Name: En Vitro Reconstitución de complejos captadores de luz de Plantas y Algas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprende a reconstituir complejos captadores de luz in vitro mediante la extracción de pigmentos de hojas de espinaca y la expresión de la proteína APA en E. coli. Este método permite obtener altos rendimientos de complejos pigmento-proteína con características espectroscópicas similares a las nativas.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (CEI) por una subvención inicial/consolidadora del CEI a RC y por la Fundación Holandesa para la Investigación de la Materia (FOM) a través de un programa FOM (10TM01).

1. total Pigmento Extracción de hojas de espinaca <ol><li> Homogeneizar un puñado de hojas de espinaca (~ 20 g) en 100 ml de tampón de molienda en frío (ver Tabla 1) con una batidora durante 20 segundos. </li><li> Filtrar la solución a través de una de dos capas de tela de nylon con un diámetro de poro de 20 micras y se centrifuga el filtrado a 1.500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento que contiene los cloroplastos con un artista suaves pintar pincel en 1 ml de tampón de lavado refrigerado (ver Tabla 1). Una vez que el sedimento se volvió a suspender, añadir 50 ml de tampón de lavado y centrifugar la solución a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y suavemente resuspender el precipitado (tilacoides) en 50 ml de tampón de lavado (ver la Tabla 1). </li><li> Centrifugar la solución a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante por completo. En este punto, llevar a cabo los siguientes pasos en la oscuridad, para evitar la oxidación del pigmento. </li&gt; <li> Añadir ~ 20 ml de acetona al 80% tamponada con Na 2 CO 3 (ver Tabla 1) para extraer los pigmentos. Dejar la solución en hielo durante 10 min, vórtice de vez en cuando. </li><li> Se precipitan los componentes celulares por centrifugación a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Si los pigmentos no están totalmente extraídos, el pellet tendrá un color verde y el paso 1.6 se debe repetir. </li><li> Recoger el sobrenadante en un embudo de decantación. Añadir 0,4 volúmenes de éter dietílico, agitar vigorosamente y abra la válvula para ventilar el gas. </li><li> Añadir 0,8 volúmenes de NaCl 0,33 y mezclar enérgicamente. Permitir ~ 10 min para las capas se separen. La fase de éter en la parte superior contiene los pigmentos extraídos. Retire la fase inferior clara. NOTA: Si la separación no es clara, congelar y descongelar la solución para mejorar la separación de fases. </li><li> Eliminar el éter mediante el vertido desde la parte superior del embudo de decantación en un recipiente de vidrio adecuado. Dry añadiendo una cucharada de gransulfato de sodio anhidro ular. Agitar la solución y permitir ~ 5 min para el desecante para absorber agua del éter. NOTA: Repita este paso si el sulfato de sodio aparece completamente agrupó; debe haber algunos cristales de libre flotación cuando el éter se seca suficientemente. Si se forma una capa de agua, suprimir este con una pipeta Pasteur antes de añadir sulfato de sodio anhidro adicional. </li><li> Decantar el éter a un nuevo recipiente de vidrio, dejando el sulfato de sodio sólido atrás. </li><li> Se evapora el éter en un SpeedVac giratorio o bajo una corriente de N 2. </li><li> Disolver los pigmentos completamente en 10 ml de acetona al 100%. </li><li> Diluir una pequeña cantidad (~ 3 l) en 1 ml de 80% de acetona y medir los espectros de absorción y determinar una relación de la Chl / b y la concentración de Chl con el método descrito por Porra et al. (1989) 15. </li><li> Alícuota y seque los pigmentos en un Speedvac rotatorio o bajo corriente de N2 hasta que la acetona esevaporado completamente. Guarde los pigmentos secos a -80 ° C. </li></ol> 2. Extracción de carotenoides de la espinaca <ol><li> Siga los pasos 1.1 a 1.5. En este punto, llevar a cabo los siguientes pasos en la oscuridad, para evitar la oxidación del pigmento. </li><li> Resuspender el precipitado tilacoide en ~ 50 ml de etanol 96% tamponado con Na 2 CO 3 (ver Tabla 1) para extraer los pigmentos. Dejar la solución en hielo durante 5 min. </li><li> Se precipitan los componentes celulares por centrifugación a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Si los pigmentos no están totalmente extraídos, el pellet tendrá un color verde y el paso 2.2 se debe repetir. </li><li> Recoger el sobrenadante y añadir 0,1 volumen de 80% de KOH (w / v) para iniciar la saponificación. </li><li> Deje la solución a 4 ° CO / N, bien tapado y protegido de la luz. </li><li> Recoger la solución en un embudo de separación. Añadir 1 volumen de éter dietílico y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 0,8 volumes de M NaCl 0,33 y mezclar suavemente. Permitir ~ 10 min para las capas se separen. La fase de éter de naranja en la parte superior contiene los carotenoides saponificados. Eliminar la fase inferior verde mediante el drenaje a través de la llave de paso del embudo. </li><li> Añadir 3 volúmenes de agua y mezclar suavemente para eliminar el hidróxido de potasio. Deje que las capas se separen. NOTA: Si la fase superior aparece turbia, agregue una pequeña cantidad de NaCl (por ejemplo, 3 g de NaCl en 200 ml de solución) y girar suavemente para que se disuelvan. </li><li> Eliminar la fase inferior mediante el drenaje a través de la llave de paso del embudo. </li><li> Siga los pasos 01.10 a 01.13. </li><li> Diluir una pequeña cantidad (~ 3 l) en 1 ml de 80% de acetona y medir los espectros de absorción a 440 nm en 80% de acetona. Para determinar la concentración, utilice la extinción media de coeficiente para los carotenoides (ε 440 = 255) 16 en la siguiente fórmula: coches [/ ml mg] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (camino óptico) = 1 cm. </li><li> Alícuota y seque el carotenoids en un Speedvac o bajo corriente de N2 hasta que todo dietiléter se ha evaporado. Guarde los pigmentos secos a -80 ° C. </li></ol> 3. total de pigmentos carotenoides y Extracción de Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Crecer C. reinhardtii en medio TAP sólido 17 en una placa de Petri mediante la difusión de una pequeña cantidad de cultivo líquido sobre la superficie. Crecer bajo flujo de iluminación continua de 20 mol fotos PSA m -2 s -1 hasta una capa verde de las células es visible. </li><li> Con un asa de inoculación estéril, cosecha una pequeña cantidad de C. reinhardtii del medio TAP sólida y poner las células en 500 ml de medio TAP 17 en un matraz de 1 L. Mantener el cultivo a 25 ° C con 170 rpm de agitación bajo un flujo de iluminación continua de 20 mol fotos PSA m -2 s -1. </li><li> Después de 5-6 días, la cultura debe llegar hasta el final de la fase logarítmica (6 x 10 6 células / mlo 2-2,5 densidad óptica a 750 nm). Se centrifuga el cultivo a 4.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Para la extracción total de pigmentos, siga los pasos 1.6 a 1.15. </li><li> El rendimiento de extracto total de pigmento a partir de 500 ml de cultivo de crecimiento completo de C. reinhardtii es de alrededor de 5 ml de solución con una concentración de 0,5 mg chl a + b / ml. </li><li> Para la extracción de carotenoides, siga los pasos 2.2 a 2.12. </li></ol> 4. Purificación de Cuerpos de Inclusión <ol><li> Clonar la secuencia de codificación de la proteína LHC de interés en un vector de expresión que da como resultado una C-terminal de His fusionada usando procedimientos estándar de biología molecular. Transformar este constructo en E. coli cepa huésped tal como BL21 (DE3). </li><li> Preparar tampón de lisis, tampón detergente, tampón Tritón, TE (Tabla 1), 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y medio LB 18 con los antibióticos apropiados. </li><li> Elija una single E. colonia coli que contiene el clon de expresión de una placa recién estriada en ~ 5 ml de medio LB con los antibióticos apropiados utilizando procedimientos estándar 6. Crecer a 37 ° C con agitación 220 rpm durante al menos 16 h. </li><li> Añadir 2,5 ml de la O / N de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 1 L con 250 ml de LB suplementado con el antibiótico apropiado. </li><li> Cultivar las células durante 2-3 horas (o hasta que la DO 600 es ~ 0,6) a 37 ° C a 220 rpm. </li><li> Añadir IPTG a una concentración final de 1 mM. Continuar creciendo las células a 37 ° C con 220 rpm 04.03 h. </li><li> Centrifugar la cultura durante 10 minutos a 5000 xga 4 ° C en un tubo de centrífuga previamente pesada. Descartar el sobrenadante a fondo y determinar el peso del pellet pesando de nuevo y restando el peso del tubo de centrífuga. </li><li> Resuspender el E. sedimento celular coli en 0,8 ml / g de tampón de lisis por agitación vigorosa. NOTA: Alternativamente, el sedimento de células se puede congelar a -80C para su uso posterior. Si se comienza con una bolita de helado, dejar descongelar completamente antes de añadir el tampón de lisis. </li><li> Añadir 2 mg de lisozima por gramo de células, e incubar en hielo húmedo con agitación en vórtex ocasional durante 30 min. </li><li> Añadir 20 mg / ml de DNAsa, 10 mM de MgCl 2, NaCl 1 mM, 20 mg / ml de ARNasa. Vortex y poner en hielo durante 30 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón de detergente frío por gramo de células. Mezclar bien y mantener la temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Transferir a tubos de centrífuga de 2 ml (dividida en dos tubos si es necesario). Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C para sedimentar los cuerpos de inclusión. </li><li> Añadir 1 ml de tampón frío Triton y resuspender completamente el sedimento mediante sonicación (3 pulsos x 5 seg x 50% de potencia con intervalos de 20 seg). NOTA: Tenga el tubo en un vaso de precipitados pequeño rodeado de agua con hielo para mantenerlo frío durante el tratamiento con ultrasonidos. En el caso de múltiples tubos, combinar los cuerpos de inclusión se volvieron a suspender en un tubo después de la resuspensión. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 12.000xga 4 ° C para que sedimenten los cuerpos de inclusión. </li><li> Repita el paso 4.13 y 4.14 dos veces. </li><li> Resuspender los cuerpos de inclusión en 1 ml de TE frío con sonificación para un lavado final para eliminar el tampón Triton. Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C para sedimentar los cuerpos de inclusión. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de TE frío por sonificación. </li><li> Evaluar la concentración de proteínas por métodos estándar tales como el ensayo de Bradford 19. Tienda alícuotas de los cuerpos de inclusión a -20 ° C. </li></ol> 5. Reconstitución Este protocolo produce típicamente 1-2 ml de la proteína reconstituida con un diámetro exterior de 4 cuando se mide la absorbancia en la región Qy (600-750 nm). La cantidad puede ajustarse según se desee, aunque se debe tener cuidado para mantener las proporciones adecuadas durante el procedimiento. <ol><li> Preparar las siguientes soluciones que se describen en la Tabla 1: 2x tampón de reconstitución, el 20% OG, 2 M KCl, TE. Realice el siguiente steps con poca luz. </li><li> Resuspender 800 g de cuerpos de inclusión del LHC en un total de 400 l TE en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Añadir 400 l de la 2x tampón de reconstitución y agitar brevemente. </li><li> Añadir 0,6 l de β-mercaptoetanol (14,8 M de stock) para tener una concentración final de 10 mM. Calentar la proteína durante 1 min a 98 ° C. Brevemente Vortex y lugar a TA durante 3 min. </li><li> Resuspender 500 mg del total de pigmentos de clorofila secos más 80 mg pigmentos carotenoides en 30 l 100% EtOH por agitación vigorosa durante 1 min o lugar en un baño de ultrasonido durante 1-2 minutos. </li><li> Gira la mezcla de pigmento y 30 segundos a 15.800 xga 4 ° C y confirmar que no hay pellet. Si hay un pellet, repetir vórtex y / o sonicación. IMPORTANTE: Después de la resuspensión y centrifugado, añadir inmediatamente pigmento a la proteína, o puede agregar y tendrá que volver a suspenderse de nuevo. </li><li> Poco a poco agregue la mezcla de pigmentos a la proteína enfriado mientras vortex. Continúe vórtice 5-10 sec y colocar el tubo en hielo húmedo. Tenga cuidado de no agite con demasiada fuerza ya que la proteína puede desbordar la parte superior del tubo. </li><li> Añadir 94 l de 20% de octilo β-D-glucopiranósido (OG) (concentración final 2%), vórtice brevemente y mantener en hielo 10 min. </li><li> Añadir 90 l de KCl 2 M (concentración final 150 a 200 mM), agitar brevemente y mantener en hielo 20 min. NOTA: preparación de la columna (Sección 6) se pueden iniciar en este momento. </li><li> Girar durante 10 minutos a 15.800 xga 4 ° C. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento (precipitado LDS) a un tubo de 10 ml. Mantener frío y protegido de la luz. </li></ol> 6. columna de purificación de níquel <ol><li> Preparar las siguientes soluciones según se describe en la Tabla 1: Tampón de OG, tampón de enjuague OG, tampón de elución. </li><li> Conectar una columna de Ni-Sepharose (1 ml) o equivalente a una bomba peristáltica asegurar que el aire no se mete dentro de la columna durante este paso y los pasos siguientes. </li><li> Ajuste la velocidad de tque la bomba de 1 ml / min y enjuagar la columna con 5-10 ml de agua para eliminar la solución de almacenamiento. </li><li> Equilibrar la columna con 3-4 ml de tampón de OG. </li><li> Añadir 3-4 ml de tampón de OG a la muestra de proteína y la carga a la columna. NOTA: si la proteína se ha sentado en el hielo durante más de 10 minutos después de la eliminación de LDS, girar de nuevo a 15.800 xga 4 ° C durante 1 min para eliminar cualquier precipitación LDS adicional. </li><li> Lavar la columna con 5 ml de tampón de OG. </li><li> Lavar la columna con 2 ml de tampón de enjuague OG. </li><li> Se eluye la proteína unida con 3 ml de tampón de elución. Recoger el eluido verde que contiene la proteína reconstituida. NOTA: Esto es generalmente cerca de 1 ml en total. </li></ol> 7. centrifugación en gradiente de sacarosa <ol><li> Preparar las siguientes soluciones según se describe en la Tabla 1: Solución de sacarosa, 0,06% β-DM, HEPES 0,01 M, pH 7,6. </li><li> Llenar los tubos de ultracentrífuga con la solución de sacarosa y la congelación a -20 ° CO / N or -80 ° C durante al menos 1 hora. </li><li> Retirar el tubo del congelador y dejar descongelar imperturbable a 4 ° C. NOTA: El proceso de congelación / descongelación crea un gradiente de 0,1 a 1 M de sacarosa. Un tubo de 15 ml se descongela típicamente en aproximadamente 3 h. </li><li> Retire cuidadosamente de la parte superior el mismo volumen que la fracción verde se eluyó de la columna de Sepharose de níquel en el paso 6.8. A continuación, cargue la muestra reconstituida lentamente en la parte superior para evitar molestar a la pendiente. </li><li> Se equilibran los tubos y centrifugado a 200.000 xg a 4 ° C en una ultracentrífuga utilizando un rotor de cubeta SW-41 o SW-60 oscilante durante 18 horas, ajuste para frenar la aceleración y detención sin frenos. </li><li> Retire cuidadosamente el gradiente desde el soporte del tubo con unas pinzas. Use una jeringa con una aguja larga que tiene una abertura romo para recoger la fracción de la parte superior. NOTA: Alternativamente, recoger las fracciones de la parte inferior perforando el tubo con una aguja y la recolección de gotas. </li></ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses

Las proteínas de membrana no son tan fáciles de estudiar. Aislamiento de proteínas de membrana nativas se complica por la necesidad de solubilizar la bicapa lipídica con detergentes, que puede dañar la proteína y eliminar cofactores esenciales. Estas proteínas también pueden estar presentes en niveles bajos en las membranas biológicas, o ser mezclado con proteínas estrechamente relacionadas, como en el caso de los complejos de recolección de luz, que hace que la purificación de complejos individuales difíciles. La expresión de proteínas heterólogas en E. coli y en la reconstitución in vitro ofrece la posibilidad de evitar estos problemas. In vitro reconstitución y purificación de proteínas plegadas resultados en los complejos que poseen características muy similares a las de los complejos nativos 20,21,23 y por lo tanto puede ser utilizado para estudiar complejos que no puede ser purificado hasta homogeneidad 24 - 27. Este método utiliza la espinaca, que es fácilmente attainabLe año, como una fuente para las preparaciones de pigmento total y carotenoides. Para algunas reconstituciones de proteínas nativas a las algas, se prefiere el uso de pigmentos purificados a partir de algas debido a las diferentes composiciones de pigmentos. La proporción Chl / b y la relación / Chl coche sigue siendo el mismo, independientemente de la fuente de pigmento. Es importante darse cuenta de que la eficiencia de la reconstitución es por lo general alrededor del 35% 28. Por lo tanto, es necesario eliminar los pigmentos no unido y la apoproteína desplegada de la solución después de la reconstitución. Un protocolo de purificación de dos etapas se presenta en este protocolo (ver también los resultados). Sin embargo, debe observarse que la etapa de gradiente de sacarosa no permite la separación completa de apo y holo-proteína. Para la mayoría de los análisis esto no es un problema, ya que la apoproteína no contiene pigmentos y por lo tanto no interfiere con las mediciones funcionales. Sin embargo, en caso de que sea necesario para eliminar completamente la apoproteína de la fracción que contiene el complejo reconstituido (por ejemplo, para calcular el pigmento a la estequiometría de proteína), una columna de intercambio aniónico se puede utilizar (ver Passarini et al. 2.009 29 para más detalles). La capacidad se repliegue proteínas recombinantes de recolección de luz con pigmentos aislados in vitro ofrece una oportunidad de &quot;manipular&quot; los complejos mediante la modificación de la reconstitución &quot;medio ambiente&quot; de varias maneras, cambiando así las características del complejo resultante. Por ejemplo, el cambio de la composición de pigmento durante la reconstitución puede resultar en un complejo con composición de pigmento alterada. Esta característica puede ser utilizada para estudiar la influencia diversos pigmentos tienen en la estructura y la estabilidad del complejo. Por lo general, la preparación de pigmento obtenido a partir de la espinaca tiene una relación a / b Chl de 3: 1 y una relación de / coche Chl de 2,9: 1. Esta proporción típicamente produce una proteína reconstituida con las mismas propiedades que el nAtive uno. Sin embargo, el ajuste de la relación a / b Chl por la adición de Chl purificado A o B puede influir en la unión de diferentes pigmentos debido a la variación de selectividad de los sitios de unión 30 a 33. Esto es posible porque la mayoría de los sitios de unión de pigmentos no son completamente selectivo para Chl una o Chl b, pero puede acomodar tanto, aunque con diferente afinidad 10,30,34. De manera similar, los sitios de unión de carotenoides también mostraron ser capaces de acomodar más de una especie de xantofila 8,35 - 38. Diferentes reconstituciones de CP26, otro complejo proteína-pigmento de las plantas superiores, utilizando diversas composiciones de pigmento se muestran en la Tabla 2 39. Se utilizaron estas reconstituciones para evaluar la afinidad de los sitios de unión particulares pigmentos 39. Es interesante observar que con el fin de obtener un complejo con el mismo pigmento cOMPOSICIÓN como el nativo, la Chl relación a / b de la mezcla de pigmento debe ser 3: 1. Este parece ser el caso para todos los complejos LHC de plantas superiores 20,40. La combinación de la biología molecular con la técnica de la reconstitución permite que las propiedades de un complejo Chl-unión a ser estudiados en más detalle. La importancia de los diferentes dominios de la proteína en la estabilidad y el plegamiento de los complejos, o su participación en las interacciones proteína-proteína, se han determinado truncando la apoproteína o realizar mutagénesis aleatoria 8,41 - 44. Residuos de aminoácidos Individual importantes para la coordinación de los diferentes pigmentos se pueden modificar a través de mutagénesis dirigida al sitio con el fin de analizar las propiedades de los pigmentos individuales o evaluar su contribución a la función y la estabilidad del complejo 10,28,29,45 - 52. La figura 6 muestra reconstituyeron Lhcb4 (CP29) conuna mutación de la histidina en la posición 216 53. Una comparación de la composición de pigmento de tipo salvaje y mutantes complejos muestra que la mutación induce la pérdida de una molécula de Chl a, indicando que el sitio diana acomoda una un Chl en el complejo WT. Las diferencias de los espectros de absorción de WT y mutante, en la normalización de el contenido de pigmento, también muestra las propiedades de absorción del pigmento perdido. En este caso, la diferencia se puede ver en el pico principal a 680 nm, lo que indica que la Chl a coordinado por His216 absorbe a esta longitud de onda (para más detalles sobre este mutante y las propiedades espectroscópicas ver Mozzo et al. 2008 53). Análisis de la mutación también se puede utilizar para determinar el efecto del medio ambiente sobre las propiedades espectroscópicas de los pigmentos 54. En conclusión, las proteínas de recolección de luz fácilmente se pueden reconstituir in vitro resulta en pigmento protein complejos con propiedades muy similares a los complejos nativas. De esta manera, se eliminan las dificultades de aislar proteínas nativas, mientras que también la entrega de preparación de proteína con alto rendimiento y pureza en estudio. La importancia de una proporción de 3: a / b 1 Chl en la producción de un complejo auténtico se acentúa, y los ejemplos de tipo salvaje reconstituido y cachés de host local mutantes se proporcionan para ilustrar aplicaciones de la técnica.

El aparato fotosintético de las plantas y las algas incluyen proteínas integrales de membrana que se unen clorofila a (Chl a), b (CHL b) y carotenoides (coche). Estos complejos pigmento-proteína están activos en energía de la luz solar y transferir esa energía de excitación a los centros de reacción, donde se utiliza para promover la separación de la carga 2. Ellos también están involucrados en los mecanismos de retroalimentación reguladoras que protegen el aparato fotosintético de daños luz alta 3,4. Los complejos de aprovechamiento de luz (cachés de host local) se componen de una gran familia de proteínas relacionadas en plantas y algas 5. La purificación a homogeneidad de cada miembro de la familia se ha visto complicada por las propiedades químicas y físicas muy similares de los complejos. Además, los procedimientos de purificación a menudo resultan en la pérdida de pigmentos u otros cofactores potenciales, tales como lípidos. Reconstitución in vitro represents un poderoso método para superar estos problemas. El LHC asociado con el Fotosistema II (LHC-II) se reconstituyó primero in vitro por Plumley y Schmidt en 1987 1. Los investigadores extrajeron proteínas sin lípidos y pigmentos por separado de los cloroplastos de la planta, y luego combinar la proteína desnaturalizada por calor con pigmentos en presencia de litio dodecil sulfato (LDS), seguido de tres ciclos de congelación y descongelación 1. Ellos mostraron que las propiedades espectrales de los complejos LHC reconstituidos fueron muy similares a los complejos purificados a partir de plantas. La facilidad de reconstitución de los complejos de pigmento-proteína LHC, probablemente debido a alguna característica de auto-ensamblaje inherente, junto con la dificultad de aislar complejos purificados a partir de organismos, condujo a la rápida adopción del método por otros investigadores. La reconstitución de proteínas fotosintéticas sobreexpresados ​​en Escherichia coli (E. coli) se logró mediante Paulsen y sus colegas en 1990 6. En E.coli, proteínas de membrana sobreexpresados ​​son típicamente contenidos en cuerpos de inclusión, que las instalaciones de su purificación. La reconstitución se logra a través de desnaturalización por calor de los cuerpos de inclusión que contienen la proteína recombinante en presencia de LDS, seguido por la adición de pigmentos que inicia el plegado de proteínas. Plegable del complejo LHCII es un proceso de dos pasos: primero, la clorofila a se une en menos de 1 min; segundo, la clorofila b se une y se estabilizó durante varios minutos 7. Además de proporcionar una idea de la dinámica de plegado, en la reconstitución in vitro combinado con mutagénesis dirigida al sitio ha permitido la identificación de aminoácidos específicos importantes para la estabilidad (por ejemplo, 8,9) o la coordinación de pigmento (por ejemplo, 10). La manipulación de replegamiento condiciones mediante el ajuste de parámetros como la composición del pigmento o detergentes también han identificado elementos critical para plegamiento apropiado, tales como el requisito de xantofilas para el complejo LHCII (por ejemplo, 1,11). Además, la investigación de las propiedades de los pigmentos individuales unidos a los complejos ha sido posible usando complejos reconstituidos in vivo (por ejemplo, 10). El método descrito aquí comienza con el aislamiento de pigmentos (clorofilas y carotenoides) de la espinaca y la alga verde Chlamydomonas reinhardtii. La expresión y purificación de una proteína a partir de E. LHC coli en forma de cuerpos de inclusión se detalla a continuación, seguido de la reconstitución de LHC y posterior purificación por columna de afinidad de Ni. En el paso final, los complejos reconstituidos se purificaron adicionalmente por centrifugación en gradiente de sacarosa para eliminar pigmentos libres y apoproteína desplegada. Este protocolo representa un procedimiento optimizado que incorpora varias modificaciones que se han introducido por diferentes laboratorios mástiempo 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Tela de nylon&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &mu; m pores</td></tr><tr><td>Pincel de artistas suaves&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAasa</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAasa</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &beta;- D-glucopiranósido</td><td>Sigma</td><td>O8001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medio</td><td></td><td></td><td>ver referencia 17</td></tr><tr><td>LB medio</td><td></td><td></td><td>ver referencia 19</td></tr></tbody></table>

en vitro reconstitución de complejos captadores de luz de plantas y algas

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

En las plantas y las algas verdes, la luz es capturada por los complejos captadores de luz (cachés de host local), una familia de proteínas integrales de membrana que coordinan las clorofilas y carotenoides. In vivo, estas proteínas se pliegan con pigmentos para formar complejos que se insertan en la membrana tilacoide del cloroplasto. La alta similitud en las propiedades químicas y físicas de los miembros de la familia, junto con el hecho de que pueden perder fácilmente pigmentos durante el aislamiento, hace que su purificación en un estado nativo desafiante. Un enfoque alternativo para obtener preparaciones homogéneas de cachés de host local fue desarrollado por Plumley y Schmidt en 1987 1, que mostró que era posible reconstituir estos complejos in vitro a partir de pigmentos purificados y apoproteínas desplegadas, dando como resultado complejos con propiedades muy similares a la de la nativa complejos. Esto abrió el camino para el uso de proteínas recombinantes expresadas por bacterias in vitro </em&gt; reconstitución. El método de la reconstitución es potente por varias razones: (1) las preparaciones puras de los complejos individuales pueden ser obtenidos, (2) la composición de pigmento puede ser controlado para evaluar su contribución a la estructura y función, (3) las proteínas recombinantes pueden ser mutados para estudiar el funcional papel de los distintos residuos (por ejemplo, sitios de unión de pigmento) o proteína de dominio (por ejemplo, la interacción proteína-proteína, plegable). Este método ha sido optimizado en varios laboratorios y se aplica a la mayoría de los complejos captadores de luz. El protocolo descrito aquí se detalla el método de reconstituir los complejos captadores de luz in vitro utilizados actualmente en nuestro laboratorio, y ejemplos que describen aplicaciones del método se proporcionan.

Este protocolo detalla la reconstitución in vitro de complejos de recolección de luz. Estas proteínas integrales de membrana coordinan las clorofilas y los carotenoides y son responsables de recolectar luz en las plantas superiores y las algas verdes.

En Vitro Reconstitución de complejos captadores de luz de Plantas y Algas

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

El objetivo general del siguiente experimento es reconstituir in vitro complejos de proteínas de pigmentos de plantas o algas que recojan la luz. Esto se logra extrayendo los pigmentos de hojas de espinaca o cultivos de algas, y sobreexpresando el prote APA en E. coli. Como segundo paso, el prote APA se mezcla con los pigmentos para obtener un complejo reconstituido.A continuación, el complejo de proteínas pigmentarias reconstituidas se purifica a partir del exceso de pigmentos y se obtienen los resultados de proteínas desplegadas que muestran características espectroscópicas similares entre el complejo proteico pigmentario reconstituido y el nativo en función de los espectros de absorción, espectros fluorescentes y deísmo circular. La principal ventaja de este procedimiento es que nos permite obtener una cantidad relativamente alta de complejos de proteínas pigmentarias, y también manipular los complejos utilizando mezclas de proteínas y pigmentos de tipo mutado con diferentes composiciones demostrando el procedimiento será Alberto na, un estudiante graduado en el laboratorio para comenzar el procedimiento para extraer el pigmento total de las hojas de espinaca. Use una licuadora para homogeneizar un puñado de espinacas, deje aproximadamente 20 gramos en 100 mililitros de tampón de molienda en frío durante 20 segundos.Filtre la solución a través de dos capas de tela de nailon con un diámetro pobre de 20 micrómetros y centrifugue el filtrado a 1.500 Gs durante 10 minutos. A cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y agregue un mililitro de tampón de lavado en frío.Vuelva a suspender el pellet que contiene los cloroplastos con un pincel suave de artista. Una vez resuspendido el pellet, añadir 50 mililitros de lavado, tampón y centrífuga, una solución a 10.000 Gs durante 10 minutos. A cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet en 50 mililitros de centrífuga tampón de lavado, una solución a 10.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante por completo a partir de este punto.Este procedimiento debe realizarse en la oscuridad. Para evitar la oxidación de los pigmentos, agregue aproximadamente 20 mililitros de acetona al 80% tamponada con carbonato de sodio para extraer los pigmentos, deje la solución en hielo durante 10 minutos. El vórtice ocasionalmente paletea los componentes celulares por centrifugación a 12.000 Gs durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.La extracción total del pigmento debe dar como resultado una bolita blanca. Recoja la caja en un embudo separador. Añade 0,4 volúmenes de éter datílico.Agite vigorosamente y asegúrese de abrir las válvulas para ventilar el gas. Añadir 0,8 volúmenes de cloruro sódico molar punto 33 y mezclar enérgicamente. Espere aproximadamente 10 minutos para que las capas se separen.La fase éter en la parte superior contiene los pigmentos extraídos. Retire y deseche la fase inferior transparente. Retire el éter vertiéndolo desde la parte superior del embudo separador en un recipiente de vidrio adecuado.Seque el éter añadiendo una cucharada de sulfato de sodio anhidro granulado. Agite la solución y espere aproximadamente cinco minutos para que el desecante absorba el agua del éter. Cuando el éter esté suficientemente seco.Debe haber algunos cristales que floten libremente y no se aglomere el sulfato de sodio. Decantar el éter a un nuevo recipiente de vidrio, dejando el sólido de sulfato de sodio detrás de los pigmentos y secarlos en una aspiradora de velocidad rotativa hasta que la acetona se evapore por completo. Almacene los pigmentos secos a menos 80 grados centígrados.La extracción de queratinoides de las espinacas no se muestra en este video, pero los pigmentos secos también se almacenan a menos 80 grados centígrados. El complejo de recolección de luz o LHC para la reconstitución se expresó y purificó a partir de E. coli en forma de cuerpos de inclusión. Para el éxito de la reconstitución, la proporción entre las proteínas pigmentarias y la cantidad de tampón utilizada es crucial.Este procedimiento debe realizarse con poca luz. Resuspender 800 microgramos de cuerpos de inclusión del LHC en un total de 400 microlitros de te. En un tubo de fuga de dos mililitros, agregue 400 microlitros de dos x reconstitución, tampón y vórtice.Agregue brevemente 0,6 microlitros de un caldo de etanol beta mar CAPTA de 14,8 molares. Para obtener una concentración final de 10 milimolares, caliente la proteína a 98 grados centígrados durante un minuto. Agite brevemente y colóquelo a temperatura ambiente durante tres minutos.Vuelva a suspender 500 microgramos de pigmentos de clorofila secos totales, más 80 microgramos de pigmentos queratinoides en 30 microlitros de etanol al 100% mediante un vórtice vigoroso. Durante un minuto. Gire la mezcla de pigmentos a 15, 800 G a cuatro grados centígrados durante unos 30 segundos y confirme que no haya gránulos inmediatamente después del centrifugado, agregue la mezcla de pigmentos lentamente a la proteína enfriada mientras agita el vórtice.Tenga cuidado de no hacer un vórtice demasiado vigoroso, ya que la proteína puede desbordarse por la parte superior del tubo. Continúe en vórtice durante cinco a 10 segundos y luego coloque el tubo sobre hielo húmedo. Agregue 94 microlitros de 20% octal, beta D glucocida u og para obtener una concentración final de 2% Vortex brevemente y manténgalo en hielo durante 10 minutos, agregue 90 microlitros de cloruro de potasio de dos molares para obtener una concentración final de 150 a 200 micro molares.Agite brevemente y manténgalo en hielo durante 20 minutos. Girar a 15, 800 GS a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el natante SUP a un tubo de 10 mililitros sin alterar el pellet.Mantenga la natina fría y protegida de la luz. Comience este procedimiento preparando una columna SRO de níquel de un mililitro como se describe en el texto del protocolo. Agregue de tres a cuatro mililitros de tampón OG a la muestra de proteína y cargue la muestra en la columna.Enjuague la columna con cinco mililitros de tampón OG, seguidos de dos mililitros de tampón de enjuague OG. Eluir la proteína unida con tres mililitros de tampón elu. Recoge el ellu verde que contiene la proteína reconstituida.El gradiente de sacarosa se prepara como se describe en el texto del protocolo cuidadosamente eliminado de la parte superior del gradiente, el mismo volumen que el de la fracción verde aludida de la columna SROs de níquel. Cargue lentamente la muestra reconstituida en la parte superior, teniendo cuidado de no alterar el gradiente. Coloque el tubo y una balanza en un rotor de cangilón oscilante S SW 41 o SW 60 y haga girar en una ultracentrífuga a 200.000 Gs a cuatro grados centígrados durante 18 horas con aceleración lenta y deteniéndose sin interrupciones.Cuando la ultracentrífuga esté completa, use pinzas para sacar con cuidado el gradiente del soporte del tubo. La banda verde es una fracción que se va a recoger. El espectro de absorción de CP 24.Una proteína de unión a la clorofila AB reconstituida in vitro se compara con el espectro del complejo nativo. Los espectros idénticos indican una composición y organización del pigmento prácticamente idénticas. La calidad del complejo reconstituido también puede evaluarse mediante espectroscopia de fluorescencia.Dado que los pigmentos emiten fluorescencia al excitarse a diferentes longitudes de onda, la clorofila A a 440 nanómetros, la clorofila B a 475 nanómetros y zils a 500 nanómetros. Los espectros de emisiones de fluorescencia de un complejo de tipo salvaje CP 24 reconstituido y normalizado al máximo muestran una transferencia de energía eficiente de la clorofila B y los rellenos XANTHE a la clorofila A. La presencia de clorofila B no coordinada con la proteína se puede reconocer por un hombro adicional alrededor de 650 nanómetros. En cambio, la presencia de clorofila A libre conduce a una emisión adicional de alrededor de 675 nanómetros.Los espectros de emisión fluorescente a 475 nanómetros de los complejos CP 24 reconstituidos y nativos muestran un solo pico a 681 nanómetros, lo que indica que el complejo reconstituido está correctamente plegado. El CP 24 reconstituido y el complejo nativo también muestran espectros de carisma circular muy similares. Los residuos de aminoácidos individuales importantes para la coordinación de diferentes pigmentos pueden modificarse para analizar las propiedades de pigmentos individuales o evaluar su contribución a la función y estabilidad del complejo.Aquí se muestran los espectros de absorción de un tipo salvaje y mutado CP 29. La línea verde muestra las diferencias entre las dos parcelas Al tate, esta técnica que incluye el gradiente SUSE, la ultracentrifugación se podría realizar en 24 horas si se realiza correctamente.

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