En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de la remodelación específica de las neuronas sensoriales en la elegancia marina. Esto se logra extrayendo primero feromonas crudas y adustas de cultivo líquido. El segundo paso es medir la potencia de la feromona cruda.

A continuación, la feromona se utiliza para inducir la formación de humedad en el animal que expresa GFP en las dos neuronas IL. El paso final es montar el animal en el portaobjetos del microscopio durante la etapa de DMT y realizar imágenes en vivo para mostrar la arborización de las dendritas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroplasticidad, como cómo se remodelan las neuronas en respuesta a las condiciones ambientales.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la remodelación de la IL dos, también se puede aplicar a otros eventos específicos del DAER, como la remodelación faríngea. Para comenzar este procedimiento, cultive la e-coli OP 50 de una sola colonia durante la noche a 37 grados Celsius mientras agita 100 mililitros de caldo lb a 200 RPM. Luego crezca la elegancia N dos C en placas de Petri de 15 a 26 centímetros con agar NGM asentadas con 50 microlitros de e coli hasta que las bacterias estén casi agotadas.

A continuación, cultive un cultivo de E. coli en cuatro litros de caldo LB inoculando un mililitro de Coli y agitando a 37 grados centígrados durante 16 horas. Después de eso, lave los nematodos de los platos con un mililitro de solución de albahaca S. Transfiera de cuatro a cinco placas de nematodos a un matraz Erlenmeyer de un litro de centrífuga de medios S, centrifugar la E. coli a 650 g durante 10 minutos y retire el resus.

Después de eso, transfiera cantidades iguales de bacterias resuspendidas a cada matraz de nematodos. Coloque el matraz en un agitador orbital a temperatura ambiente a 100 a 150 RPM durante cuatro días hasta que la solución comience a aclararse, lo que indica un agotamiento de los alimentos. Una vez que se agote la comida, cultive la E. coli en cuatro cultivos de un litro de caldo durante la noche.

A continuación, centrifugar las bacterias a 650 Gs durante 10 minutos. Agregue los gránulos bacterianos a los matraces de medios S con nematodos y devuelva todos los matraces de medios S a la cámara orbital durante tres o cuatro días adicionales hasta que el alimento se agote nuevamente. Luego, transfiera una alícuota de un mililitro de solución a una placa de Petri y cuente el número de nematodos bajo un microscopio de disección.

A continuación, centrifugar los nematodos a 4.000 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, desechar la pelletza de nematodos y conservar el sobrenadante. A continuación, filtre el sobrenadante a través del papel de filtro watman número uno. Filtre aún más el sobrenadante a través de unidades de filtración al vacío estériles de 45 micrómetros.

A continuación, añada el filtrado a un vaso de precipitados de dos litros con la barra de agitación. Colóquelo en una placa de agitación caliente en una campana extractora, deje hervir mientras revuelve y evapora a aproximadamente 200 mililitros. Posteriormente, transfiera la solución a un vaso de precipitados de 500 mililitros y continúe hirviendo hasta que queden aproximadamente 50 mililitros.

Deje enfriar y centrifugue durante cinco minutos a 1000 Gs. Luego vierta la nariz en un vaso de precipitados de 100 mililitros y deseche la bolita. A continuación, hierva la nariz hasta obtener una costra marrón. Retirar del fuego y romper la corteza con la espátula Después.

Agregue suficiente etanol de 200 grados para cubrir la corteza. Cubra el vaso de precipitados con paraform y déjelo reposar toda la noche a temperatura ambiente. A continuación, vierta el etanol en un vaso de precipitados limpio y déjelo a un lado.

Agregue etanol fresco para cubrir la corteza y repita las extracciones durante la noche tres veces, seguidas de la agrupación de los extractos. Después de eso, use una bomba de vacío para secar los extractos de etanol. Si no se dispone de una bomba de vacío, añada el extracto de etanol a un vaso de precipitados limpio y caliéntelo a 50 grados centígrados mientras remueve en una campana extractora.

Luego disuelva el residuo en 10 mililitros de agua destilada estéril. Esterilizar esta solución con una jeringa de 22 micrómetros, filtrar y almacenar a menos 20 grados centígrados en un mililitro. A vatios.

En este procedimiento, pese un tubo de microcentrífuga. Agregue un mililitro de cultivo nocturno de equali al tubo y centrifugue a 17, 000 Gs. Luego retire todo el snat. Vuelva a pesar el tubo y determine el peso de la pastilla bacteriana.

A continuación, vuelva a suspender el pellet con tampón M nine para obtener una concentración final del 4% de peso por volumen. Alícuota 10 microlitros de la suspensión bacteriana en el centro de cada placa de feromonas y almacene las placas durante la noche. A temperatura ambiente.

Transfiera de 10 a 15 gravitas en hermafroditas de tipo salvaje a las placas de feromonas un día después de la edad adulta de muda. Guarde los platos a 25 grados centígrados durante tres o cuatro horas. A continuación, elimina a todos los hermafroditas adultos.

Anota el número de huevos puestos en cada plato. Selle las placas con paraform y regrese a 25 grados centígrados durante tres días antes de contar el porcentaje de hacedores. A continuación, prepare las placas de feromonas del hacedor utilizando el valor EC 90 e induzca a los hacedores con una cepa que lleve un transgén indicador IL dos integrado después de la puesta de huevos.

Retira a los hermafroditas adultos. Selle las placas con perfil e incube durante 34 horas a 25 grados centígrados el día anterior a la toma de imágenes. Hacer una solución de 10%peso por volumen agros en tampón M nueve con feromona hacedora a la concentración EC 90 alícuota.

Aproximadamente 100 microlitros de agros en un portaobjetos de microscopio, y rápida pero suavemente coloque otro portaobjetos encima para crear una superficie plana de agro Después de que los agros se hayan solidificado, separe los portaobjetos. Envuélvalos en una envoltura de saran y guárdelos en una cámara de humedad. Después del período de incubación de 34 horas, examine las placas de feromonas en busca de nematodos que hayan detenido el bombeo faríngeo.

Separe los portaobjetos de manera que solo una superficie del portaobjetos tenga aros. Transfiera uno o más nematodos a una almohadilla 10%agros con un microlitro de perlas de poliestireno de 0,1 micras y luego determine la orientación del nematodo. Capture imágenes de Zack de una dendrita IL dos Q con un aumento de 100 x con la intensidad de fluorescencia más baja posible cada 15 minutos o según sea necesario para el experimento específico.

Esta figura muestra las micrografías DIC de vista lateral derecha de C elegance durante diferentes etapas de moldeo adusto. Se trata de un animal L dos con un típico bulbo faríngeo terminal redondeado. Aproximadamente tres horas después de la muda a la dote, el bulbo terminal se encoge y la cutícula L 2D comienza a desprenderse de la cutícula de la dote recién formada.

Aproximadamente 10 horas después del inicio de la muda del hacedor, el animal ha experimentado una extensa contracción radial y desprendimiento de la cutícula L 2D. Ocasionalmente, el conducto excretor revestido de cutícula de la etapa L 2D todavía se puede ver unido a la dote en desarrollo. Aquí se muestra la micrografía epifluorescente de vista lateral de un solo animal que expresa el indicador IL dos.

Estos recuadros muestran la dendrita IL dos Q en varios puntos de tiempo después del inicio de la muda de la dote. Un rápido de las dos ramas Q de IL ocurre aproximadamente cinco horas después del inicio de la muda del doer. Al intentar purificar la feromona hacedora, es importante recordar utilizar una técnica estéril para evitar la contaminación.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo purificar y evaluar la potencia de la feromona cruda de la dote, así como el uso de esta feromona para obtener imágenes de la remodelación específica de la dote in vivo.