Name: Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a preparar cultivos de rebanadas de cerebro y cerebelo de ratones transgénicos para estudiar la proliferación y diferenciación de células de la línea oligodendrocitaria. Este método mantiene la arquitectura tisular para análisis precisos.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (RG4179 a A.N.), los Institutos Nacionales de Salud (NIH R01NS073425 y R01NS074870 a A.N.) y la Fundación Nacional de Ciencias (A.N.). Agradecemos al Dr. Frank Kirchhoff (Universidad de Saarland, Homburg, Alemania) por proporcionar ratones transgénicos PLPDsRed. Agradecemos a Youfen Sun por su ayuda en el mantenimiento de la colonia de ratones transgénicos.

NOTA: Todos los animales procedimientos están siguiendo las directrices y han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad de Connecticut. NOTA: Para estos experimentos constitutivos NG2cre 18 (JAX # 008533) e inducibles NG2creER 16 (JAX # 008538) ratones transgénicos cruzó a Z / EG 19 (JAX # 003920) o gtRosa26: reportero YFP 20 (JAX # 006148) líneas se utilizaron respectivamente a imagen células NG2 y su progenie. Para imagen oligodendrocitos maduros, se utilizaron ratones transgénicos PLPDsRed 21. Para la supervivencia consistente, rebanadas pueden ser aislados de los ratones hasta el día postnatal 10 tanto desde el cerebro anterior y el cerebelo. 1. Preparación rebanada <ol><li> En una campana de cultivo, colocar insertos de cultivo de tejidos en placas de seis pocillos y se añade 1 ml de medio de cultivo de cortes (receta en la sección reactivos). Poner las placas en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C con 5% de CO 2 al menos 2 horas antes de la disección. </li><li> Esterilizar todas las herramientas y cortador de tejidos con etanol al 70%. </li><li> Tampón de disección de la burbuja (receta en la sección reactivos) con 95% de O 2, 5% de CO 2 en hielo durante al menos 15 min antes del inicio de la disección. </li><li> Anestesiar crías de ratón, colocándolos en hielo durante 5 a 10 min de acuerdo con los protocolos de los animales aprobados. Determinar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la confirmación de que los ratones no responden a la cola y de pellizco del dedo del pie. </li><li> Decapita animales utilizando tijeras afiladas siguientes protocolos de animales. Quite rápidamente el cráneo sobre el cerebro anterior y el cerebelo, haciendo primero un corte sagital seguida de incisión lateral, utilizando herramientas esterilizadas. Cortar los nervios craneales desde la superficie ventral del cerebro y el cerebelo enrollando cuidadosamente el tejido a un lado. </li><li> Coloque el tejido en una placa de 35 mm que contiene tampón de disección estéril oxigenada enfriado con hielo. </li><li> Utilizando una hoja de afeitar, cortar el cerebelo y el cerebro anterior. A continuación, hacer un corte sagital medial throuf el cerebro anterior y el cerebelo, la separación de los hemisferios. </li><li> Cortar 300 micras de espesor secciones coronal y sagital del cerebro anterior y el cerebelo con un cortador de tejidos manual. NOTA: Un cortador de tejidos manual permite un rápido procesamiento de la disección de la incubación de cultivo sin la necesidad de incrustación de agarosa. Un vibratome también se puede utilizar como se describió anteriormente 9. </li><li> Transferir las rebanadas separadas en tampón de disección en frío recién burbujeó en hielo. </li><li> Utilice pequeña disección o con un peso espátulas para separar secciones individuales y transferirlos a preincubada seis pocillos con insertos de cultivo. </li><li> Eliminar cualquier exceso de tampón de la disección de la superficie de la pieza de inserción de cultivo utilizando una pipeta de transferencia desechable o una punta de pipeta P 200. De dos a tres prosencéfalo o tres rebanadas cerebelosas se puede colocar en un inserto de cultivo. NOTA: Para obtener resultados consistentes con las culturas del cerebro anterior, que es ideal para las rebanadas que abarca el tercio anterior del cuerpo calloso(Figura 1 A) con el fin de estudiar ambas regiones de materia gris y blanca en el mismo segmento. Cada animal por lo general rinde 6 rebanadas del cerebro anterior y 6 rebanadas cerebelo. </li><li> Coloque las placas de seis pocillos en la incubadora y reemplazar el medio rebanada con 1 ml de medio rebanada 1 día después de la preparación rebanada y luego cada dos días hasta que la fijación de la rebanada. </li><li> Dependiendo del experimento, utilizar rebanadas después de 5-7 días en cultivo. Utilice únicamente las rebanadas que se convierten en transparentes después de los primeros días y descartar aquellas que tienen regiones opacas irregulares. NOTA: las regiones opacas dentro de rebanadas son visibles a simple vista y aparecen como un grupo de células oscuros bajo contraste de fase. Después de la técnica se ha dominado, rebanadas opacos muertas ocurren rara vez, en menos de 5.1% de las rebanadas. </li></ol> 2. Time-lapse de imágenes de la división de células NG2 y Oligodendrocyte Diferenciación NOTA: Para realizar la proyección de imagen de lapso de tiempo de la proliferación celular y la diferenciación NG2 utilizamos NG2cre: ratones ZEG 16que expresan EGFP en células NG2 y su progenie (Figura 1C-E). Expresión reportero en esta línea es suficientemente robusto para obtener imágenes en directo de las buenas prácticas agrarias + células en rodajas inmediatamente después de la sección por un período de tiempo de al menos cuatro semanas. Las imágenes más claras se obtienen después del período de adelgazamiento inicial de la rebanada, que se produce durante los primeros 3-5 días en cultivo. <ol><li> Durante todo el experimento, mantener las rodajas en un incubador de cultivo celular a 37 ° C y retirar sólo durante breves períodos de tiempo (menos de 15 min por rebanada), manteniendo la tapa en la placa de seis pocillos mientras que las imágenes. </li><li> El uso de un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una cámara digital, la captura de imágenes en el primer punto de tiempo utilizando un objetivo de 10X. NOTA: los puntos de primera vez pueden variar por el experimento y puede ser el día en que se prepararon los cortes o cualquier punto de tiempo después. </li><li> Capturar imágenes desde múltiples regiones en el punto de una vez en las dos áreas de materia gris y blanca de la división. Nota ªe región fotografiada por puntos de referencia específicos dentro de la rebanada y mediante la asignación de la ubicación de la imagen en un esquema que puede ser utilizado para las sesiones de formación de imágenes subsiguientes. Puntos de referencia útiles pueden incluir bordes de las rebanadas y / o la orientación de tractos de sustancia blanca. Image siete y cincuenta y seis ubicaciones en cada rebanada en cada punto de tiempo. </li><li> Capturar las imágenes siguientes en un intervalo de 4-6 horas si el examen de la división celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2, idealmente más de 5-7 días. </li><li> Capturar una imagen final de todas las regiones y fijar las rebanadas de inmediato. Añadir 1 ml de fijador (4% PFA con 0,1 M de L-lisina 0,01 M metaperyodato de sodio) a la parte inferior de la inserción del cultivo, a continuación, añadir otros 1 ml en la parte superior de las rebanadas. Tenga cuidado de no rociar el fijador directamente en el segmento, ya que puede desprenderse de la membrana. Fijar el tejido durante 30 minutos y proceder con inmunohistoquímica utilizando marcadores específicos de la etapa de desarrollo, como se describe en la sección 4. </li><li> Rodajas de lavado con tampón fosfato sódico 0,2 M 3 x 10 m. Si es necesario, rebanadas almacena a 4 º C en tampón de fosfato de sodio 0,2 M durante 1-3 días antes de la inmunotinción pero lo ideal es realizar la tinción dentro de las 24 horas. Proceda con la inmunohistoquímica, como se describe a continuación en la sección 4 para determinar la proporción de células que se han diferenciado en oligodendrocitos (Figura 2D-F). </li></ol> 3. Destino Cartografía de la progenie de células NG2 Utilizando ratones Inducible Periodista transgénicos en cultivos de corte NOTA: Para realizar el seguimiento del destino de las células NG2 desde un punto de tiempo particular en la cultura, NG2creER inducibles: se pueden usar ratones transgénicos YFP. <ol><li> Inducir Cre recombinación y expresión del indicador mediante la adición de 100 nM 4OHT disuelto en etanol al medio de cultivo. NOTA: células positivas Reporter deben aparecer dentro de 1-2 días con una eficiencia de inducción de ~ 20-25% YFP células NG2 + + / + NG2 y en este punto el tiempo todo será células en la etapa de células NG2 (Figura 2A-C) </li><li> Fijar y lavar la rebanadas en diferentes puntos temporales después de varias manipulaciones (descritos en las secciones 2.5 y 2.6). </li></ol> 4. rebanada inmunohistoquímica <ol><li> Cortar las membranas con las rodajas de adjuntos de los insertos utilizando un bisturí. </li><li> Transferir las rebanadas a pocillos individuales de una placa de 24 solución salina tamponada que contiene bien fosfato (PBS) usando un conjunto de pinzas, teniendo cuidado de no alterar la composición de la rebanada al momento de retirar la membrana. </li><li> Transferencia de las rebanadas a una placa de 24 pocillos con solución de bloqueo que contenía 5% de suero normal de cabra (NGS) y 0,1% de Triton-X100 en PBS durante 1 hr. </li><li> Incubar las rebanadas en anticuerpo primario O / N en un 5% en NGS en PBS a 4 ° C. Para identificar las células en la etapa de células NG2, utilizar anticuerpos contra NG2 y PDGFR. Para la identificación de los oligodendrocitos diferenciados, utilizar un anticuerpo para el antígeno de la poliposis coli adenomatosa (APC; CC1 clon). </li><li> En el segundo día de las rebanadas de lavado en PBS 3 x15 min, luego se incuban en Antibo secundariamuere en 5% de NGS en PBS durante 1 hora a TA. Lávese las rebanadas en PBS 3 x15 min y montar en portaobjetos. Montar con rodajas de arriba y de membrana que se enfrenta la diapositiva para que la membrana no será entre el objetivo y el tejido. </li></ol>

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<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos

La mielinización en el sistema nervioso central es esencial para la comunicación eficiente neuronal y la supervivencia axonal 22. Células NG2 generan continuamente oligodendrocitos myelinating en la edad adulta, mientras que el mantenimiento de una población residente en la mayoría de las regiones del cerebro 16,23 - 25. Algunos de los mecanismos genéticos y moleculares que regulan la diferenciación de estas células han sido descritas, pero mucho queda por descubrir. Cultivos de cortes organotípico...

Cultivos de corte Organoytpic del sistema nervioso central han demostrado ser de gran utilidad para el estudio de las neuronas y la biología de las células gliales en un sistema semiintact 1-4. Estos cultivos son relativamente fáciles de adoptar y mantener muchos beneficios de los cultivos de células disociadas primarios tales como la manipulación del ambiente extracelular y fácil acceso para imágenes de células vivas repetida a largo plazo y los registros electrofisiológicos 5-9. Además, cultivos de cortes de tejido mantienen citoarquitectura 3-dimensional, la conectividad neuronal regional, y la mayoría de tipos de células principales están presentes en el sistema. Estas propiedades hacen que estas culturas un sistema único y conveniente para investigar el comportamiento de una sola célula y fisiología con las interacciones celulares y ambientales. NG2 células son una población de células gliales en el sistema nervioso central de los mamíferos que continúan proliferando y generar myelinating oligodendrocitos durante el desarrollo embrionario y postnatal 10. Se han estudiado extensivamente en cultivos celulares primarios disociados, y reciente desarrollo de líneas de ratones transgénicos con NG2 expresión específica de célula de proteínas fluorescentes ha facilitado suerte de cartografía vivo y registros electrofisiológicos en preparaciones rebanada agudas en. Incluso con estos estudios, se sabe poco sobre la dinámica temporal de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2. Aunque el cultivo de células disociada es ampliamente utilizado para la instalación relativa en las manipulaciones farmacológicas y genéticas, que no es adecuado para interrogar a diferencias funcionales de estas células en diferentes regiones del cerebro en particular cuando es deseable mantener el contexto de la microambiente celular. Cultivos de cortes proporcionan una alternativa simple que es susceptible de manipulaciones farmacológicas y se han utilizado para investigar la mielinización de oligodendrocitos 11,12, célulaular respuesta después de lisolecitina (LPC) o el anticuerpo induce desmielinización 13,14, y la inducción de remielinización mediante tratamiento farmacológico 15. Un método para investigar y realizar imágenes en vivo y tejido fijado (o post-fijación) análisis de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2 en cultivos de cortes organotípicos tomadas tanto desde el cerebro anterior y el cerebelo se describe. Este es un poderoso método que se puede utilizar para estudiar el destino celular de las células individuales NG2 después de la división 16 y para descubrir diferencias de región y dependientes de la edad en el factor de crecimiento inducido por la proliferación de células NG2 17. Esta técnica es relativamente simple ampliamente accesible a investigar más a fondo celular intrínseco y / o ambiental mecanismos que regulan la fisiología de estas células gliales y su respuesta a la actividad neuronal o daño de mielina.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Slice Culture Medium</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank' s Solución Salina Equilibrada</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0.4mM</td></tr><tr><td>Hiclón</td> de<td>Suero de Caballo</td><td>SH30074.03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">Valoración a pH 7.22 con NaOH, filtro con filtro en la parte superior de la botella y almacenamiento a 4 grados Celsius</td></tr><tr><td colspan="4">tampón de disección</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (anhidro)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>ascórbicoSigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">Filtro con tapa de botella filtrar y almacenar a 4 grados Celsius, oxigenar con 95%O2 5%CO2 antes de usar</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Otros reactivos y suministros</fuerte></td></tr><tr><td>4-hidroxi tamoxifeno (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0.1M</td></tr><tr><td>Metaperiodato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0.01M</td></tr><tr><td>Conejo anticuerpo anti NG2</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti CC1 de ratón</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti Ki67 para ratones</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti NeuN para ratones</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios específicos de especies</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td></td><td></td><td>5%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Medio de montaje con insertos de membrana de cultivo DAPI</td><td>Vector</td><td>Labs H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Millicell 0.45&mu; m Tamaño de poro</td><td>Fisher Scientific</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de tapa de botella</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td> mezcla de gases <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas estériles de seis pocillos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Espátulas <td></td><td></td><td></td>de <td>disección (hipocampo) o pesaje</td></tr><tr><td>Picadora</td><td></td><td></td><td></td>de tejidos manual o automática</tr><tr><td>Hojas de</td><td></td><td></td><td></td>afeitar</tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables Placas</td> de Petri estériles de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm y 60 mm</td> Microscopio estereoscópico Fase invertida <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>de cultivo</tr><tr><td>de tejidos Microscopio</td><td></td><td></td><td></td> de fluorescencia invertida</tr></tbody></table>

culturas organotípicos slice para estudiar oligodendrocyte dinámica y mielinización

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Células que expresan NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrocitos) son la cuarta población de células gliales importante en el sistema nervioso central. Durante el desarrollo embrionario y postnatal proliferan activamente y generar oligodendrocitos myelinating. Estas células han sido comúnmente estudiado en cultivos primarios de neuronas disociadas, cocultivos, y en tejido fijado. Uso de líneas de ratones transgénicos recientemente disponibles cortan sistemas de cultivo pueden usarse para investigar la proliferación y diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos en ambas regiones de materia gris y blanca del cerebro anterior y el cerebelo. Cultivos de corte se preparan a partir de ratones postnatales tempranas y se mantienen en cultivo hasta por 1 mes. Estos cortes se pueden visualizar varias veces durante el período de cultivo para investigar el comportamiento celular y las interacciones. Este método permite la visualización de la división celular NG2 y los pasos que conducen a la diferenciación de oligodendrocitos al tiempo que permite un análisis detallado de la región-dependenent células NG2 y la heterogeneidad funcional de oligodendrocitos. Esta es una técnica poderosa que se puede utilizar para investigar las señales intrínsecos y extrínsecos que influyen en estas células a través del tiempo en un entorno celular que se asemeja mucho a la que se encuentra in vivo.

Se dan ejemplos de datos representativos a continuación que se han obtenido usando cultivos de corte tanto del cerebro anterior y el cerebelo de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP y PLPDsRed líneas de ratones transgénicos. NG2 células se pueden obtener imágenes en día en prosencéfalo y cerebelo rebanadas (Figura 1B-D, video 1) y el fenotipo de estas células se puede determinar después de la fijación y la inmunotinción con anticuerpos CC1 y NG2 (Figura 1E). Además de imágenes en directo, la p...

Se describe una técnica para estudiar las células NG2 y los oligodendrocitos utilizando un sistema de cultivo en cortes del prosencéfalo y el cerebelo. Este método permite examinar la dinámica de proliferación y diferenciación de las células dentro del linaje de oligodendrocitos, donde el entorno extracelular puede manipularse fácilmente mientras se mantiene la citoarquitectura tisular.

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar la proliferación y diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos en un entorno que se asemeja mucho a lo que se encuentra in vivo. Esto se logra preparando primero cultivos de cuatro rebanadas de cerebro y cerebelo de ratones transgénicos postnatales tempranos. A continuación, se obtienen imágenes de las células individuales de los trozos durante períodos de horas a días para visualizar la dinámica celular de su proliferación y diferenciación.Después de la obtención de imágenes, se utiliza la inmunohistoquímica post hoc de las células para determinar diversas características celulares. En última instancia, los resultados pueden mostrar la dinámica de la proliferación y diferenciación celular en condiciones normales y después de la manipulación farmacológica o genética. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el carbón disociado, los cultivos de neuronas y las células de linaje de ligacitos es que los cultivos en rodajas permiten la manipulación del entorno acelular mientras se mantiene la arquitectura citográfica del tejido.Todos los procedimientos con animales siguen las pautas y han sido aprobados por el Comité institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Connecticut al menos dos horas antes de la disección. Prepare los insertos de cultivo de tejidos en placas de seis pocillos para cada uno. Bueno, agregue un mililitro de medio de cultivo en rodajas, luego transfiera las placas a la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono al menos 15 minutos antes de la disección.Coloque el tampón de disección en hielo y comience a burbujearlo con un 95% de oxígeno y un 5% de gas de dióxido de carbono. Asegúrese también de que todas las herramientas y el picador de tejidos estén esterilizados con etanol al 70%. Transfiera el tejido a un plato estéril de 35 milímetros que contenga tampón de disección oxigenado helado.A continuación, con una cuchilla de afeitar, corte el cerebelo y el prosencéfalo y siga con un corte sagital a través del prosencéfalo y el cerebelo separando los hemisferios. Ahora, usando el picador manual, haga secciones coronales y sagitales de 300 micras de espesor de las cuatro cerebroninas y cerebelo. Por lo general, cada animal produce seis rodajas de cuatro cerebanadas de cerebrona y seis rodajas de cerebelo.Lo ideal es tomar cortes que abarquen el tercio anterior del cuerpo calloso para estudiar las regiones de materia gris y blanca en el mismo corte. Transfiera las rodajas separadas a un tampón de disección fría recién burbujeado sobre hielo en el tampón, usando una pequeña espátula de disección o pesaje. Separe las secciones individuales y transfiérelas a la preincubación.Platos de seis pocillos que contienen insertos de cultivo. Se pueden colocar de dos a tres rebanadas en un cultivo. Inserte la pipeta de cualquier exceso de tampón de disección de la superficie del cultivo.Inserte y transfiera las placas a la incubadora hasta que estén fijas. El medio de rebanada debe reemplazarse un día después de la preparación de la rebanada, y luego cada dos días hasta la fijación de la rebanada como se indica en el protocolo. Dependiendo del experimento, use las rodajas después de cinco a siete días.En la cultura. Use solo las rodajas que se vuelvan transparentes después de los primeros días y deseche las que tengan regiones opacas desiguales visibles a simple vista. Bajo el contraste de la cara, estas regiones opacas aparecen como un grupo de células oscuras.Si se realiza correctamente, las regiones opacas muertas se producen en no más de uno a 5% de los cortes. Para realizar imágenes de lapso de tiempo de la proliferación y diferenciación de dos células NG, use cortes de tres a cinco días de edad de ratones que expresan EGFP en células NG dos. No permita que los portaobjetos bajen de los 37 grados centígrados durante más de 15 minutos.Por sesión de imagen, manteniendo la placa cerrada, utilice el objetivo de 10 x de un microscopio de fluorescencia invertida para capturar imágenes por primera vez. Punto de la cultura. Imagine de cuatro a ocho ubicaciones en cada corte de las áreas de materia gris y blanca del corte.Además, visualice puntos de referencia útiles como los bordes de las rebanadas, celdas particulares u orientación de los tractos de materia blanca con fines de reubicación. La imagen del punto de tiempo anterior se puede utilizar como imagen de referencia durante la reubicación para la división de células NG dos y la diferenciación de oligodendrocitos. Capture imágenes cada cuatro a seis horas durante idealmente cinco a siete días.Si se utiliza el marcador inducible NG two cre, ER YFP, induzca la expresión del reportero utilizando medio de cultivo con 100 nano molares. Cuatro hidroxitamoxifeno disueltos en la actividad reportera de etanol deberían aparecer en uno o dos días. Para la fijación, agregue un mililitro de fijador en el fondo del cultivo.Inserte y agregue otro mililitro encima de las rodajas. No rocíe el fijador directamente sobre las rodajas o pueden desprenderse. Fije el pañuelo durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y luego con un bisturí.Corta las membranas con las rodajas unidas. Con unas pinzas, transfiera cuidadosamente las rodajas a los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos cargada con PBS. A continuación, transfiera las rodajas a una segunda placa de 24 pocillos cargada con solución de bloqueo que contenga 5% de suero de cabra normal y 0,1% de tritton X 100 en PBS.Déjelos incubar en la solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Una vez bloqueados, mueva los cortes a una placa cargada con anticuerpo primario en PBS con 5% de NGS. Déjalos incubar durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente.Lave las rodajas en PBS. A continuación, incubar las rodajas con anticuerpos secundarios en PBS con 5%NGS. Deje reposar la incubación durante una hora a temperatura ambiente.Siga esto con tres lavados más en PBS como antes y monte las rodajas con la membrana hacia el portaobjetos para que no quede entre el objetivo y el tejido. Para analizar la dinámica temporal de la diferenciación de oligodendrocitos, se obtuvieron imágenes de la división celular NG dos a partir de cultivos en cortes del prosencéfalo de ratones transgénicos P eight NG two creeg durante varios días, se tomaron secuencias de lapso de tiempo durante 122 horas. El fenotipo de las células divididas se determinó con anticuerpos NG dos y CC uno.La proliferación celular también se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica para el marcador de proliferación celular. El mapeo del cebo KI 67 de dos células NG se llevó a cabo después de la inducción de la recombinación de CRE en cortes de ratones NG dos CRE YFP. Dos días después de añadir cuatro hidroxitamoxifeno.En los cultivos se encontraron dos células positivas que expresaban NG. Cuatro días después, una proporción de estas células se diferenció en citos de oligodendrocitos CC uno positivos. Se obtuvieron imágenes de oligodendrocitos maduros en cultivos de rodajas de cerebelo de P-L-P-D-S.Las neuronas Perkin mielinizadas de ratones rojos estaban presentes en estos cultivos. Las imágenes repetidas mostraron que la adición de oligendrocitos mielinizantes que expresan rojo DS inmunohistoquímicamente en estos cortes mostró una expresión sustancial de la proteína básica de mielina. Finalmente, las imágenes de mayor resolución temporal revelaron cuerpos celulares de oligodendrocitos estables con algunos movimientos menores en los procesos distales.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar cultivos de cortes de los cuatro cerebros y el cerebelo, obtener imágenes repetidas de células individuales durante días u horas y analizar el destino de las células de imagen mediante inmunohistoquímica posterior al estudio. Además de la obtención de imágenes, estos cortes también permiten la manipulación del entorno celular mientras se utilizan técnicas de mapeo del destino, como la recombinación de crema inducible en un corte preparado.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este es un protocolo para preparar y mantener una rebanada preparación neocortical en la cultura organotípicos con el propósito de realizar grabaciones eléctricas de las neuronas piramidales.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Este video muestra una técnica ex vivo para inducir la muerte de células cerebrales mediada por células T CD8+ citotóxicas. Al obtener cortes de cerebro, las células T CD8+ dirigidas a oligodendrocitos activados se transfieren a los cortes para dirigirse a la vaina de mielina y a los oligodendrocitos. Después de la incubación, el daño a la mielina y la muerte neuronal se pueden evaluar histológicamente en las regiones de interés.

Una técnica ex vivo para inducir la muerte neuronal a través de linfocitos T CD8+ específicos de oligodendrocitos

Fuente: Kennedy, L. H., et. al. Visualización e imagen en vivo de orgánulos de oligodendrocitos en cortes de cerebro organotípicos utilizando virus adenoasociados y microscopía confocal. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra la imagen de las mitocondrias de oligodendrocitos en cortes de cerebro de ratón organotípicos. La loncha se coloca dentro de una cámara de baño con circulación continua de fluido y temperatura controlada. Después de configurar varios parámetros del microscopio confocal, se...

Imágenes confocales del movimiento mitocondrial dentro de los oligodendrocitos en cultivos organotípicos de cortes de cerebro

Para abordar los mecanismos de desmielinización y apoptosis neuronal en lesiones corticales de trastornos inflamatorios desmielinizantes, se utilizan diferentes modelos animales. Aquí describimos un enfoque ex vivo mediante el uso de células T CD8+ específicas de oligodendrocitos en cortes de cerebro, lo que resulta en la muerte oligodendroglial y neuronal. Se discuten las posibles aplicaciones y limitaciones del modelo.

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Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método permite la manipulación in vitro de la neurogénesis adulta y permite la aplicación directa de agentes farmacológicos para el hipocampo cultivadas.

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