Name: Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprende a inmovilizar estructuras celulares vegetales mediante congelación de alta presión y sustitución rápida por congelación para microscopía electrónica de transmisión. Este método preserva la morfología intacta y minimiza artefactos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La bondad y la generosidad del Dr. Kent McDonald de la Universidad de Berkeley son muy apreciadas. Damos las gracias a un revisor anónimo de sugerencias muy útiles. El laboratorio de Burch-Smith es apoyado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Tennessee.

NOTA: El procedimiento QFS requiere extremo cuidado y precaución por el usuario y le prestamos atencion a estas precauciones de seguridad aquí como precauciones y notas en su caso. 1.Preparación para HPF Run <ol><li> Antes de comenzar la preparación de muestras, encienda el congelador de alta presión siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: La unidad HPF utilizada en este protocolo es una unidad compacta Wohlwend 02 (Figura 1), y se tarda aproximadamente una a una hora y media de procedimiento de puesta en marcha antes de HPF se ejecuta puede comenzar. <ol><li> Encender el Wohlwend compacto de alta presión 02 congelador. <ol><li> Encienda el instrumento girando el interruptor principal de &quot;0&quot; a &quot;1&quot;. </li><li> Liberar el aire comprimido a la máquina. </li><li> Liberación de nitrógeno líquido a la máquina. </li><li> Presione el botón &quot;SYSTEM DRY UP&quot;. </li><li> Después de 30 minutos, pulse el botón &quot;SYSTEBotón de nuevo M DRY UP &quot;. </li><li> Presione el botón &quot;ON / OFF&quot; para encender el instrumento. </li><li> Pulse el botón &quot;NITROGENO&quot;. </li><li> Deje que la máquina se enfríe durante 20 minutos, incluso si el &quot;DRIVE IN&quot; botón ya ha iluminado. </li><li> El &quot;DRIVE IN&quot; botón se ilumina. </li><li> Pulse el &quot;DRIVE IN&quot; botón. </li><li> Pulse el botón &quot;AUTO&quot;. </li><li> Los &quot;SISTEMA LISTO&quot; botón se ilumina. </li><li> Coloque la sonda de temperatura y de presión en la cámara de presión y fijarlo con el pasador. </li><li> Pulse el botón &quot;AUTO JET&quot;. Este paso comprueba que el aumento de presión y el descenso de la temperatura son tan deseada; esencialmente una prueba. Se espera que las fuertes caídas de temperatura y fuertes aumentos de presión (Figura 1B). </li><li> Realizar dos ciclos más JET. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparación para ReceiviLas muestras congeladas ng <ol><li> Rellena una caja aislada que contiene los titulares criovial con nitrógeno líquido (véase Advertencias de seguridad), por lo que los titulares están cubiertos completamente (Figura 1C). NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido. </li><li> Coloque el número apropiado de viales que contienen el medio FS en los soportes de tubo de aluminio en el nitrógeno líquido (Figura 1C). Con este protocolo hasta cuatro discos que contienen cada uno una sola muestra se puede colocar en una sola criovial. NOTA: Los viales deben ser etiquetados con un instrumento afilado como un escriba con punta de diamante y un lápiz muy suave. <ol><li> Para fijador durante QFS utilizar 1% OSO 4 y 0,1% de acetato de uranilo en acetona 9. Preparar la solución en gran volumen, dispensar alícuotas de 1,5 ml en crioviales y tienda de congelados en nitrógeno líquido. NOTA: los avisos de seguridad para el manejo de OsO4 y acetato de uranilo. NOTA: OsO4 </sub&gt; y acetato de uranilo son productos químicos peligrosos y deben ser manejados en la campana de extracción, mientras que use el equipo de protección personal (PPE), incluyendo zapatos cerrados, bata de laboratorio y guantes. NOTA: Los crioviales se utiliza para mantener las muestras para QFS debe tener una junta tórica duro para asegurar que los tubos se mantendrán sellados durante QFS para evitar fugas de OsO4. </li></ol></li><li> Prepare la pasta de levadura mezclando la levadura del pan, con un volumen aproximadamente igual de metanol al 10% con un palillo de dientes u otro objeto similar hasta que la pasta esté suave. La pasta de levadura actúa como un crioprotector extracelular y se utiliza para llenar el espacio alrededor de la muestra en el portamuestras. La cantidad de pasta depende del número de muestras; para 10 muestras o menos la pasta (1 ml) se pueden mezclar en un tubo de microcentrífuga. </li></ol> Congelación 3. de alta presión de las Muestras <ol><li> Quite una hoja (u otro tejido) de interés por parte de la planta y suavemente colóquelo sobre un trozo de dental de cera u otra superficie de corte. Use un punzón de 2,0 mm o tamaño deseado para cortar una muestra de la hoja. Maneje la muestra suavemente con un par de pinzas y trabajar lo más rápido posible. </li><li> Trabajando bajo un microscopio de disección, coloque el disco de hoja en el lado de 0,2 mm del tipo A portador de muestras y cubrir por completo en la pasta de levadura. Asegúrese de que el disco está completamente lleno y la pasta esté al nivel del borde del soporte al suavizar la pasta con un pincel fino (Figura 2). </li><li> Coloque el soporte en el soporte de la muestra. Cubra la muestra con la muestra portadora Tipo B, superficie plana hacia abajo. NOTA: El soporte de la muestra debe estar seco ya temperatura ambiente. </li><li> Toma de muestras en el soporte de muestra; poner en la máquina e iniciar un ciclo de congelación presionando el botón &quot;AUTO JET&quot;, que debe completar en un segundo o dos. </li><li> Trabajar lo más rápido posible, retire el soporte de la máquina y colocar la punta de la celebración de la sample en nitrógeno líquido en la caja aislada en la parte superior de la máquina HPF. Sumergir las puntas de dos pares de pinzas en el nitrógeno líquido para enfriar ellos. NOTA: Después de la congelación, los transportistas sólo deben ser manipulados con pinzas de nitrógeno líquido refrigerado. (Temperatura ambiente) pinzas calientes son a menudo la causa de la falla en cryotechniques. </li><li> Abra una criovial que contiene los medios de comunicación FS, y coloque la tapa en el lado de la caja. Con la ayuda de un par de fórceps enfriado con nitrógeno líquido, eliminar suavemente el disco de la portamuestras, asegurándose de que el disco está siempre en el nitrógeno líquido o vapor. Trabajar en el vapor de nitrógeno líquido, sostenga el tubo FS con uno fórceps pre-enfriado y utilizar la otra para colocar el soporte en el vial FS. Tornillo de la tapa del vial FS de nuevo. No cualquier trampa de nitrógeno líquido en el vial. NOTA: Cuando se transfieren las muestras a crioviales de QFS, garanticen que ninguna de nitrógeno líquido queda atrapado en los viales. El nitrógeno líquido se expande 700 veces durante el calentamiento y cualquier trapped nitrógeno líquido puede causar explosiones durante este tiempo. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.7 hasta que se congelan todas las muestras deseadas. Discos de hojas múltiples que contienen el mismo tipo de muestra se pueden colocar en el mismo vial. Tenga en cuenta que el soporte de la muestra tiene que ser secado y se llevó a temperatura ambiente, entre carreras de congelación. Para hacer esto de manera rápida, calentarlo con un secador de pelo, y controlar su temperatura por medio del tacto. </li></ol> 4 Preparación para Congelar Sustitución <ol><li> Inmersa por completo el bloque calentador de aluminio en nitrógeno líquido durante 10 minutos o hasta que deje de ebullición nucleada. Mientras esto sucede, coloque una capa de hielo seco (1-2 cm) en la parte inferior del recipiente utilizado como cámara de FS (Figura 3). Un recipiente de espuma de poliestireno o cubo de hielo se pueden utilizar para FS, junto con pellets de hielo seco o aplastado. </li><li> Inserte rápidamente los crioviales que contienen las muestras junto con la sonda de temperatura en las filas centrales del bloque del calentador. Asegúrese de que las tapas de laviales están firmemente atornillados de manera que los medios de comunicación FS no se escape durante la FS. Comience a registrar la temperatura. <ol><li> Hacer la sonda de temperatura mediante la colocación de un termopar a través de la parte superior de un criovial para que llegue a la parte inferior del tubo. Sellar la tapa del tubo con resina de forma que no haya fugas de líquido fuera. Llenar el tubo con 1,5 ml de acetona al inicio de cada ejecución QFS. </li></ol></li><li> Usando cryogloves aislados o grandes pinzas, derramará todo el nitrógeno líquido desde el bloque del calentador. Tenga cuidado de no derramar los crioviales. NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido. </li><li> Coloque el bloque que contiene los viales sobre la capa de hielo seco en la cámara de QFS. Asegúrese de que el bloque se coloca de manera que los tubos están en posición horizontal pero con una ligera inclinación hacia arriba. No debe haber fugas si se utilizan los crioviales correctos. </li><li> Empaque la cámara de QFS con hielo seco de manera que los tubos FS están cubiertos, aunque no es necesariocubrir la parte superior del bloque. Coloque la tapa en la cámara. </li></ol> 5. FS Rápida NOTA: Realice la carrera QFS en una campana de humos en caso de que cualquier fuga de OsO4 ocurre inadvertidamente a pesar de otras precauciones. <ol><li> Coloque cámara de QFS en un agitador rotatorio plataforma en una campana de humos y girar a 125 rpm durante 120 min. Durante este tiempo la temperatura del bloque debe aumentar gradualmente a aproximadamente -80 ° C. La agitación se asegura la mezcla de los componentes de mejores FS. NOTA: La colocación de la coctelera en la campana de humos y la posición de la puerta campana de humos debe ser la misma durante todo el procedimiento QFS y por cada QFS ejecutar para asegurar el calentamiento consistente de muestras. </li><li> Retire el hielo seco de la cámara y continuar agitando durante otra hora. NOTA: la temperatura debe aumentar a alrededor de -15 ° C a -20 ° C. </li><li> Retire las muestras y la sonda de temperatura de la cámara de QFS y colocarlo en elagitador a temperatura ambiente durante otros 10-15 minutos, hasta que alcancen la temperatura ambiente. Detener la grabación de la temperatura. </li><li> Durante FS, apague la máquina de HPF. <ol><li> Cierre la llave del tanque de nitrógeno líquido, mientras que la máquina de HPF se llena con nitrógeno. </li><li> Pulse el botón &quot;NITROGENO&quot;. </li><li> Espere hasta que los rojos &quot;pistón hacia abajo&quot; se apaga la luz. </li><li> Presione el botón &quot;ON / OFF&quot;. </li><li> Presione el botón &quot;SYSTEM DRY UP&quot;. </li><li> Corte el suministro de aire comprimido para la máquina. </li><li> Después de un mínimo de 12 horas (para asegurar el secado de la humedad), apague la máquina girando el interruptor principal de &quot;1&quot; a &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6. Mensaje FS Procesamiento <ol><li> Retire con cuidado los medios de comunicación FS con pipetas de transferencia de plástico y colocar en el recipiente apropiado para desechos tóxicos. NOTA: OsO4 y acetato de uranilo son productos químicos peligrososy debe ser manejado en la campana de extracción, mientras que use el equipo de protección personal (PPE), incluyendo zapatos cerrados, bata de laboratorio y guantes. </li><li> Lávese las muestras cuatro veces con acetona al 100%. Recoge los dos primeros lavados y colocarlo en el contenedor de residuos tóxicos. </li><li> Con unas pinzas finas, eliminar las muestras de tejido de los titulares. Mantener las muestras mojado con acetona como se hace esto, y trabajar con mucho cuidado para evitar romper las muestras. NOTA: No es inusual y que en realidad puede ser útil disponer de la pasta de levadura se alejan de las muestras en este punto. La pasta de levadura es generalmente de color marrón muy oscuro, mientras que el tejido de la hoja aún está verde. </li><li> Recoger las muestras en crioviales que contienen acetona. Proceder a la preparación de muestras (infiltración y la incrustación) para TEM de acuerdo a los protocolos habituales. </li></ol>

<ol><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).</li>
<li>Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+of+soybean+nodules+leads+to+an+improved+preservation+of+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure.</a> Planta. 188, 155-163 (1992).</li>
<li>Bowers, B. aM. M. Ch 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowers%2C+BaMM+%22Artifacts+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Artifacts in Biological Electron Microscopy</a>. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).</li>
<li>Mollenhauer, H. H. Ch 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollenhauer%2C+HH+%22Artifacts+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Artifacts in Biological Electron Microscopy</a>. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).</li>
<li>Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ultrastructure+of+conventionally+fixed+and+high+pressure+frozen%2Ffreeze+substituted+root+tips+of+Nicotiana+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis.</a> Protoplasma. 157, 64-74 (1990).</li>
<li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoor%2C+H+%22Cryotechniques+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Cryotechniques in Biological Electron Microscopy</a>. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+electron+microscopy%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice.</a> Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).</li>
<li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).</li>
<li>Hippe-Sanwald, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+freeze+substitution+on+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Impact of freeze substitution on biological electron microscopy.</a> Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).</li>
<li>Kiss, J. Z., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+immunocytochemistry+following+cryofixation+and+freeze+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution.</a> Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).</li>
<li>Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomographic+analysis+of+somatic+cell+plate+formation+in+meristematic+cells+of+Arabidopsis+preserved+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing.</a> The Plant cell. 16, 836-856 (2004).</li>
<li>Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INCREASED+SIZE+EXCLUSION+LIMIT+encodes+a+putative+DEVH+box+RNA+helicase+involved+in+plasmodesmata+function+during+Arabidopsis+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis.</a> The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).</li>
<li>Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li>
<li>McDonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+substitution+in+3+hours+or+less%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).</li>
<li>Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">The Plant Vacuole.</a> The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).</li>
<li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).</li>
<li>Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+freeze-substituted+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Substructure of freeze-substituted plasmodesmata.</a> Protoplasma. 169, 28-41 (1992).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+microanalysis%22%5BJournal%5D)">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li>
<li>McDonald, K. L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing%2C+cellular+tomography%2C+and+structural+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li>
<li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El éxito del protocolo que se presenta aquí depende en gran medida del usuario. En primer lugar, se requiere una preparación avanzada para asegurar que todos los materiales necesarios son fácilmente disponibles y en cantidad suficiente para completar toda una carrera HPF-QFS. En segundo lugar, el usuario debe trabajar con rapidez, moviéndose desde el paso-a-paso de una manera eficiente que minimiza la manipulación de la muestra, minimizando de este modo los cambios en el estado nativo del tejido. Una vez que las muestra...

Nuestro conocimiento de la ultraestructura de células proviene principalmente de microscopía electrónica, que puede resolver detalles en el intervalo de unos pocos nanómetros 1. A pesar de ser tan poderoso en la resolución TEM no se considera fácil de usar, como preparación de la muestra requiere mucho tiempo y protocolos laboriosas, y exige cierta experiencia del practicante. Fijación tradicional de las muestras ha combinado el uso de aldehídos y tetróxido de osmio antes del procesamiento adicional que incluye la deshidratación, incrustación de resina y luego en seccionar para producir secciones ultra-delgada que se tiñen con metales pesados. Sin embargo, se sabe que la fijación química puede producir artefactos incluyendo la agregación de proteínas y la pérdida de lípidos 1, y cambios a las membranas que afectan en última instancia varios compartimentos celulares 2. Estos artefactos se atribuyen en gran parte a la lenta tasa de fijación y deshidratación a temperatura ambiente 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Criofijación por alta presión congelación (HPF) evita la mayoría de los artefactos causados ​​por la fijación química. El principio de criofijación es que disminuye el punto de congelación del agua por 20 grados, se ralentiza la nucleación y crecimiento de cristales de hielo y aumenta la viscosidad del agua en una muestra biológica de modo que los constituyentes celulares son esencialmente inmovilizadas 6, 7. HPF disminuye un la temperatura de la muestra a la de nitrógeno líquido, a muy alta presión (210 MPa o 2.100 bar) en milisegundos. Cuando se hace correctamente HPF previene la formación de grandes cristales de hielo que pueden causar grandes daños a ultraestructura celular. HPF se puede utilizar para fijar muestras de 100-200 micras de espesor en concentraciones típicas de solutos biológicos 7. Hay numerosas opiniones sobre la física y los principios subyacentes HPF, por ejemplo, 1, 7, 8. Después de HPF, las muestras se incubaron a temperatura baja (-78,5 ° C a -90 y# 176; C) en presencia de disolvente que contiene fijadores químicos líquidos orgánicos como tetróxido de osmio, generalmente para unos pocos días. A esta baja temperatura, el agua en la muestra se sustituye por el disolvente orgánico, típicamente acetona o metanol 1, 9. Por lo tanto, este proceso se denomina sustitución de congelación (FS). La muestra se calentó gradualmente y durante este tiempo se fija, por lo general con tetróxido de osmio y acetato de uranilo 9. La reticulación a bajas temperaturas tiene la ventaja de la fijación de moléculas que están inmovilizadas 1. FS, por tanto, produce muestras de calidad superior en comparación con los fijados por la fijación química convencional a temperatura ambiente, en particular, que resulta en una mejor conservación ultraestructural, mejor conservación de la antigenicidad y la reducción de la pérdida de los componentes celulares no unidas 10, 11. La mayoría de FS se lleva a cabo durante períodos de tiempo largos, normalmente de hasta varios días. Esto es particularmente true para las plantas muestras 12, 13, 14. Un reciente protocolo desarrollado por McDonald y Webb reduce en gran medida el tiempo de FS desde varios días hasta unas pocas horas 15. En su procedimiento de rápida sustitución de congelación (QFS), FS se lleva a cabo más de 3 horas, mientras que en el FS súper rápidas (SQFS) muestras se procesan en 90 minutos. La calidad de las muestras producidas por estos métodos es comparables a los generados por los protocolos de FS tradicionales. Hemos adoptado el protocolo QFS para el procesamiento posterior de las muestras de plantas después de HPF. Esto ha demostrado ahorrar no sólo tiempo, sino también dinero, como QFS y SQFS utilizan equipos de laboratorio común en lugar de las costosas máquinas FS disponibles comercialmente. Los tejidos vegetales son a menudo muy difícil de preparar para TEM. En promedio, las células vegetales son más grandes que cualquiera de las células bacterianas o de animales. La presencia de cutícula cerosa hidrófobo, paredes celulares gruesas, grandes vacuolas llenas de agua que contienen ácidos orgánicos, hidrolasas y c fenólicocomuestos que pueden ocupar hasta el 90% del volumen total de células 16, y la presencia de espacios aireados disminuye gravemente la conductividad de calor del sistema 17. Además, en el caso de las plantas, el espesor de la muestra casi siempre supera 20 m, el límite para el uso de la fijación química. En estos espesores, la baja conductividad de calor de agua evita una tasa de congelación más de -10 000 ° C / seg en el centro de la muestra. Se requiere que la tasa para evitar la formación de hielo hexagonal perjudicial (cristales de hielo con una densidad más baja y más grande que de 10 a 15 nm) 8. Juntos, estos presentan desafíos tanto a congelación adecuada de la muestra y FS posteriores. No obstante, criofijación es el mejor método para la fijación de muestras de plantas. Aquí se presenta un protocolo para HPF-QFS de muestras de tejidos vegetales. Se centra en la especie modelo Arabidopsis thaliana, pero también se ha utilizado con Nicotiana benthamiana. Los resultados típicos demuestran que HPF-QFS produce samples de calidad comparable a la tradicional HPF-FS en una fracción del tiempo. Con los ajustes adecuados, este protocolo puede usarse también para otras muestras biológicas relativamente gruesas.

<table><tbody><tr><td>Máquina de congelación de alta presión Wohlwend HPF Compact 02 Technotrade</td><td>International, Inc</td><td>HPF02</td><td>Con osciloscopio integrado para mostrar las curvas de congelación y presión; Se requiere PC (no incluido) para la pantalla&nbsp; de los parámetros de congelación</td></tr><tr><td>Soporte para soportes de probetas de aluminio DN 3 x 0,5 mm</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras, P=1.000, DN 3 x 0,5 aluminio, tipo A</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>241-200</td><td></td></tr><tr><td>Portadores de probetas, P=1.000, DN 3 x 0,5 aluminio, tipo B</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>242-200</td><td></td></tr><tr><td>Almacenamiento Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td><td>Gráfico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levadura</td><td></td><td></td> de panadería <td>Cuanto más viejo, mejor, para evitar la producción excesiva de gas (CO2)</td></tr><tr><td>Palillos de</td><td></td><td></td><td></td>dientes</tr><tr><td>Registrador de datos de termopar EL-USB-TC</td><td>OMEGA Engineering Inc.</td><td>OM-EL-USB-TC&nbsp;</td><td>La batería de repuesto se compra por separado</td></tr><tr><td>Sonda de temperatura</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>34505</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor 12/13 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador rotativo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-402-10</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de hojas - Harris Uni-core 2.00</td><td>Ted-Pella Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>Cera dental rosa</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos 2 ml</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secador</td><td></td><td></td><td></td>de pelo</tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Acetona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td>Varios pares</td></tr></tbody></table>

tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para microscopía electrónica de transmisión

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Dado que el microscopio electrónico de transmisión de 1940 (TEM) ha estado proporcionando los biólogos con imágenes ultra-alta resolución de los materiales biológicos. Sin embargo, debido a los protocolos laboriosos y lentos que también exigen experiencia en la preparación de las muestras libres de artefactos, TEM no se considera una técnica fácil de usar. Preparación de la muestra tradicional para TEM utiliza fijadores químicos para preservar las estructuras celulares. Congelación de alta presión es la criofijación de muestras biológicas bajo altas presiones para producir velocidades de enfriamiento muy rápidas, restringiendo así la formación de hielo, que es perjudicial para la integridad de la ultraestructura celular. Congelación de alta presión y la sustitución de congelación son actualmente los métodos de elección para la producción de la morfología de la más alta calidad en las secciones de resina para TEM. Estos métodos reducen al mínimo los artefactos normalmente asociados con el procesamiento convencional para TEM de secciones delgadas. Después de criofijación el agua congelada en la muestra se sustituye con el líquidodisolvente orgánico a bajas temperaturas, un proceso llamado sustitución de congelación. Sustitución Freeze se lleva a cabo normalmente durante varios días en dedicado, equipos costosos. Una reciente innovación permite que el proceso se completará en tres horas, en lugar de los habituales dos días. Esto es seguido por varios días más de preparación de la muestra que incluye la infiltración y la incrustación en resinas epoxi antes de seccionar. Aquí se presenta un protocolo que combina la congelación de alta presión y la sustitución de congelación rápida que permite la fijación de la muestra planta para llevar a cabo en cuestión de horas. El protocolo puede adaptarse fácilmente para trabajar con otros tejidos u organismos. Los tejidos vegetales son de especial preocupación debido a la presencia de espacios aireados y vacuolas llenas de agua que impiden la congelación sin hielo de agua. Además, el proceso de fijación química es especialmente larga en las plantas debido a las paredes celulares que impiden la penetración de los productos químicos a lo profundo dentro de los tejidos. Los tejidos de plantas son, por lo tanto particcialmente difícil, pero este protocolo es confiable y produce muestras de la más alta calidad.

Los resultados presentados a continuación han sido obtenidos utilizando un Wohlwend compacto 02 para HPF (Figura 1A). Una gran ventaja de este instrumento es la facilidad de uso de los portadores de muestra y sus titulares. Si se utilizan otros instrumentos, McDonald recomienda que dos usuarios deben llevar a cabo la preparación de la muestra y HPF, una preparación de las muestras, mientras que el otro hace la congelación y traslado al FS crioviales 9. Sin embargo, la Wohlwend espécimen trans...

Obtener imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta calidad es un desafío, especialmente en el caso de las células vegetales, que tienen abundantes vacuolas grandes llenas de agua y espacios aireados. La congelación a alta presión en tándem y la sustitución rápida por congelación reducen en gran medida el tiempo de preparación de las muestras de plantas para TEM, al tiempo que producen muestras con una excelente conservación ultraestructural.

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

El objetivo general del siguiente experimento es inmovilizar las estructuras celulares de las células vegetales mediante alta presión, congelación y sustitución por congelación rápida para su posterior visualización por microscopía electrónica de transmisión. Esto se logra preparando cuidadosamente una muestra de tejido para la congelación codificándola con un crioprotector para garantizar que el tejido se dañe mínimamente durante la congelación a alta presión. Como segundo paso, la muestra se congela rápidamente a alta presión, lo que inmoviliza los componentes celulares y limita la formación de hielo cristalino, lo que da como resultado células con morfología intacta.A continuación, se realiza una sustitución libre rápida para sustituir el agua celular por disolventes orgánicos e introducir fijadores como el tetróxido de osmio, uniendo y estabilizando así las ultraestructuras celulares. Se obtienen resultados que muestran que la congelación a alta presión y la sustitución rápida por congelación preservan eficazmente las estructuras celulares y la morfología de las plantas mediante microscopía electrónica de transmisión. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos exist

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se ilustra aquí el uso de electrones cryotomography (TEC) para estudiar la ultraestructura de las células bacterianas en casi nativo estados, a "macromoleculares" (~ 4 nm) de resolución.

Electron Cryotomography de las células bacterianas

Se describe un método para localizar proteínas etiquetadas fluorescentemente en micrografías electrónicas. La fluorescencia se localiza primero mediante foto-activado microscopía de localización en secciones ultrafinas. Estas imágenes se alinean entonces a micrografías electrónicas de la misma sección.

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la nanotecnología.

Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

Aquí describimos un procedimiento para estudiar tejidos vegetales fracturados por congelación. Las muestras de hojas congeladas a alta presión se fracturan por congelación y se recubren de doble capa, lo que produce muestras congeladas hidratadas bien conservadas que se obtienen mediante el microscopio electrónico de criobarrido a grandes aumentos con un daño mínimo del haz.

El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Este manuscrito describe un método fácil de usar y criofijación bajo costo para la visualización de células en suspensión por microscopía electrónica de transmisión.

La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, "Flash-y-congelación", que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

Aquí mostramos cómo usar el dispositivo de congelación sándwich para la congelación rápida de especímenes biológicos, incluidas bacterias, levaduras, células cultivadas, células aisladas, tejidos animales y humanos y virus. También mostramos cómo preparar especímenes para la sección ultrafina después de una congelación rápida.

Congelación rápida utilizando un dispositivo de congelación sándwich para una buena preservación ultraestructural de especímenes biológicos en microscopía electrónica

Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.

Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Este protocolo de video ilustra cómo realizar una tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido de muestras virológicas. Para obtener resultados óptimos, las muestras se preparan mediante congelación a alta presión y posterior sustitución por congelación.

Tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido en virología: imágenes 3D de muestras congeladas a alta presión y sustituidas por congelación

Este protocolo estandariza la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para tejidos gruesos integrando la congelación a alta presión (HPF) con el método waffle, el levantamiento por haz de iones de foco criogénico (crio-FIB) y la adquisición paralela simétrica en dosis, produciendo láminas uniformemente finas y muestras vitrificadas para análisis in situ reproducibles en el hipocampo del ratón.

Flujo de trabajo de criotomografía electrónica para tejidos gruesos demostrado en hipocampo de ratón

Aprende a inmovilizar estructuras celulares vegetales mediante congelación de alta presión y sustitución rápida por congelación para microscopía electrónica de transmisión. Este método preserva la morfología intacta y minimiza artefactos.

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión (Video) | JoVE Journal

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Explorar más videos