Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente In Vitro El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

El objetivo general de este experimento es generar una célula presentadora de antígeno artificial asesina no celular basada en HLA IG, o K-A-A-P-C para el agotamiento de poblaciones de células T autorreactivas o no deseadas. Esto se logra uniendo primero covalentemente moléculas de HLA IG y anticuerpos monoclonales Antifa en partículas de hierro dextrano del tamaño de una célula para la generación del K-A-A-P-C funcional En el segundo paso, los K-A-A-P-C se caracterizan por citometría de flujo para garantizar su correcta funcionalidad. A continuación, los K-A-A-P-C se cargan con diferentes péptidos de interés para dirigirse a la población de células T específicas del antígeno no deseado.

En última instancia, se puede realizar un análisis de cítricos de flujo para medir la muerte mediada por antigrasa específica del antígeno de las células T por el cognado cargado. K-A-A-P-C. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando nos encontramos con problemas al trabajar en el desarrollo de una célula presentadora de antígeno asesino basada en células, mientras que, al mismo tiempo, estábamos trabajando en el desarrollo de una plataforma basada en ritmos. Tecnología para la modulación de células inmunitarias Para generar primero K-A-A-P-C, agregue 250 microlitros de perlas de epoxi de un caldo y 250 microlitros de tampón de borato recién preparado en un vial de vidrio estéril con tapa de rosca.

Coloque el vial sobre un imán para que las perlas se adhieran después de dos minutos, aspire el tampón y retire el vial del imán. Lavar las perlas una vez con otro mililitro de tampón bore eight, y luego resuspenderlas en 550 microlitros de HLA A dos IG y CD antihumano 95 MAB. Agite el vial suavemente para mezclar las perlas con los anticuerpos y luego incube las perlas en un rotador de extremo a extremo a cuatro grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente, gire las perlas durante dos minutos a 300 Gs y temperatura ambiente y vuelva a colocar el vial en el imán. Después de dos minutos, aspire el tampón de carga. Retire el vial del imán y lave las perlas en un mililitro de tampón de lavado agitando cuidadosamente.

Después del tercer lavado, gire el vial en un mililitro de tampón de lavado de perlas frescas para bloquear los sitios de unión a proteínas residuales. Al día siguiente, vuelva a girar las cuentas y vuelva a colocar el vial en el imán. Después de dos minutos, aspire el tampón de lavado.

Retire el vial del imán y agregue un mililitro de PBS al KAPC. Para comprobar la calidad de las perlas, transfiera 1,5 veces 10 a la quinta parte del K-A-A-P-C a un tubo de fax y lávelas con un mililitro de tampón de lavado de fax Resus. Suspenda el pellet de perlas en 100 microlitros del tampón de lavado y agregue un microlitro de IgG anti ratón, un PE para detectar el HLA A, dos IG y un microlitro de IG MFI TC anti ratón para detectar el CD 95 MAB antihumano.

Luego, después de una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados, lave las perlas en un mililitro de tampón de lavado Resus. Suspenderlos en 250 microlitros de tampón de lavado y leer las muestras en un citómetro de flujo para la carga de péptidos. Transfiera dos veces 10 a la séptima del K-A-A-P-C a un nuevo frasco de vidrio estéril.

Luego, después de colocar las perlas en el imán durante dos minutos, aspire el PBS y vuelva a suspender las perlas en 500 microlitros de PBS fresco que contenga cinco microgramos de péptido. Etiquete el vial con la fecha y el nombre del péptido cargado, K-A-A-P-C. A continuación, almacene el K-A-A-P-C cargado a cuatro grados centígrados durante al menos tres días para permitir una carga suficiente de péptidos en el dímero HLA A dos IG para realizar el ensayo de eliminación in vitro A-K-A-A-P-C.

Lave el péptido K-A-A-P-C cargado como se ha demostrado al menos seis veces para eliminar todo el péptido libre. A continuación, transfiera K-A-A-P-C y dos veces 10 a las células T específicas de antígeno quinto a un pocillo por muestra de una placa inferior redonda de 96 pocillos en 200 microlitros de medio de cocultivo en una proporción de uno a uno después de 48 horas de cultivo en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Transfiera las muestras a los tubos de fax correspondientes apropiados y lávelas en un mililitro de un tampón de unión nexin five.

A continuación, vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de un tampón de unión de nexina cinco y, a continuación, incube las muestras en un microlitro de un tampón de nexina cinco FITC y cinco microlitros de siete a d a temperatura ambiente. Después de 10 a 15 minutos, lavar las muestras con un mililitro de un tampón de unión de nexina cinco y volver a suspender los gránulos en 250 microlitros de un tampón de unión de nin cinco. A continuación, lea inmediatamente las muestras en un citómetro de flujo.

K-A-A-P-C muestra HLA A, dos IG y Antifa MAB al mismo tiempo, lo que, en comparación con los enfoques basados en células, no se ve alterado por la eficacia de codificación o transducción y se puede modular fácilmente durante la producción. Las K-A-A-P-C son capaces de agotar las células T específicas de antígeno in vitro cuando se cargan con péptido afín, mientras que las no están cargadas. K-A-A-P-C no agota las células T, por lo que K-A-A-P-C induce la apoptosis de las células T de una manera específica del antígeno.

Posteriormente, cuando se utilizan K-A-A-P-C para el agotamiento selectivo de células T específicas de antígeno a partir de una mezcla de diferentes especificidades de células T únicamente, se produce una fuga mínima de citotoxicidad a las células T vecinas. Por lo tanto, K-A-A-P-C representa una herramienta exquisita para el antígeno in vitro, el agotamiento específico del antígeno de las células T específicas del antígeno activado humano con una aplicabilidad clínica potencial para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y rechazos de aloinjertos después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología celular exploraran nuevos enfoques para el tratamiento de enfermedades autoinmunes mediadas por células T y rechazos de trasplantes.