que proporciona el enlace entre la PC y el dispositivo de microespejo digital.

Irradia la primera capa durante 60 segundos. Agregue al pozo 250 microlitros más de la peg da. Cargue L dos e irradie L dos durante 60 segundos.

Retire el polímero sin curar y lave los anillos con isopropanol durante la noche El día antes del electrohilado, cree un colector de electrohilatura estático distribuyendo los anillos PEG DA en una lámina de aluminio galvanizada de 12 centímetros por 20 centímetros. Fije los anillos con cinta de carbono conductora. Prepare la solución de polilactida co glico o PLGA y revuélvala durante la noche antes de usarla al día siguiente.

Coloque cuatro jeringas de cinco mililitros con agujas de 0,8 centímetros de diámetro interior en una bomba de jeringa. Se utilizan cuatro jeringas en lugar de una sola jeringa. Para garantizar una carga de electrogiro más rápida, 2,5 mililitros de la solución de PLGA en cada jeringa.

Para el éxito de este procedimiento, es importante tratar de mantener las variables laro pinina lo más constantes posible. Deje una distancia entre las agujas y el colector de 15 centímetros. Establezca un caudal de 30 microlitros por minuto y voltajes que oscilan entre 12 y 15 kilovoltios para el electrogiro electrogiratorio durante una hora y 30 minutos.

Cuando termine el electrohilado, despegue con cuidado la lámina de electroesponja PLGA del colector que soporta los anillos PEG da. Los anillos PEG DA se pueden reutilizar como plantillas para el electrohilado. Utilice una perforadora circular para cortar los andamios electro spon en círculos de 22 milímetros de diámetro.

Dejando la estructura del anillo colocada en el centro para preparar las membranas PLGA para el almacenamiento a largo plazo. Monte cada uno en un recipiente pequeño, como una placa de Petri de plástico, y colóquelo dentro de una bolsa de grado médico. Coloque tres bolsas de desecante dentro de la bolsa de grado médico.

Agregue a la bolsa una tarjeta indicadora de humedad de seis puntos disponible en el mercado. Esto detectará cualquier acumulación de humedad durante el período de almacenamiento. Use una máquina de sellado térmico al vacío para aspirar y sellar la bolsa.

Posteriormente, las membranas de PLGA se envían a una empresa externa, la gamma o radiación antes del almacenamiento. En este experimento, se aíslan berenjenas limbales de conejo a partir de ojos de conejo obtenidos de una granja donde se crían conejos para el consumo. Primero desinfecte los ojos de conejo con una solución antiséptica al 3%.

A continuación, limpie los ojos eliminando el exceso de tejido que rodea la córnea. La región limbal se puede identificar como un área circular delgada entre la córnea transparente y la esclerótica blanca. Separa la región limbal del resto de la córnea.

Corte la región limbal en segmentos de aproximadamente 1,5 centímetros de longitud, desinfecte los segmentos limbales en una solución antiséptica al 1,5% durante un minuto. Después de la desinfección, use una hoja de bisturí para cortar los segmentos limbales en trozos pequeños. Almacene los pequeños trozos de tejido en DMEM más medios de saturación máxima a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono o máximo una hora antes de su uso.

Para comenzar este procedimiento, use un raspador de células para cubrir las membranas del anillo con 15 microlitros de pegamento de fibrilina. Distribuya la fibrilina de manera uniforme mientras trabaja bajo un microscopio de disección. Utilice una aguja de calibre 25 para colocar los explantes limbales directamente en las microbolsas de PLGA.

Coloque los anillos con el tejido explanado sobre córneas desnudas previamente preparadas. Con el explan hacia arriba y en condiciones de interfaz aire-líquido, el anillo PLGA se humedecerá rápidamente y adoptará la forma del modelo de córnea. Mantener los modelos de cultivo de órganos durante cuatro semanas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, cambiar el medio cada dos días.

La microestereolitografía permite la fabricación de anillos PEG DA de diferentes tamaños y la incorporación simultánea de microcaracterísticas. Los anillos se pueden fabricar y reutilizar de forma reproducible y se fijan fácilmente a una lámina de metal que se puede utilizar como colector de electrohilado. En este ejemplo, los anillos contienen micro características de herradura.

A continuación, Electro spinning produce réplicas de PLGA: el envasado al vacío de las membranas PLGA mejora significativamente su almacenamiento a largo plazo incluso a 37 grados centígrados en condiciones deliberadamente húmedas. El tipo de bolsa utilizada también afecta la estabilidad de la membrana, la microscopía electrónica de barrido y el examen de los tres diseños no muestran cambios en la integridad de la fibra o la humedad de las fibras intactas. Crecimiento celular de implantes limbales o soportado por anillos y anillos de PLGA biodegradables recién hechos después de seis meses de almacenamiento a menos 20 grados centígrados.

Al colocar las membranas de PLGA en modelos 3D de córnea herida, la transferencia celular se logró después de cuatro semanas. Las imágenes H y e muestran el nuevo epitelio multicapa formado por las células que salen de los explantes colocados en los nichos. El control negativo confirmó la falta de formación de un nuevo epitelio en ausencia de células añadidas.

En comparación con un epitelio corneal convencional observado en una córnea de conejo fresca utilizada como control positivo. La inmunocitoquímica demostró que las células que crecían a partir de los implantes eran células epiteliales de la córnea, ya que eran positivas para la citoqueratina tres, un marcador de diferenciación corneal. Dado que los colectores electro giratorios que contienen las plantillas no biodegradables son reutilizables, la producción de los andamios se puede realizar en dos horas cuando se optimiza el protocolo.

Esta técnica permite a los investigadores en los campos de la ingeniería de tejidos explorar una nueva forma de fabricar membranas complejas de ingeniería de tejidos que contienen microcaracterísticas en las que estudiar el comportamiento celular. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo crear una plantilla microfabricada no degradable mediante el uso de técnicas de fabricación aditiva o enfoques similares, como el modelado y cómo usar el electrohilado para agregar complejidad a sus andamios.