Name: Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprende a analizar glicanos O-unidos mediante eliminación beta reductora en gel y permetilación, seguido de espectrometría de masas en tándem. Este método optimizado permite la caracterización completa de glicanos sulfatados y neutros.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por la P01HL107151 de subvención del NHLBI/NIH. Los autores también agradecen el apoyo y el acceso a la instrumentación proporcionados a través de P41GM103490 de subvenciones del NIGMS/NIH.

NOTA: Las preocupaciones de seguridad de laboratorio En consonancia con las mejores prácticas de laboratorio estándar, observar lo siguiente. Guarde todos los disolventes orgánicos en lugares apropiados. Mantenga todos los materiales de desecho en contenedores de residuos químicos con un etiquetado claro de composiciones químicas. Como varios reactivos utilizados en estos protocolos son carcinógenos potenciales o generar gases combustibles volátiles, manejar todos los reactivos en una campana de humos con ventilación. Use el equipo de protección personal como guantes, bata de laboratorio y protección para los ojos cuando se trabaja con disolventes orgánicos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px"> Figura 1. Procedimiento para la en-gel juntas glycomics. (A) Las proteínas de interés se resuelven por SDS-PAGE, detectado por los procedimientos de tinción apropiados (Coomassie o plata), y extirpados. Piezas de gel extirpados se cortan en rodajasen cubos pequeños, se destiñó, y se lavó con acetato de etilo para reducir los contaminantes que interfieren con el análisis MS subsiguiente. Una porción de la porción de gel puede ser reservado para in-gel digestión tríptica y la posterior caracterización proteómica por LC-MS / MS. (B) glicanos O-ligados se liberan de las glicoproteínas resueltos por en-gel reductivo β-eliminación. Pasos esenciales incluyen la desalinización y eliminación de borato por azeótropo con metanol. (C) glicanos liberados por β-eliminación reductora unida a O se permetilado y posteriormente dividido en fases acuosa y orgánica. Sulfoglycans se recuperan cuantitativamente en la fase superior (acuosa), mientras que los glicanos neutros y sialiladas partición en la (DCM) capa inferior. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px"> Figura 2. Detalle de diagrama de flujo para glycomics en gel. Cada experimentalmenteTal paso se muestra en la Figura 1 se ilustra de forma individual. (A) destaining gel y extracción de EtOAc, (B) dirigir en gel reductivo β-eliminación de la liberación de glicanos O-ligados, y (C) permetilación y fase de partición. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.</a> Gel 1. La escisión y eliminación de contaminantes derivados de Gel <ol><li> Antes de iniciar el procedimiento, preparar los productos químicos y reactivos en la Lista de Materiales. </li><li> Resolver la proteína en gel de SDS-PAGE utilizando sistemas de tampón Tris-glicina estándar. Manchas resuelto proteínas, ya sea con azul brillante de Coomassie o plata a las manchas. En general, la recuperación de los glicanos O-ligados de geles teñidos con plata es de aproximadamente el 80-90% de la recuperación alcanzado teñido con Coomassie de geles. </li><li> Después de la electroforesis, colocar el gel en una placa de vidrio y especial tél región de interés con un bisturí limpio o cuchilla de afeitar. </li><li> Para aumentar el rendimiento de O-glicanos, transferir la banda de gel de interés sobre otra placa de vidrio y cortar la pieza de gel extirpado en cubos de aproximadamente 2 mm. Evite hacer piezas de gel de menos de 1 mm cubos porque la recuperación de glicanos se reduce. Transfiera las pequeñas piezas de gel en un tubo de vidrio con tapa de rosca (13 x 100 mm) con un microespátula acero inoxidable. </li><li> Añadir 1 ml de bicarbonato de amonio 25 mM (Ambic, NH 4 HCO 3) en el tubo de la muestra, la tapa del tubo de vidrio con una tapa superior del tornillo revestido de teflón, y mezcle suavemente con un movimiento rápido del tubo antes de dejar reposar durante 10 minutos. No emplear agitación vigorosa para evitar la rasgadura de las piezas de gel. </li><li> Retire con cuidado Ambic desde el tubo de vidrio utilizando una pipeta de vidrio o una pipeta Pasteur equipado con una punta de plástico extra-largo. Evite aplastar y transferir las pequeñas piezas de gel mientras se quita la solución Ambic. </li><li> Añadir 1 ml de acetonitrilo (ACN) a latubo de vidrio, tapa, y mezcle suavemente con un movimiento rápido de tubo antes de dejar reposar durante 10 min. Asegúrese de que las piezas de gel están completamente cubiertos con disolvente. Si es necesario, empuje piezas de gel fuera de la pared del tubo y en solvente con punta de la pipeta. </li><li> Pipeta de ACN desde el tubo de vidrio y repita los pasos 1.5 a 1.7 hasta que el color azul brillante es eliminado. Repetir un mínimo de cinco lavados secuenciales Ambic / ACN, si es necesario. Para geles teñidos con plata, utilizar un kit destain. Proceda al siguiente paso cuando la pieza se convierte en gel, mientras que de manera uniforme blanco en ACN. </li><li> Pipetear con agua cualquier líquido del tubo de vidrio, vuelva a tapar el tubo, añadir 1 ml de Ambic y dejar reposar durante 5 minutos. </li><li> Retire Ambic y añadir 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) para el tubo de vidrio. Recapitulación con tubo de teflón alineados tapa y lugar a 4 ° C durante la noche con agitación de extremo a extremo o, alternativamente, realizar tres lavados de EtOAc a temperatura ambiente durante 30 min cada uno. Cuanto más tiempo el lavado EtOAc, más eficiente la eliminación de contaminantes. </li><li> Quitarla final EtOAc lavar y realizar tres lavados cada uno con 2 ml de H 2 O. La eliminación completa de EtOAc se asegurará de una reacción de β-eliminación reductora robusto. </li><li> Pipetear off H 2 O y deshidratar el gel por lavado una vez con 1 ml de ACN. NOTA: Después del secado, los geles están listos para deshidratados en gel β-eliminación. Piezas de gel deshidratados se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Detener el proceso de lavado en cualquier paso y almacenar las piezas de gel a 4 ° C durante la noche, independientemente de qué tampón o solución se aplica a la gel (Ambic, ACN, H 2 O). Reinicie la preparación de muestras en cualquier momento dentro de los próximos 2 días. </li><li> Use una parte de las piezas de gel destained y deshidratados para Identificación de proteínas mediante enfoques proteómicos estándar. </li></ol> 2. En-gel Release-O glicanos por β-eliminación reductiva <ol><li> Preparar una solución madre de 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando 50% de NaOH o sólido tienda de NaOH y a 4 ° C hasta su uso. <ol> Tomar 5,2 ml de NaOH al 50% (o 4 g de NaOH sólido) y ajustar el volumen a 100 ml para hacer 1 M solución de NaOH. Diluir la solución madre 1 M NaOH a 100 mM NaOH, que se puede almacenar a 4 ° C hasta 6 meses sin pérdida de eficiencia en las reacciones de β-eliminación reductora. </ol></li></ol><li> Hacer 2 M borohidruro de sodio (NaBH4) en NaOH 100 mM. Disolver 38 mg de NaBH4 en 0,5 ml de NaOH 100 mM. Generalmente, se utiliza 0,5-1,0 ml de la solución de borohidruro para cada muestra. Variar el volumen de la solución de reacción de la cantidad de piezas de gel secos preparados en la etapa 1. espera utilizar 0,5 ml de solución de borohidruro de 1-2 piezas de gel extirpados (paso 1.3). </li><li> Añadir 500 l de NaOH 100 mM a las piezas de gel deshidratados y dejar reposar durante 3-5 min en hielo con el fin de equilibrar el gel a las condiciones básicas que mejoran la recuperación de glicano. </li><li> Añadir 500 l de 2 M NaBH4 en NaOH 100 mM, resultando en concentraciones finales de 1 M NaBH <li> Durante la primera hora de incubación, mezclar suavemente el tubo cada 15 min. Evitar fuerte agitación, ya que puede fragmentar las piezas de gel. Realizar la reacción en una incubadora / horno bien equilibrada, o en un bloque de calentamiento. Asegúrese de que las piezas de gel se cubren con solución de reacción. </li></li><li> Detener la reacción mediante la eliminación del tubo de muestra de la incubadora o bloque de calentamiento y colocándola en hielo. NOTA: Después de permitir que la reacción de β-eliminación de proceder durante 18 horas, el proceso de desalación debe ser realizado en el mismo día. </li> 3. La desalación en Cromatografía de intercambio catiónico <ol><li> Mientras se mantiene el tubo de muestra en hielo para evitar la formación de calor excesivo, añadir lentamente 10% de ácido acético (AcOH) gota a gota para neutralizar la base. Vórtice suavemente el tubo de la muestra entre las adiciones de AcOH. Tenga cuidado al añadir ácido lentamente y gota a gota como el additien de ácido producirá un "volcán" de burbujas. Centrifugar el tubo para eliminar las burbujas y evitar desbordamiento, si es necesario. <ol><li> Con el fin de eliminar la gran cantidad de sodio en la mezcla de reacción, pasar la mezcla de reacción a través de una columna de intercambio catiónico pequeña (o resina Dowex AG-50W-X8, forma H +). </li><li> Lavar la resina de intercambio de cationes con 1 M de NaOH y HCl 1 M antes de su uso con el fin de eliminar los contaminantes que interfieren con el análisis MS, incluso si la resina es de grado analítico. </li><li> Remoje la resina en NaOH 1 M y eliminar la solución por decantación. Añadir ionizada des agua, eliminar el agua, luego añadir HCl 1 M. </li></ol></li><li> Repita estos pasos hasta que la solución por encima de la resina es incoloro. Lavar la resina limpiado con agua destilada y almacenar en un 5% AcOH a 4 ° C. </li><li> Para hacer un pequeño vaso columna, cero y romper la punta de una pipeta de vidrio Pasteur utilizando un cortador de cerámica de manera que el cono de la punta de la pipeta es de aproximadamente 1 cm de largo. Desmenuzar un tapón de lana de vidrio y empujar hacia la punta que forma un soporte para el lecho de resina. Asegure la columna de la pipeta con una abrazadera o pinza de la ropa y el lugar en un tubo de ensayo de vidrio. </li><li> Lavar la pipeta de vacío con 1 ml de metanol (MeOH) y 3 ml de 5% de AcOH. Swirl H + Dowex AG50 o de intercambio catiónico suspensión de resina almacenan en 5% de AcOH y transferir suficiente de la suspensión para producir un volumen de lecho de 1 ml en la columna de la pipeta Pasteur. </li><li> Enjuague la columna usando cinco volúmenes de 5% AcOH. Compruebe el flujo a través de la aparición de partículas de resina y no utilice la columna si se detecta resina. </li><li> Coloque la columna en un nuevo tubo de vidrio con tapa de rosca (16 x 125 mm) y la muestra de carga. Recoger el flujo a través de glicanos y eluir con al menos 3 volúmenes de 5% de AcOH en el mismo tubo. </li><li> Cubra el tubo con Parafilm y hacer pequeños agujeros con una aguja. Colocar el tubo de la muestra a -80 ° C o en hielo seco. Una vez congelado, secar la muestra por liofilización. Guarde el material seco a -20 °C hasta su uso. </li></ol> 4. La eliminación de borato <ol><li> Preparar 10% de AcOH en MeOH. Tomar 10 ml de ácido acético glacial y ajustar el volumen a 100 ml con metanol. Guarde este reactivo en un frasco de vidrio con tapa de teflón forrado para un máximo de 6 meses. </li><li> Añadir 300 l de AcOH al 10% en MeOH al, tubo de muestra liofilizada se secó y se vórtice. Retire el borato de trimetilo resultante por evaporación bajo una corriente de N 2. NOTA: La mezcla de sales de borato con metanol bajo condiciones ácidas produce borato de trimetilo que es un compuesto volátil. </li><li> Seco en N2 corriente a 37 ° C. Después del secado, añadir otra alícuota de AcOH en MeOH como se describe en el paso 4.2. Seque el líquido durante 5 min en atmósfera de nitrógeno (N 2) flujo a 37 ° C. <ol><li> Repita la resuspensión y secado al menos 3 veces. Almacenar el material seco a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li></ol> 5. C18 Limpieza <ol><li> Equilibrar una columna de cartucho C18(Tamaño de 1 ml, 100 mg de resina) con tres volúmenes de ACN y cinco volúmenes de 5% AcOH. Acelerar el paso de las soluciones equilibrantes por aplicación de presión positiva de aire suave. </li><li> Añadir 500 l de 5% de AcOH al tubo de muestra desalada y borato libre y disolver por vórtice. </li><li> Cargar muestra resuspendida en la columna C18 equilibrada y recoger el flujo a través de en un tubo de tapón de rosca de vidrio (13 x 100 mm). Eluir O-glicanos con 3 ml de 5% de AcOH en el mismo tubo. </li><li> Parafilm el tubo, hacer pequeños agujeros con una aguja pequeña o utilice la tapa de PTFE forrado débilmente cerrado para cubrir el tubo, y congelar la muestra a -80 ° C o en hielo seco. Eliminar el disolvente por liofilización. Almacenar la muestra desecada a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 6. Preparación de la base para permetilación NOTA: Con el fin de lograr robusta permetilación, preparar NaOH fresco lodo. Toda la cristalería utilizado para las reacciones permetilación debe limpiarse exhaustivamente. <ol><li> Para preparar el reactivo de base para permetilación, añadir 400 l de NaOH al 50% a un tubo con tapa de rosca de vidrio limpio (13 x 100 mm). Añadir 800 l de MeOH anhidro y vórtice. </li><li> Añadir 4 ml de sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO) y agitar en vórtex para generar un precipitado blanco. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 1 min para sedimentar el precipitado. Pipetear el sobrenadante y desechar. Añadir un adicional de 4 ml de DMSO anhidro al sedimento. Vortex. </li><li> Repita el paso 6.2 y 6.3 con un mínimo de tres veces más o hasta que no se forma un precipitado blanco. </li><li> Disolver la base granulado en 3 ml de DMSO anhidro y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo con una pipeta Pasteur limpia. </li><li> Utilice la base inmediatamente para la siguiente reacción permetilación ya que no se puede almacenar. </li></ol> 7. permetilación de glucanos liberados <ol><li> Añadir 200 l de DMSO anhidro a la muestra purificada-C18 y de vórtice o sonicado para volver a suspender. </li><li> Añadir 300 l de la resuspcomposición lodo de base a la muestra y añadir inmediatamente 100 l de yodometano (MEI). Selle el tubo con tapón de teflón forrado y mezclar vigorosamente durante 5 min en vórtice. </li><li> Para detener la reacción permetilación, añadir 2 ml de 5% de AcOH en hielo y vórtice. Pipeta solución arriba y abajo 5 veces para reducir el volumen restante de Mel por evaporación. NOTA: El AcOH neutraliza la solución y la eliminación de MeI aumenta la eficiencia de la extracción de glicanos sulfatados en la fase acuosa durante la fase de partición. </li><li> Añadir 2 ml de diclorometano (DCM) y agitar. Centrifugar a 600 xg durante 1 min a temperatura ambiente para separar las fases acuosa y orgánica. </li><li> Transferir la capa superior (fase acuosa que contiene la mayoría de los glicanos sulfatados permetilados) en un nuevo tubo de vidrio (13 x 100 mm). </li><li> Añadir 2 ml de H 2 O a la fase orgánica y vórtice. Se centrifuga a 600 × g durante 1 min para separar las fases acuosa y orgánica y combinar esta segunda fase acuosa con el abetofase acuosa st (paso 7.5). </li><li> Repita el paso 7.6 y 7.5 más de tres veces, pero no hay necesidad de ahorrar las fases acuosas resultantes de las particiones posteriores. </li><li> Eliminar la capa final superior (fase acuosa) tanto como sea posible de la capa inferior (fase orgánica) y transferir la capa inferior (fase orgánica) en un tubo de vidrio limpio nuevo separada usando una pipeta Pasteur. </li><li> Se seca la fase orgánica bajo N2 corriente a 42 ° C. </li><li> Cubra el tubo con Parafilm y se almacena a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 8. C18 Clean-up de permetilados sulfatado O-glicanos de la fase acuosa <ol><li> Equilibrar una columna de cartucho C18 con tres volúmenes de ACN y cinco volúmenes de 5% de AcOH. </li><li> Cargar las fases acuosas recogidas y combinado de los pasos 7.5 y 7.6 en la columna. </li><li> Lavar la columna con 10 ml de H 2 O para la desalación. </li><li> Eluir el permetilado sulfatado O-glicanos en un nuevo tubo de vidrio con 2 mlde 50% de ACN. Utilice una elución adicional con un 85% de ACN para mejorar la recuperación de permetilado sulfatados O-glicanos en oligosacáridos más grandes. </li><li> Eluidos seco bajo corriente de nitrógeno a 42 ° C. </li><li> Guarde el material seco a -20 ° C hasta 6 meses antes de su análisis MS. </li></ol> 9. La espectrometría de masa de permetilado O-glicanos <ol><li> Analizar permetilados O-glicanos por infusión directa en un espectrómetro de masas apropiado usando una fuente de nanoelectropulverización a un caudal de jeringuilla de 0,40-0,60 l / min a 210 ° C de temperatura capilar. Para la fragmentación por CID en MS / MS y MS n de una trampa de iones instrumento, aplique un 30-40% de la energía de colisión. </li><li> Para el modo de ion negativo, reconstituir permetilado sulfatado O-glicanos en 50 l de metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM de acetato de amonio acuoso (16: 3: 3: 2 en volumen). Para el modo de iones positivos, reconstituir permetilado / O-glicanos sialiladas neutros en 50 l de sodio 1 mM hidroeléctricaXide en metanol / agua (1: 1). </li><li> Use el mapeo total de iones (TIM) y tomografía pérdida neutra (exploración NL) funcionalidad de la versión del paquete de software Xcalibur 2.0 para el análisis de MSN a caracterizar estructuras-O glicanos individuales 13,19. </li></ol>

<ol><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+roles+of+oligosaccharides%3A+all+of+the+theories+are+correct%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct.</a> Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li>
<li>Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+protein+glycosylation%3A+diversity%2C+synthesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).</li>
<li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).</li>
<li>Yan, A., Lennarz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+protein+N-glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).</li>
<li>Washburn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilisation+of+proteomics+datasets+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology+%28MudPIT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT).</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).</li>
<li>Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+of+proteins+for+internal+sequence+analysis+after+one-+or+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).</li>
<li>Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+an+%27In-Gel%27+digestion+procedure+for+the+micropreparation+of+internal+protein+fragments+for+amino+acid+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing.</a> Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).</li>
<li>Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mass+spectrometry+for+the+proteomic+analysis+of+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation.</a> Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).</li>
<li>Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+glycosylated+interferon-gamma+variants+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).</li>
<li>Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+N-linked+oligosaccharides+directly+from+protein+gels%3A+in-gel+deglycosylation+followed+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+and+normal-phase+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).</li>
<li>Kuster, B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O-labeling+of+N-glycosylation+sites+to+improve+the+identification+of+gel-separated+glycoproteins+using+peptide+mass+mapping+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching.</a> Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).</li>
<li>Aoki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+O-linked+glycans+expressed+during+Drosophila+melanogaster+development+reflects+stage-+and+tissue-specific+requirements+for+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).</li>
<li>Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+peeling+during+the+release+of+O-glycans+by+hydrazinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis.</a> Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).</li>
<li>Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+analysis+of+O-linked+oligosaccharides+from+glycoproteins+and+mucins+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis.</a> Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).</li>
<li>Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+glycosylation+in+human+saliva+reflects+blood+group+and+secretor+status%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status.</a> Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).</li>
<li>Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+O-linked+glycans+released+directly+from+glycoproteins+in+gels+using+in-gel+reductive+%CE%B2-elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination.</a> Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).</li>
<li>Anumula, K. R., Taylor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+procedure+for+preparation+of+partially+methylated+alditol+acetates+from+glycoprotein+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).</li>
<li>Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+developmental+elaboration+of+N-linked+glycan+complexity+in+the+Drosophila+melanogaster+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo.</a> J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).</li>
<li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Nomenclature+for+Carbohydrate+Fragmentations+in+Fab-Ms+Ms+Spectra+of+Glycoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates.</a> Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).</li>
<li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li>
<li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR%3A+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li>
<li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li>
<li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+mucin+MG1+%28MUC5B%29+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li>
<li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li>
<li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+%CE%B2-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

La combinación de la eliminación de β reductora en gel con la extracción acuosa-orgánica mejora la sensibilidad y la profundidad de los datos estructurales que se pueden adquirir para caracterizar glicanos sulfatados y no sulfatados ligados a O recolectados de pequeñas cantidades de glicoproteínas de tipo mucina resueltas de otras proteínas por SDS-PAGE. Los avances esenciales de los enfoques técnicos presentados en este estudio son: (a) eliminación fácil de contaminantes derivados del gel mediante simples pasos de lavad...

La glicosilación es una modificación esencial de proteína después de la traducción, lo que contribuye a la fisiología del organismo, patología del tejido, y el reconocimiento celular 1-3. A pesar de los grandes avances en glicociencia analítica, la caracterización de la diversidad completa de glicanos en una proteína específica sigue siendo una tarea extremadamente difícil, sobre todo en las proteínas aisladas de fuentes biológicas primarias. No obstante, la microheterogeneidad de glicanos de glicoproteínas con frecuencia afecta a las interacciones funcionales con otras proteínas. Por lo tanto, la caracterización de la diversidad glicano es esencial para la comprensión de la importancia fisiológica de celular y tisular 4,5 glicosilación. A fin de comprender la contribución de glicosilación glicoproteína a la fisiología y la fisiopatología del tejido, robusto, sensible, y técnicas analíticas integrales glycomic han vuelto cada vez más importante. En el análisis proteómico, identificación de proteínas se obtienen generalmente por LC-MS/ MS análisis de péptidos trípticos 6. La digestión de proteínas puede llevarse a cabo usando una proteína o proteínas purificadas resueltas por SDS-PAGE después de la digestión en gel con proteasas tales como tripsina 7-9. Pre-enriquecimiento de la mezcla de proteínas por SDS-PAGE aumenta la profundidad y exactitud de ID de la proteína. El desarrollo de estrategias análogas para el análisis glycomic de glicosilación glicoproteína se encuentra a la vanguardia de la glicociencia. Las dos clases principales de glicanos están unidos a cadenas principales de proteínas a través de cualquiera de ligamiento o N-O-vinculación. Glicanos ligados a N están unidos a asparagina (Asn) residuos que se encuentran como parte de un sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X es cualquier aminoácido excepto prolina), y puede ser liberado por digestión enzimática con péptido-N -glycanase (PNGasaF o A), ya sea en solución, en gel, o en-blot 10-12. Glicanos O-ligados están asociadas principalmente a serina (Ser) o treonina (Thr) residuos. Sin embargo, sólo una enzima ha sido identificado que es capaz de liberar glicanos O-ligados de glicoproteína y tiene una especificidad glicano extremadamente limitada, liberando sólo los glicanos O-ligados simples. Estrategias de las emisiones químicas siguen siendo el método de elección para la liberación integral de glicanos O-ligados de glicoproteínas. Β-eliminación reductora o no reductora, o hidrazinolisis son técnicas de liberación química bien caracterizados y son actualmente los métodos más comúnmente utilizados para la liberación de los glicanos O-vinculado glicoproteínas de 13,14. Aunque reductora β-eliminación se ha utilizado para liberar los glicanos O-ligados de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, los enfoques anteriores requieren separación por HPLC para el análisis posterior 15-17. Análisis multidimensional MS (MS n) actualmente proporciona la fuente más rica de los datos estructurales para la caracterización de los glicanos liberados de glicoproteínas aisladas en las cantidades que se espera de la mayoría de fuentes biológicas. La profundidad de la EMcaracterización estructural basado ve facilitada en gran medida por permethylating los glicanos liberados antes de su análisis. Permetilación mejora la ionización y tiende a igualar las respuestas de señal molares través de una amplia gama de estructuras de glicano 18,19. Además, permetilación etiquetas inequívocamente restos de monosacáridos terminales y sustituidos con masas distintivos, mejorando así la elucidación estructural 20-23. Por ejemplo, los glicanos ácidos son generalmente difíciles de detectar como especies no permetilado por MS. Aunque glicanos ácidas se pueden detectar en modo de iones negativos por MS, es imposible detectar tanto glicanos ácidos y neutros en el mismo modo de iones. Una ventaja importante de permetilación glicano es que todos los grupos hidroxilo libres (OH) en sustituyentes de monosacáridos de un glicano se tapó con un grupo metilo (OCH 3 o OMe), por lo tanto los cargos de un sialilados glicano se neutralizan, por lo que como detectable como permetilado neutral (AsiaLO) glicanos. Sin embargo, los hidroxilos de restos de sulfato en sulfoglycans son resistentes a la permetilación, lo que resulta en la retención de carga aniónica, que suprime la ionización y disminuye la sensibilidad. Esta supresión actualmente impide el análisis glycomic integral de glicoproteínas muy complejas, como las mucinas, que llevan una gran abundancia de glicanos sulfatados 24-26. Informes recientes sobre purificadores de glicanos sulfatados usado cargado, cromatografía de fase inversa para purificar y glicanos permetilados separadas antes del análisis MALDI. Este método se basa en la separación completa de glicanos sulfatados y no sulfatados utilizando diferentes fases móviles para la elución, lo que hemos encontrado para ser menos estrictas que el particionamiento fase orgánica. Por lo tanto, las nuevas técnicas adecuadas para la detección y el enriquecimiento de sulfoglycans se presentan aquí. Estas técnicas permiten la recuperación cuantitativa de glicanos sulfatados en la fase acuosa de agua siguiente: DCM (diclorometano)extracción, que se realiza rutinariamente en el extremo de reacciones permetilación de glicano 27. Es importante destacar que esta robusta separación de sulfoglycans permetilados de una mezcla de glicanos sulfatados no permetilados enriquece concomitantemente para especies cargadas al mismo tiempo simplificar MS 2 patrones de fragmentación. También se presenta un protocolo integral para mejorar el análisis de glicanos O-ligados en gel. El protocolo de recuperación mejorada aumenta el glicano, aumenta la información estructural puede obtenerse a través de MS n análisis de glicanos permetilados, y mejora la sensibilidad del análisis sulfoglycomic aplicadas a glicoproteínas esenciales aislados de fuentes biológicas. Este protocolo está diseñado para O-glicano ligado análisis de extractos de glicoproteína enteros o de una glicoproteína específica de interés resueltas por SDS-PAGE y se compone de tres procedimientos experimentales; A) gel de limpieza, B) en gel reductora β-eliminación y C) permethy glicanolación. El objetivo es obtener datos glycomic integrales O-ligados para glicoproteínas cosechadas a partir de fuentes primarias de interés biológico (Figura 1). Las glicoproteínas separadas por SDS-PAGE se visualizaron por tinción y bandas de interés se escindieron y la banda de gel resultante se corta en trozos pequeños. Las piezas de gel se destiñeron y se sometieron a lavados de acetato de etilo para eliminar los contaminantes de gel (Figura 2a). La liberación de glucanos se consigue mediante in-gel reductora β-eliminación (Figura 2B) y los glicanos liberados se permetiló. Acuoso-orgánico de extracción siguiente permetilación particiones cuantitativamente los glicanos aniónicos sulfatados lejos de glicanos neutros no sulfatados (Figura 2C). En-gel reductora β-eliminación acoplado a extracción acuosa-orgánica permite la caracterización de glicanos O-ligados y sulfoglycans liberados de pequeñas cantidades de glicoproteína separados por SDS-PAGE. La visión estratégica es summariZed en la Figura 1 y los detalles se muestran en la Figura 2. Además, una parte de las piezas de gel se lavaron destained y se puede utilizar para ID de proteínas mediante técnicas proteómicas estándar LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Agua, agua desionizada</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>270733-4L</td><td>CHROMASOLV, para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido acético, Glacial</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td>Certificado ACS &ge; 99.7% p/p</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34860-4L-R</td><td>CHROMASOLV, para HPLC, &ge; 99,9%</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Fluka</td><td>09830-500G</td><td>BioUltra, &ge; 99.5% (T), Paso 1</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34998-4L</td><td>CHROMASOLV Plus, para HPLC, &ge; 99.9%, Paso 1</td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Fluka</td><td>34972-1L-R</td><td>LC-MS CHROMASOLV, Paso 1</td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>Aldrich</td><td>213462-25G</td><td>ReagentPlus, 99%, Paso 2</td></tr><tr><td>Yodometano</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>289566-100G</td><td>ReagentPlus, 99,5%,&nbsp; Paso 6.&nbsp; Tienda a 4 & grados; C hasta su uso.&nbsp; Siéntese a temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de sodio, 50% p/p</td><td></td> Fisher <td>SS254-1</td><td>Certificado, Paso 6</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, anhidro</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>276855-1L</td><td>Anhidro, &ge; 99.9%, Paso 6</td></tr><tr><td>Metanol,</td><td>Sigma-Aldrich anhidro&nbsp;</td><td>322415-100ML</td><td>Anhidro, 99.8%, Paso 6</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34856-4L</td><td>CHROMASOL&reg;, para HPLC, &ge; 99.8%, contiene amileno como estabilizador, Paso 7</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8 forma de hidrógenoforma de hidrógeno 100-200 &nbsp; malla</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>217506-500G</td><td>Paso 3</td></tr><tr><td>AG 50W-X8 Resina&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Paso 3</td></tr><tr><td>BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Columna de Extracción en Fase Sólida, PP, Octadecilo (C18) Fase Inversa</td><td>JT Baker</td><td>JT-7020-01</td><td>Paso 5 y 8</td></tr><tr><td>7.5% Mini-PROTEAN TGX Gel Prefabricado&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Paso 1</td></tr><tr><td>Tinción de Coomassie Bio-Segura&nbsp;</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0786</td><td>G-250, Paso 1 Kit de</td></tr><tr><td>tinción de plata para espectrometría de masas</td><td>Pierce</td><td>24600</td><td>Paso 1</td></tr><tr><td>Kit de Oligosacáridos (Maltotriosa, Dp3: R474140)</td><td>Supelco&nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Oligosacáridos (Maltotetraosa, Dp4: R474135)</td><td>Supelco&nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur Desechables, Vidrio, Punta Corta</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Lavar antes de usar</td></tr><tr><td>PYREX 13 x 100 mm Tubos de cultivo roscados desechables de fondo redondo</td><td>Corning</td><td>99447-13</td><td>Lavar antes de usar</td></tr><tr><td>PYREX 16 x 125 mm Tubos de cultivo roscados de fondo redondo desechables</td><td>Corning</td><td>99447-16</td><td>Lavar antes de usar</td></tr><tr><td>Tapones/cierres fenólicos con revestimiento de caucho con revestimiento de caucho con revestimiento de PTFE</td><td>Kimble</td><td>45066C-13</td><td>Lavar antes de usar</td></tr><tr><td>Tapones/cierres fenólicos con revestimiento de caucho con revestimiento de PTFE</td><td>Kimble</td><td>45066C-15</td><td>Lavar antes de usar</td></tr><tr><td>Jeringa de HPLC HAMILTON</td><td></td><td>81265</td><td>volumen 500&nbsp; &mu; l, tamaño de la aguja 22 G</td></tr><tr><td>Jeringa de HPLC HAMILTON</td><td>HAMILTON</td><td>81165</td><td>volumen 250&nbsp; &mu; l, tamaño de la aguja 22 G</td></tr><tr><td>Jeringa de HPLC HAMILTON</td><td></td> HAMILTON <td>81065</td><td>volumen 100&nbsp; &mu; l, tamaño de la aguja 22s G</td></tr><tr><td>Jeringa de HPLC HAMILTON</td><td></td> HAMILTON <td>80965</td><td>volumen 50&nbsp; &mu; l, tamaño de la aguja 22s G</td></tr><tr><td>Jeringas calibradas Hamilton</td><td>HAMILTON</td><td>80300</td><td>volumen 10&nbsp; &mu; l, tamaño de la aguja 26s G</td></tr><tr><td>Placa de Petri Vidrio 100 mm x 15mm</td><td>GSC INTERNATIONAL INC</td><td>1500-4</td><td>Lavar antes de usar, Paso 1</td></tr><tr><td>Cuchillas quirúrgicas Bard-Parker</td><td>Fisher</td><td>371310</td><td>Paso 1</td></tr><tr><td>Módulo de calentamiento/agitación Reacti-Therm</td><td>Pierce</td><td>18870</td><td>Paso 1, 4 y 7</td></tr><tr><td>Bloques calefactores</td><td>Fisher</td><td>125D</td><td>Paso 2</td></tr><tr><td>Tamaño de poro de borosilicato de lana de vidrio de fibra Pyrex 8&nbsp; &mu; m</td><td>Aldrich</td><td>CLS3950</td><td>Paso 3</td></tr><tr><td>Cortador de sílice fundidaCortador de tubos</td><td>alltech</td><td>3194</td><td>Paso 3</td></tr><tr><td>Vórtices multitubo&nbsp;</td><td>VWR</td><td>444-7063</td><td>Paso 6</td></tr><tr><td>Liofilizador 25EL Freezemobile</td><td>Centrífuga Virtis</td><td>25EL</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>Clinical 50</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Discovery</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mejora en-gel β-eliminación para ligada al o y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de espectrometría de masas

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

La separación de proteínas por SDS-PAGE seguida de la digestión proteolítica en gel de las bandas de proteínas resueltas ha producido un análisis proteómico de alta resolución de muestras biológicas. Enfoques similares, que permitirían un análisis en profundidad de los glicanos transportados por las glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE, requieren consideraciones especiales para maximizar la recuperación y la sensibilidad cuando se utiliza la espectrometría de masas (MS) como método de detección. Un obstáculo importante que debe superarse para lograr datos de alta calidad es la eliminación de los contaminantes derivados del gel que interfieren con el análisis de MS. El flujo de trabajo de muestras que se presenta aquí es robusto, eficiente y elimina la necesidad de una limpieza de HPLC en línea antes de la EM. Las piezas de gel que contienen proteínas objetivo se lavan con acetonitrilo, agua y acetato de etilo para eliminar los contaminantes, incluidos los fragmentos de acrilamida polimérica. Los glicanos ligados a O se liberan de las proteínas objetivo mediante la eliminación de β reductores en gel y se recuperan mediante procedimientos de limpieza robustos y sencillos. Una ventaja de este flujo de trabajo es que mejora la sensibilidad para detectar y caracterizar glicanos sulfatados. Estos procedimientos producen una separación eficiente de los glicanos permetilados sulfatados de los glicanos permetilados no sulfatados (sialilados y neutros) mediante una rápida partición de fase antes del análisis de MS y, por lo tanto, mejoran los análisis glucómicos y sulfoglicómicos de las glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE.

Efecto de Etil Acetato de Tratamiento Antes del En-gel reductora β-eliminación Un espectro de masas representativo de muestras permetilados glicanos O-ligados liberados de mucina bovina utilizando en gel reductora β-eliminación se muestra en la Figura 3. El lavado EtOAc de las piezas de gel SDS y elimina de forma efectiva poliacrílicos contaminantes que interfieren con el posterior análisis MS 27. <p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

Con el fin de explorar exhaustivamente la diversidad de glicanos ligados a O, se aplica un nuevo procedimiento para la eliminación de β reductor en gel, combinado con permetilación y un método rápido de partición de fase, al análisis de glicanos ligados a O liberados directamente de glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE y susceptibles de análisis glicómico posterior por espectrometría de masas.

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

improved-gel-reductive-elimination-for-comprehensive-o-linked-sulfo

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de las secuencias reductoras de glicosil extremo (RE) e interno de los heteroxilanos mediante el marcaje del RE con 2 aminobenzamida antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa) y luego el análisis de los oligosacáridos resultantes mediante espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

Este artículo presenta una forma mejorada de una novedosa técnica glicómica de abajo hacia arriba diseñada para analizar el perfil composicional agrupado de glicanos en biofluidos no fraccionados a través de la descomposición química de los glicanos en sus monosacáridos específicos de enlace constituyente para su detección por GC-MS. Las aplicaciones potenciales incluyen la detección temprana del cáncer y otros trastornos afectivos de los glicanos.

El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. Un método simple para analizar complejos multiméricos estabilizados por estos vínculos es mediante el análisis de SDS-PAGE no reductor. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células de osteosarcoma ósea humana U-2 OS.

Combinación de análisis de SDS-página no-reducción y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en la cultura

La búsqueda abierta permite la identificación de glicopéptidos decorados con composiciones de glicanos previamente desconocidas. Dentro de este artículo, se presenta un enfoque simplificado para realizar búsquedas abiertas y posteriores búsquedas de glicopéptidos centrados en glicotecos para muestras bacterianas utilizando Acinetobacter baumannii como modelo.

La aplicación de enfoques abiertos basados en la búsqueda para la identificación de glicopéptidos ligados a O de Acinetobacter baumannii

Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada que ofrece información completa sobre el glicoproteoma heterogéneo en microambientes tumorales complejos necesarios para comprender mejor la glicobiología de los cánceres.

La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos 

En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la liberación de O-glicanos de las mucinas, y la posterior desalado, permetilación y análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

Perfilado de O-glicanos de mucina permetilada mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz

Se desarrolló un protocolo para la preparación de mitocondrias purificadas a partir de células microgliales, el aislamiento de proteínas mitocondriales para la liberación de N-glicanos y la detección rápida de glicanos mitocondriales subcelulares mediante ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja acoplada a espectrometría de masas de analizador de masas precisa de alta resolución.

Preparación mitocondrial de la microglía para el análisis de glicanos

Se presenta la caracterización de complejos formados en diferentes proporciones relativas de mercurio(II) a tetrapéptidos dicysteinil mediante espectrometría de masas orbitrap de ionización por electrospray.

Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

Aprende a analizar glicanos O-unidos mediante eliminación beta reductora en gel y permetilación, seguido de espectrometría de masas en tándem. Este método optimizado permite la caracterización completa de glicanos sulfatados y neutros.

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Explorar más videos