Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

El objetivo general de este procedimiento es cosechar Olink Glycans. Esto se logra resolviendo primero las glicoproteínas por la página SDS. El segundo paso es lavar las piezas de gel que contienen la glicoproteína de interés.

A continuación, los glicanos olink se liberan por eliminación beta reductora. El paso final es el glicano por metilación con partición de fases. En última instancia, los glicanos metilados permanentes se analizan mediante espectrometría de masas en tándem para detectar estructuras y cuantificar abundancias.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la cromatografía líquida de alta resolución, es que nuestro método separa los glicanos neutros y cargados por metilados en una partición de fase rápida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ciencia glicológica al permitir una caracterización completa de los glicanos o glicanos ligados liberados de las glicoproteínas resueltas. Antes de comenzar este procedimiento, resuelva las glicoproteínas mediante electroforesis en gel.

Después de la electroforesis, coloque el gel en una placa de vidrio y extirpe la región de interés con un bisturí limpio para aumentar el rendimiento de glicanos OG. Transfiera la banda de gel de interés a otra placa de vidrio y corte la pieza en cubos de aproximadamente dos milímetros. Transfiera las pequeñas piezas de gel a un tubo de vidrio con tapa de rosca de 13 por 100 milímetros con una espátula micros de acero inoxidable.

A continuación, agregue un mililitro de bicarbonato de amonio 25 milimolar o ambi al tubo de muestra. Después de tapar el tubo con una tapa de rosca de teflón, mezcle suavemente el contenido moviendo el tubo antes de dejarlo reposar durante 10 minutos. A continuación, retire con cuidado el ámbito del tubo de vidrio.

Con una pipeta de pasto o de vidrio, agregue un mililitro de aceto nitrilo al tubo de vidrio para cubrir completamente las piezas de gel. Después de tapar el tubo, mezcle suavemente el contenido moviendo el tubo antes de dejarlo reposar durante 10 minutos. Cuando termine, retire el aceto nitrilo del tubo de vidrio.

Después de repetir los pasos anteriores hasta eliminar el color azul brillante, agregue dos mililitros de acetato de etilo y vuelva a tapar el tubo. Coloque el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche con agitación de extremo a extremo. Una vez retirado el lavado con acetato de etilo, realizar tres lavados con dos mililitros de agua desionizada.

Una vez que se hayan secado las piezas de gel, agregue 500 microlitros de una solución de hidróxido de sodio de 100 milimolares. Y pongámonos de pie de tres a cinco minutos en hielo para equilibrar el gel con las condiciones básicas que mejoran la recuperación de glicanos. Después de esto, agregue 500 microlitros de borohidruro de sodio de dos molares en hidróxido de sodio de 100 milimolares, lo que da como resultado concentraciones finales de hidruro de boro de sodio molar en hidróxido de sodio de 100 milimolares.

Después de mezclar suavemente el tubo, incube la muestra a 45 grados centígrados durante 18 horas. Durante la primera hora de incubación, mezcle suavemente el tubo cada 15 minutos. Una vez que se complete la reacción de eliminación beta y se haya colocado el tubo en hielo, agregue lentamente ácido acético al 10% gota a gota.

Para neutralizar la base, agite suavemente el tubo de muestra entre adiciones de ácido acético, centrifugue el tubo para eliminar las burbujas y evitar el desbordamiento si es necesario. Para hacer una pequeña columna de vidrio, rasque y rompa la punta de una pipeta de pasto o vidrio con un cortador de cerámica para que la conicidad de la punta de la pipeta tenga aproximadamente un centímetro de largo. Después de separar un tapón de lana de vidrio, empújalo hacia la punta, formando un soporte para el lecho de resina.

Asegure la columna de pipetas con una pinza de ropa y colóquela sobre un tubo de ensayo de vidrio. A continuación, lave la pipeta vacía que contiene lana de vidrio con un mililitro de metanol y tres mililitros de ácido acético al 5%. Después de girar la lechada de resina de intercambio catiónico de hidrógeno Dow X en ácido acético al 5%.

Transfiera lo suficiente para producir un volumen de lecho de un mililitro en la columna de pipetas de pasto, enjuague la columna con cinco volúmenes de ácido acético al 5% verificando el flujo para detectar la aparición de partículas de resina. Después de colocar la columna sobre un nuevo tubo de vidrio con tapa de rosca de 16 por 125 milímetros, cargue la muestra en la columna. Una vez que se haya recogido el flujo, eluir glicanos con al menos tres volúmenes de ácido acético al 5% en el mismo tubo.

Después de la liofilización, agregue 300 microlitros de ácido acético al 10% en metanol al tubo de muestra seco. Después del vórtice, elimine el bato de trimetilo resultante por evaporación bajo una corriente de nitrógeno a 37 grados Celsius. Después de repetir los pasos de resuspensión y secado al menos cuatro veces, reconstituya la muestra en ácido acético al 5%.

Una vez que la muestra se haya cargado en una columna C 18 equilibrada, recoja el flujo a través de un tubo de vidrio con tapón de rosca de 13 por 100 milímetros. Eluir los glicanos OOG con tres mililitros de ácido acético al 5% en el mismo tubo. A continuación, liofilizar la muestra para preparar el reactivo base para la metilación permanente.

Agregue 400 microlitros de hidróxido de sodio al 50% a un tubo de vidrio limpio de 13 por 100 milímetros con tapa de rosca. Luego agregue 800 microlitros de metanol anhidro al mismo tubo. Agregue cuatro mililitros de óxido de dimetilsulfo anhidro y vórtice para generar un precipitado blanco.

Centrifugar la muestra a 600 veces G durante un minuto para granular el precipitado. Después de desechar el sobrenadante y agregar cuatro mililitros de óxido de dimetilsulfo anhidro al vórtice de pellets, el reactivo Repita cuatro veces más hasta que la suspensión base se vuelva translúcida. Disuelva la base peletizada en tres mililitros de óxido de dimetilsulfo anhidro y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de pasto limpia.

A continuación, añada 200 microlitros de óxido de dimetilsulfo anhidro a la muestra seca y al vórtice. Para volver a suspenderlo, agregue 300 microlitros de la suspensión base resuspendida a la muestra e inmediatamente agregue 100 microlitros de metano ITOM. Selle el tubo con una tapa forrada de teflón y mezcle vigorosamente durante cinco minutos por vórtice.

Para detener la reacción de metilación de la permanente, coloque el tubo sobre hielo y agregue dos mililitros de ácido acético al 5%. Después del vórtice, pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo cinco veces para reducir el volumen restante de metano ITOM por evaporación. En este punto, agregue dos mililitros de diclorometano a la muestra después del vórtice y la centrifugación.

Transfiera la capa acuosa superior a un nuevo tubo de vidrio de 13 por 100 milímetros. Después de repetir el lavado acuoso de la capa de diclorometano, combine la segunda fase acuosa con la primera capa acuosa. Una vez que el lavado con agua de la fase de diclorometano se haya repetido dos o tres veces, transfiera la fase de diclorometano a un tubo de vidrio limpio con una pipeta de pasto limpio.

A continuación, seque la fase orgánica bajo un chorro de nitrógeno a 42 grados centígrados. Después de equilibrar una columna C 18 y cargar la capa acuosa sobre ella. Lave la columna C 18 con agua y luego eluya los oglicanos sulfatados metilados permanentes en un nuevo tubo de vidrio con dos mililitros de 50% de nitrilo aceto analizar glicanos OG metilados permanentes por infusión directa en un espectrómetro de masas apropiado utilizando una fuente de nano electropulverización a un caudal de jeringa de 0,4 a 0,6 microlitros por minuto a 210 grados Celsius.

La temperatura capilar para la fragmentación por disociación inducida por colisión en MSM S y MS multidimensional de un instrumento de trampa de iones aplica espectros de masas representativos de energía de colisión del 30 al 40% de las muestras de glicanos olink metilados permanentes liberadas de la mucina bovina utilizando la eliminación beta reductora ingel se muestran aquí, en el panel superior. El espectro está dominado por un contaminante polidisperso derivado del gel de poliacrilamida. El panel inferior demuestra que el lavado de acetato de etilo de las piezas de gel antes de la eliminación beta elimina este problema.

Los glicanos Oinked se liberaron de la mucina submaxilar bovina mediante la eliminación beta reductora de Ingel utilizando piezas de gel que se cortaron en rodajas pequeñas o grandes. La recuperación de glicanos entintados de pequeños trozos de gel fue casi diez veces mayor que la de grandes trozos de gel. Los glicanos metilados neutros permanentes se recuperan en la fase de diclorometano orgánico.

Mientras que los glicanos metilados de la permanente ónica se dividen cuantitativamente en la fase acuosa. La eficiencia y simplicidad del método de partición de fase facilita en gran medida el rendimiento de la muestra y los enfoques analíticos posteriores. Los glicanos O metilados permanentes no sulfatados se recuperaron de la fase orgánica, y todos los sul glicanos metilados permanentes se recuperaron de la fase acuosa, lo que facilita la identificación y caracterización de glicanos casi isobarados sulfatados y no sulfatados.

Estos glicanos difieren solo en 0,1 unidades de masa y serían difíciles de resolver sin separar físicamente las dos especies por partición de fase después de su desarrollo. Esta técnica ha permitido una exploración exhaustiva de la diversidad de glicanos en muestras de tejidos, células cultivadas, sistemas modelo y muestras de pacientes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo palmear y dividir con éxito todos los glicanos vinculados liberados por las proteínas gly.

Resuelto por la página SDS.