Name: Análisis de Metabolómica de cerebro de rata por Alta Resolución Nuclear Espectroscopía de Resonancia Magnética de Extractos de Tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a obtener perfiles metabólicos de alta resolución de extractos cerebrales de rata mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Este método permite analizar concentraciones de metabolitos para estudiar cambios neuroquímicos en enfermedades neurológicas.

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Apoyo del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 y 7339) es agradecido.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Espectroscopía de RMN es un método eficiente para la medición de concentraciones de compuestos químicos en solución de una manera muy reproducible y precisa. Sin embargo, para obtener datos de alta calidad, es necesario cumplir con ciertas normas relativas a la preparación y análisis de muestras. En la determinación de las concentraciones de metabolitos por espectroscopía de RMN, ni la generación ni la recepción de la señal de RMN domina el error de cuantificación, a menos que la intensidad de una señal observada se ace...

Los modelos murinos han sido utilizados ampliamente en la investigación del cerebro 1. Correlaciones genotipo-fenotipo han sido investigados en cerebros de ratón y de rata mediante el estudio de la expresión génica en el ARN y / o los niveles de proteína, por una parte, y fenotipos morfológicos, funcionales, electrofisiológicas y / o de comportamiento en el otro 2-6. Sin embargo, para entender completamente los mecanismos que vinculan fenotipo a genotipo, es imperativo investigar los eventos moleculares aguas abajo de la expresión de proteínas, es decir. el metabolismo de los sustratos bioquímicos sobre la que actúan las enzimas 7. Este requisito llevó, en los últimos 10 a 15 años, a un renacimiento de la investigación metabólica en muchas ramas de la biología 8,9. Mientras que los estudios metabólicos clásicos a menudo se han centrado en los detalles de las vías específicas, el nuevo enfoque de metabolómica está orientada a una investigación que todo lo abarca del perfil metabólico global del tejido en estudio.Una consecuencia de este concepto es evidente la necesidad de herramientas de análisis que minimizan el sesgo hacia las vías y / o clases de compuestos metabólicos específicos. Sin embargo, un ensayo bioquímico clásico se basa en una reacción química particular de un analito específico que necesita ser especificado antes de que se realiza el ensayo. Por el contrario, técnicas espectroscópicas tales como resonancia magnética (NMR) nuclear y espectrometría de masas (MS) (i) se basan en propiedades moleculares particulares (físicas) de compuestos bioquímicos, cada uno de los cuales da lugar a una o varias señales distintas en un espectro detectado en el transcurso de un experimento; y (ii) detectar un gran número de diferentes compuestos por experimento. Por lo tanto, cada espectro contiene la información combinada de toda una gama de metabolitos. Por esta razón, métodos espectroscópicos son herramientas adecuadas para la metabolómica, como ninguna selección previa necesita ser hecha en cuanto a la naturaleza del analito a medir 8 </sup&gt;. Como consecuencia, estas técnicas se prestan naturalmente a los estudios exploratorios porque facilitan en gran medida la detección de cambios metabólicos inesperados. Aunque la espectroscopia de RMN y MS se pueden utilizar indistintamente para el análisis de muchos metabolitos, cada método tiene ventajas y desventajas de que recientemente se han revisado 10 específicos. Brevemente, la espectroscopía de RMN se puede realizar generalmente a partir de extractos crudos y no requiere separación cromatográfica de los compuestos de la muestra antes del análisis. Por el contrario, MS funciona con gas o cromatografía líquida (GC o LC) de separación, a excepción de determinados acontecimientos recientes, como la imagen de espectrometría de masas. En unos pocos casos especiales, tales como el análisis de azúcares, separación de LC puede llegar a ser una necesidad para la espectroscopia de RMN, así, porque las líneas de resonancia de diferentes azúcares se solapan significativamente en protones (1 H) Los espectros de RMN. Sin embargo, 1 H RMN espectroscopía sin chrseparación omatographic sigue siendo el método de RMN metabolómico más popular, casi universalmente aplicada. En general, la preparación de muestras es más largo y complejo para la EM que para la espectroscopía de RMN. Los problemas graves debido a los efectos de matriz son mucho menos comunes en la espectroscopia de RMN que en MS en los que pueden dar lugar a señales considerablemente atenuadas. La cuantificación de metabolitos puede lograrse con cualquiera de los métodos. Sin embargo, se necesitan múltiples compuestos estándar para la EM, debido a las variaciones en los efectos de matriz y la eficiencia de ionización entre metabolitos. Por el contrario, sólo se necesita un estándar por muestra para un análisis espectroscópico de RMN porque bajo condiciones de medición adecuadas, el último método es intrínsecamente gracias cuantitativos a la respuesta RMN estrictamente lineal por los núcleos observados. Un inconveniente importante de RMN es su sensibilidad relativamente baja. MS, en particular, LC-MS, es más sensible que la RMN en varios órdenes de magnitud; por esta razón, MS es preferible más de RMN para elanálisis de compuestos que se producen a concentraciones muy bajas. Por otro lado, la naturaleza no destructiva del experimento de RMN es una clara ventaja sobre MS; de esta manera, RMN se puede realizar varias veces sobre la misma muestra, por ejemplo, para diferentes núcleos-RMN activo tal como 1 H, fósforo-31 (31 P), carbono-13 (C 13), flúor-19 (19 F) etc., ya que ningún material se consume por NMR en comparación con las mediciones de EM. Tanto RMN y MS se pueden emplear en diferentes modos, cada uno de ellos sea óptima para la detección de compuestos con características químicas particulares. Por ejemplo, 31 P RMN es a menudo más adecuado que 1 H RMN para el análisis de compuestos fosforilados moderadamente concentradas, aunque casi todos los metabolitos fosforilados también contienen protones. Sin embargo, sus señales de 1 H RMN pueden ser oscurecidos por 1 H NMR señales de otros compuestos, no fosforilados, mientras que el segundoobviamente no causan señales de fondo en 31 P espectros de RMN. En una situación analógica, 19 F análisis de RMN es preferible para los compuestos fluorados, por ejemplo, medicamentos fluorados (no hay señales de fondo de metabolitos endógenos), mientras que el caso especial de 13 C RMN es de interés casi exclusivamente si el destino de 13 C precursores metabólicos exógenos marcados necesita ser seguido, debido a la extremadamente baja abundancia natural del isótopo 13 C (ca. 1%). Muchos espectrómetros de masas funcionan tanto en modo de ion negativo o modo de ion positivo. Por lo tanto, es importante saber de antemano el análisis de si los iones que se deben observar están cargados negativamente o positivamente. Nos centramos aquí en un protocolo para el análisis del metaboloma tejido cerebral por 1 H y 31 P espectroscopía de RMN ya que este método se obtiene un gran número de concentraciones de metabolitos importantes a bajo costo en términos de (i) el tiempo necesario para la preparación de muestras de unnd (ii) el esfuerzo requerido para la cuantificación de metabolitos. Todos los experimentos se pueden realizar utilizando el equipo de un laboratorio húmedo química estándar y una instalación de espectroscopia de RMN de alta resolución. Otros requisitos se describen en la sección Protocolo de abajo.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Virbac</td><td>Vetflurano</td><td>Anestésico para animales</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td> Nuevo <td>modelo disponible: Isotec 4</td></tr><tr><td>Bisturí, tijeras, pinzas, pinzas</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>varios varios</td><td>Equipos quirúrgicos para animales</td></tr><tr><td>Herramienta de congelación</td><td>casera</td><td>n/a</td><td>Pinza con placas de aluminio, para insertar en nitrógeno líquido para refrigeración</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gas nitrógeno</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador de nitrógeno</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Puede ser reemplazado por un dispositivo de fabricación casera</td></tr><tr><td>Mortero</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>Mortle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Con tubos de ensayo que se ajustan al eje del homogeneizador</td></tr><tr><td>Báscula electrónica</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de vidrio</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, tubo de 30 ml</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax Tubo de 2 ml; debe reemplazar el tubo "Eppendorf" si es compatible con el rotor de centrífuga</td></tr><tr><td>Pipetas de poliestireno</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes Volúmenes de</td><td>5 y 10 ml</td></tr><tr><td>Deuterocloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99,96% deuterado</td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99,96% deuterado</td></tr><tr><td>Cloruro de deuterio</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% en óxido de deuterio</td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% en óxido de deuterio</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga en frío</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de cesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>tubos de RMN Wilmad</td><td></td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>Inserto coaxial de resonancia magnética nuclear</td><td>Sigma-Aldrich Z278513</td><td></td><td>By Wilmad pipetas</td></tr> de <tr><td>RMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>Con puntas para volúmenes de 0,5 a 1.000 &mu; l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>espectrómetro de RMN</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>que incluye sonda y otros accesorios</td></tr><tr><td>software de RMN</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>versión más reciente disponible: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Compuestos estándar solubles en agua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>compuestos estándar de fosfolípidos</td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>varios varios varias Fuente de</td><td>plasmalógenos, pero puede ser < 70 - 80% de pureza</td></tr><tr><td>Metilendifosfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de metabolómica de cerebro de rata por alta resolución nuclear espectroscopía de resonancia magnética de extractos de tejidos

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Los estudios de la expresión génica en los niveles de ARN y proteínas se han utilizado durante mucho tiempo para explorar los procesos biológicos subyacentes a las enfermedades. Más recientemente, la genómica y la proteómica se han complementado con un análisis cuantitativo exhaustivo del conjunto de metabolitos presentes en los sistemas biológicos. Esta estrategia, denominada metabolómica, se esfuerza por proporcionar una caracterización global del complemento de moléculas pequeñas implicado en el metabolismo. Mientras que el genoma y el proteoma definen las tareas que las células pueden realizar, el metaboloma es parte del fenotipo real. Entre los métodos utilizados actualmente en metabolómica, las técnicas espectroscópicas son de especial interés porque permiten analizar simultáneamente un gran número de metabolitos sin necesidad de una selección previa de vías bioquímicas específicas, lo que permite un enfoque amplio e imparcial. Aquí, se presenta un protocolo experimental optimizado para el análisis metabolómico por espectroscopia de RMN de alta resolución, que es el método de elección para la cuantificación eficiente de metabolitos tisulares. Las fortalezas importantes de este método son (i) el uso de extractos crudos, sin necesidad de purificar la muestra y/o separar los metabolitos; ii) la naturaleza intrínsecamente cuantitativa de la RMN, que permite la cuantificación de todos los metabolitos representados por un espectro de RMN con un solo compuesto de referencia; y (iii) la naturaleza no destructiva de la RMN, que permite el uso repetido de la misma muestra para múltiples mediciones. El rango dinámico de las concentraciones de metabolitos que se pueden cubrir es considerable debido a la respuesta lineal de las señales de RMN, aunque los metabolitos que se producen en concentraciones extremadamente bajas pueden ser difíciles de detectar. Para los compuestos menos abundantes, el método de espectrometría de masas altamente sensible puede ser ventajoso, aunque esta técnica requiere procedimientos de preparación y cuantificación de muestras más complejos que la espectroscopia de RMN. Presentamos aquí un protocolo de RMN ajustado al análisis del cerebro de rata; Sin embargo, el mismo protocolo se puede aplicar a otros tejidos con pequeñas modificaciones.

Para obtener mejor resolución en los espectros de RMN metabólica de cerebro y otros extractos de tejidos, se ha sido durante mucho tiempo una práctica común para eliminar iones o máscara de metal (lo más importante: iones paramagnéticos) presentes en soluciones de extracto. Esto se ha logrado ya sea mediante la adición de un agente quelante tal como EDTA o CDTA al extracto 19, o haciendo pasar el extracto a través de una resina de intercambio iónico tal como Chelex-100 20. Los resultados presentado...

La neuroquímica del cerebro de los mamíferos cambia en muchas enfermedades neurológicas y sistémicas. Los perfiles característicos de los metabolitos cerebrales se pueden obtener de manera eficiente a partir de extractos crudos de tejido cerebral. Para ello, se emplea la espectroscopia de RMN de alta resolución, que permite un análisis cuantitativo detallado de las concentraciones de metabolitos (metabolómica).

Análisis de Metabolómica de cerebro de rata por Alta Resolución Nuclear Espectroscopía de Resonancia Magnética de Extractos de Tejidos

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener perfiles de metabolitos de alta resolución a partir de extractos de cerebro de rata. Esto se logra cosechando primero cerebros de rata y congelándolos en nitrógeno líquido. El segundo paso es extraer los metabolitos cerebrales mediante la homogeneización del tejido en agua con metanol y cloroformo, seguido de la eliminación de proteínas desnaturalizadas y disolventes orgánicos.A continuación, las muestras acuosas se liofilizan y todas las muestras se reutilizan en disolventes bien definidos. Para un análisis espectroscópico de RMN óptimo, el paso final es configurar y optimizar cuidadosamente los experimentos de RMN metabolómica. En última instancia, los espectros de RMN se requieren en condiciones experimentales bien definidas y se evalúan utilizando protocolos de procesamiento de datos optimizados.Aunque este método puede proporcionar información sobre el metabolismo cerebral, también se puede aplicar a otros tejidos blandos como tumores, hígado, riñón y otros órganos. Primero, retire una muestra de tejido cerebral congelado previamente preparada del congelador a menos 80 grados Celsius. A continuación, transfiera inmediatament

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Investigación

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Neurociencia

Un método para la extracción de metabolitos microbianos de las comunidades planctónicas se presenta. Muestreo de toda la comunidad se logra por filtración en filtros especialmente preparados. Después de la liofilización, acuoso-solubles metabolitos se extraen. Este enfoque permite la aplicación de la metabolómica ambientales trans-ómicas las investigaciones de las comunidades microbianas naturales o experimentales.

La concentración de los metabolitos de las comunidades planctónicas de baja densidad para la metabolómica ambiental utilizando espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

Se describe un modelo de rata de trastorno de estrés postraumático (TEPT), que revela las alteraciones persistentes en la función neuroendocrina y el retraso a largo plazo, la respuesta temor exagerado, característicos de pacientes con TEPT. El modelo animal y los métodos descritos aquí son útiles para la correlación de biomarcadores en núcleos cerebrales, que son mecanicista, pero no se puede medir en los pacientes, con biomarcadores en la sangre periférica de células blancas, que pueden.

Biomarcadores en un modelo animal para Revelar correlatos neurales, hematológicas y conductuales de estrés postraumático

El procedimiento se describe la colonización progresiva de seguir evaluando su impacto sobre el metabolismo hepático de acogida. La colonización se controla de manera no invasiva mediante la evaluación de la excreción urinaria de los metabolitos microbianos co-mediante RMN basados ​​en los perfiles metabólicos, mientras que el metabolismo hepático es evaluado por alto ángulo Resolución Magic Spinning (MAS HR) de perfiles de RMN de la biopsia intactas.

La evaluación de alteraciones hepáticas metabólicas durante la colonización progresiva de la libre de gérmenes de ratón por 1 H espectroscopía de RMN

La dopamina está claramente regulado en los núcleos del cerebro medio, que contiene la celda de los cuerpos y las dendritas de las neuronas de dopamina. Aquí se describe un método de disección y manejo de la muestra-para maximizar los resultados, y por lo tanto las conclusiones y puntos de vista, sobre la regulación de la dopamina en el núcleo del cerebro medio de la sustancia negra (SN) y el área tegmental ventral (VTA) en los roedores.

Perfiles Integral del Reglamento de la dopamina en la sustancia negra y el área tegmental ventral

Fuente: Blanc, J., et al. Espectroscopia de resonancia magnética funcional a 7 t en la corteza del barril de rata durante la activación de los bigotes. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el método de análisis de los cambios metabólicos en la corteza del barril de rata utilizando espectroscopia de resonancia magnética funcional durante la estimulación de los bigotes. Los espectros de metabolitos de referencia se comparan con los espectros estimulados para detectar el aumento de lactato en...

Espectroscopia de resonancia magnética funcional de la corteza del barril de rata durante la estimulación de bigotes

La tomografía por emisión de positrones en animales pequeños permite la evaluación de los dos principales sustratos energéticos del cerebro: la glucosa y las cetonas. En el presente método, se inyectan secuencialmente 11C-acetoacetato y 18F-fluorodesoxiglucosa en cada animal, y su absorción se mide cuantitativamente en regiones específicas del cerebro determinadas a partir de las imágenes de resonancia magnética.

Un Protocolo de PET-MRI Dual trazador para la medición cuantitativa de la Regional del cerebro Energía Sustratos captación en la rata

Después de comprobar por sangre oxígeno-nivel-dependiente funcional resonancia magnética (fMRI en negrilla) que el correspondiente barril somatosensorial corteza área (llamado S1BF) está correctamente activado, el principal objetivo de este estudio es cuantificar el contenido de lactato fluctuaciones en los cerebros de rata activado por espectroscopia de resonancia magnética localizada del protón (1H-MRS) en el T.

Espectroscopia de resonancia magnética funcional en 7 T en la corteza del cañón de rata durante la activación de la barba

Describimos procedimientos para el procesamiento de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta resolución para el análisis morfolométrico de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Los micrográficos obtenidos con estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología de un número de otros componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales.

Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos

Este protocolo describe un método para obtener datos estables de resonancia magnética funcional en estado de reposo (rs-fMRI) de una rata que utiliza dosis bajas de isoflurano en combinación con dosis bajas de dexmedetomidina.

Adquisición de datos de resonancia magnética funcional en estado de reposo en la rata

Este artículo presenta el uso de PSYCHE y SAPPHIRE-PSYCHE en el perfil metabólico de las plantas e incluye procedimientos detallados para la preparación de muestras y el registro óptimo de los espectros de RMN de Pure Shift. Se discuten ejemplos a través de los cuales la ganancia en resolución lograda por el desacoplamiento homonuclear permite una comprensión más completa del sistema.

Resonancia magnética nuclear de desplazamiento puro: una nueva herramienta para la metabolómica de las plantas

La adquisición de datos de tomografía dinámica por emisión de positrones (PET) y su reconstrucción en marcos de tiempo permite el análisis de la conectividad metabólica del cerebro a nivel de un solo sujeto. Describimos un método para adquirir datos PET dinámicos de [18F]FDG del cerebro de rata y obtener una matriz de conectividad a través de la extracción de curvas de tiempo-actividad de volúmenes de interés.

Estudio de la conectividad metabólica del cerebro mediante tomografía dinámica por emisión de positrones con 2-desoxi-2-[18F]fluoro-D-glucosa a nivel de un solo sujeto

Aprende a obtener perfiles metabólicos de alta resolución de extractos cerebrales de rata mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Este método permite analizar concentraciones de metabolitos para estudiar cambios neuroquímicos en enfermedades neurológicas.

Análisis de Metabolómica de cerebro de rata por Alta Resolución Nuclear Espectroscopía de Resonancia Magnética de Extractos de Tejidos (Video) | JoVE Journal

Análisis de Metabolómica de cerebro de rata por Alta Resolución Nuclear Espectroscopía de Resonancia Magnética de Extractos de Tejidos

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