Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

El objetivo general de este procedimiento es investigar la proliferación y diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos en un entorno que se asemeja mucho a lo que se encuentra in vivo. Esto se logra preparando primero cultivos de cuatro rebanadas de cerebro y cerebelo de ratones transgénicos postnatales tempranos. A continuación, se obtienen imágenes de las células individuales de los trozos durante períodos de horas a días para visualizar la dinámica celular de su proliferación y diferenciación.

Después de la obtención de imágenes, se utiliza la inmunohistoquímica post hoc de las células para determinar diversas características celulares. En última instancia, los resultados pueden mostrar la dinámica de la proliferación y diferenciación celular en condiciones normales y después de la manipulación farmacológica o genética. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el carbón disociado, los cultivos de neuronas y las células de linaje de ligacitos es que los cultivos en rodajas permiten la manipulación del entorno acelular mientras se mantiene la arquitectura citográfica del tejido.

Todos los procedimientos con animales siguen las pautas y han sido aprobados por el Comité institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Connecticut al menos dos horas antes de la disección. Prepare los insertos de cultivo de tejidos en placas de seis pocillos para cada uno. Bueno, agregue un mililitro de medio de cultivo en rodajas, luego transfiera las placas a la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono al menos 15 minutos antes de la disección.

Coloque el tampón de disección en hielo y comience a burbujearlo con un 95% de oxígeno y un 5% de gas de dióxido de carbono. Asegúrese también de que todas las herramientas y el picador de tejidos estén esterilizados con etanol al 70%. Transfiera el tejido a un plato estéril de 35 milímetros que contenga tampón de disección oxigenado helado.

A continuación, con una cuchilla de afeitar, corte el cerebelo y el prosencéfalo y siga con un corte sagital a través del prosencéfalo y el cerebelo separando los hemisferios. Ahora, usando el picador manual, haga secciones coronales y sagitales de 300 micras de espesor de las cuatro cerebroninas y cerebelo. Por lo general, cada animal produce seis rodajas de cuatro cerebanadas de cerebrona y seis rodajas de cerebelo.

Lo ideal es tomar cortes que abarquen el tercio anterior del cuerpo calloso para estudiar las regiones de materia gris y blanca en el mismo corte. Transfiera las rodajas separadas a un tampón de disección fría recién burbujeado sobre hielo en el tampón, usando una pequeña espátula de disección o pesaje. Separe las secciones individuales y transfiérelas a la preincubación.

Platos de seis pocillos que contienen insertos de cultivo. Se pueden colocar de dos a tres rebanadas en un cultivo. Inserte la pipeta de cualquier exceso de tampón de disección de la superficie del cultivo.

Inserte y transfiera las placas a la incubadora hasta que estén fijas. El medio de rebanada debe reemplazarse un día después de la preparación de la rebanada, y luego cada dos días hasta la fijación de la rebanada como se indica en el protocolo. Dependiendo del experimento, use las rodajas después de cinco a siete días.

En la cultura. Use solo las rodajas que se vuelvan transparentes después de los primeros días y deseche las que tengan regiones opacas desiguales visibles a simple vista. Bajo el contraste de la cara, estas regiones opacas aparecen como un grupo de células oscuras.

Si se realiza correctamente, las regiones opacas muertas se producen en no más de uno a 5% de los cortes. Para realizar imágenes de lapso de tiempo de la proliferación y diferenciación de dos células NG, use cortes de tres a cinco días de edad de ratones que expresan EGFP en células NG dos. No permita que los portaobjetos bajen de los 37 grados centígrados durante más de 15 minutos.

Por sesión de imagen, manteniendo la placa cerrada, utilice el objetivo de 10 x de un microscopio de fluorescencia invertida para capturar imágenes por primera vez. Punto de la cultura. Imagine de cuatro a ocho ubicaciones en cada corte de las áreas de materia gris y blanca del corte.

Además, visualice puntos de referencia útiles como los bordes de las rebanadas, celdas particulares u orientación de los tractos de materia blanca con fines de reubicación. La imagen del punto de tiempo anterior se puede utilizar como imagen de referencia durante la reubicación para la división de células NG dos y la diferenciación de oligodendrocitos. Capture imágenes cada cuatro a seis horas durante idealmente cinco a siete días.

Si se utiliza el marcador inducible NG two cre, ER YFP, induzca la expresión del reportero utilizando medio de cultivo con 100 nano molares. Cuatro hidroxitamoxifeno disueltos en la actividad reportera de etanol deberían aparecer en uno o dos días. Para la fijación, agregue un mililitro de fijador en el fondo del cultivo.

Inserte y agregue otro mililitro encima de las rodajas. No rocíe el fijador directamente sobre las rodajas o pueden desprenderse. Fije el pañuelo durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y luego con un bisturí.

Corta las membranas con las rodajas unidas. Con unas pinzas, transfiera cuidadosamente las rodajas a los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos cargada con PBS. A continuación, transfiera las rodajas a una segunda placa de 24 pocillos cargada con solución de bloqueo que contenga 5% de suero de cabra normal y 0,1% de tritton X 100 en PBS.

Déjelos incubar en la solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Una vez bloqueados, mueva los cortes a una placa cargada con anticuerpo primario en PBS con 5% de NGS. Déjalos incubar durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente.

Lave las rodajas en PBS. A continuación, incubar las rodajas con anticuerpos secundarios en PBS con 5%NGS. Deje reposar la incubación durante una hora a temperatura ambiente.

Siga esto con tres lavados más en PBS como antes y monte las rodajas con la membrana hacia el portaobjetos para que no quede entre el objetivo y el tejido. Para analizar la dinámica temporal de la diferenciación de oligodendrocitos, se obtuvieron imágenes de la división celular NG dos a partir de cultivos en cortes del prosencéfalo de ratones transgénicos P eight NG two creeg durante varios días, se tomaron secuencias de lapso de tiempo durante 122 horas. El fenotipo de las células divididas se determinó con anticuerpos NG dos y CC uno.

La proliferación celular también se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica para el marcador de proliferación celular. El mapeo del cebo KI 67 de dos células NG se llevó a cabo después de la inducción de la recombinación de CRE en cortes de ratones NG dos CRE YFP. Dos días después de añadir cuatro hidroxitamoxifeno.

En los cultivos se encontraron dos células positivas que expresaban NG. Cuatro días después, una proporción de estas células se diferenció en citos de oligodendrocitos CC uno positivos. Se obtuvieron imágenes de oligodendrocitos maduros en cultivos de rodajas de cerebelo de P-L-P-D-S.

Las neuronas Perkin mielinizadas de ratones rojos estaban presentes en estos cultivos. Las imágenes repetidas mostraron que la adición de oligendrocitos mielinizantes que expresan rojo DS inmunohistoquímicamente en estos cortes mostró una expresión sustancial de la proteína básica de mielina. Finalmente, las imágenes de mayor resolución temporal revelaron cuerpos celulares de oligodendrocitos estables con algunos movimientos menores en los procesos distales.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar cultivos de cortes de los cuatro cerebros y el cerebelo, obtener imágenes repetidas de células individuales durante días u horas y analizar el destino de las células de imagen mediante inmunohistoquímica posterior al estudio. Además de la obtención de imágenes, estos cortes también permiten la manipulación del entorno celular mientras se utilizan técnicas de mapeo del destino, como la recombinación de crema inducible en un corte preparado.