Name: Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende a medir la actividad de la telomerasa en tejido cerebral de ratón mediante el ensayo TRAP no radiactivo. Este método eficiente permite comparar la actividad entre diferentes regiones cerebrales y sexos.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por la tecnología de B.G. Negev y la contribución de Linda Powers.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la experimentación con animales en la Universidad Ben-Gurion (IL-39-08-2010). 1. ratón Cerebro Proteína Extracción <ol><li> Preparar 3 tubos de 15 ml cada una que contienen tubos de 5 ml de solución de Ringer y colocar en hielo. </li><li> Sacrificar el ratón usando anestesia isoflurano (PRECAUCIÓN - Utilizar campana química) durante 10-20 segundos, seguido por dislocación cervical y decapitación inmediata. </li><li> Retire el cerebro del cráneo y enjuague durante unos segundos con una solución helada de Ringer para evitar daños en el tejido cerebral. </li><li> Usando una cuchilla quirúrgica, separar el cerebelo (CR) y el tronco cerebral (BS) a partir de la corteza frontal. A continuación, separar el cerebelo de cortar el tronco cerebral y el lóbulo frontal (FL) desde la corteza frontal; quitar el bulbo olfatorio del lóbulo frontal. Coloque las regiones 3 cerebrales en los designados tubos de 15 ml. </li><li> Homogeneizar el tejido en cada tubo. Añadir frsolución de Ringer frío hielo carne de manera que cada tubo contiene el mismo volumen y centrifugar durante 7 min a 800 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 100 l de tampón de lisis CHAPS a cada tubo. Mezclar bien, haciendo pasar la solución varias veces (~ 10) a través de una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 21, y se incuba en hielo durante 30 min. </li><li> Transferir el contenido de cada tubo a un tubo nuevo micro-centrífuga y centrifugar durante 30 minutos a 13.000 x g. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y determinar la concentración de proteína usando un método previamente establecido. Guardar los extractos de proteína en alícuotas de 10 l a -80 ° C. </li></ol> 2. TRAP ensayo Preparación de los instrumentos, soluciones de reacción, y cálculos de dilución de proteínas <ol><li> Preparar número apropiado de tubos de microcentrífuga etiquetados para diluciones de extracto de proteína y tampón de reacción de la telomerasa. Realizar todas pipeteo en el protocolo utilizando puntas con filtro para evitar la contaminación. </li&gt; <li> Descongele las siguientes soluciones en el hielo: mezcla TRAP reacción 10x, primer TS, dNTPs, extractos de agua ultrapura y proteínas (véase la tabla de materiales para reactivos y reactivos concentraciones). </li><li> Diluir la solución del extracto de proteína a una concentración final de 1 g / l usando agua ultra-pura (agua ultrapura). </li></ol> 3. telomerasa Reacción <ol><li> Prepare la mezcla de reacción telomerasa añadiendo lo siguiente a un tubo de micro-centrífuga: mezcla 2 l TRAP (10x), 1 l TS imprimación (0,1 mg), 1 mu l dNTPs (10 mM) y 15 l de agua ultrapura. Para múltiples muestras, multiplicar los volúmenes mencionados por el número de muestras, más 1. </li><li> Añadir 19 l de la mezcla de reacción a cada tubo de reacción y añadir 1 l de extracto de proteína diluida (1 mg proteínas) a cada tubo para un volumen final de 20 l. </li><li> Colocar los tubos de reacción en un baño de agua pre-calentada 30 ° C durante 45 min. </li></ol> 4. PCR Reacción <ol><li> Quince millasn antes de la final de la reacción de la telomerasa, descongelar las siguientes soluciones: imprimación ACX, Titanium Taq Buffer, agua ultrapura. </li><li> Prepare la mezcla de reacción de PCR añadiendo lo siguiente a un tubo de micro-centrífuga: 2.5 l Titanium Taq Buffer (10x), 1 l imprimación ACX (0,1 mg), 2 l de agua ultrapura (1 l cuando se utiliza IC) y 0,5 l Titanium Taq Polimerasa (50x). Para múltiples muestras, multiplicar los volúmenes mencionados por el número de muestras más 2. </li><li> Añadir 6 l de la mezcla de PCR a cada tubo de PCR y añadir todo el volumen de la reacción telomerasa (20 l) a cada tubo para un volumen final de 26 l. </li><li> Inserte los tubos de PCR a un termo termociclador PCR y ejecutar el siguiente programa: - 90 ° C - 2 min. - 94 ° C - 30 seg. * - 60 ° C - 30 seg. * - 72 ° C -. 45 segundos * - 72 ° C - 2 min. Guarde los productos de PCR a -20 ° C. * = 34 ciclos </li></ol> 5. agarosa Mini-gel Preparación, Ejecución de muestras, y Gel de tinción <ol><li> Añadir 25 ml de tampón de electroforesis enfriada (TBE) y una barra de agitación a un vaso de precipitados que es 2-4 veces el volumen de la solución tampón y espolvorear lentamente en 1.125 g de la alta resolución (HR) de polvo de agarosa, mientras que la solución se agitó rápidamente . Retire la barra de agitación, cubrir el vaso con un envoltorio de plástico y perfore en un pequeño agujero para ventilación. Calentar el vaso en el microondas a potencia &quot;baja&quot; durante 3 minutos y luego cambiar a energía &quot;Alto&quot; y calentar la solución en pulsos cortos con cuidado de no causar derrames. Tenga en cuenta que cuando la espuma creada por calentamiento se convierte en burbujas grandes y desaparece después de unos segundos, la agarosa está listo. </li><li> El gel fundido a un aparato de mini-gel horizontal, después de que el gel se solidifica a temperatura ambiente permiten que el gel se enfríe durante 20 min a 4 ° C antes de su uso. </li><li> Cargue cada carril con 25 l de muestra TRAP (20 l TRAP productos de PCR y 5 l 6x tinte de carga de gel) y correr a las 110 V durante 3 horas en un cuarto frío 4 ° C. </li><li> Preparar 3x colorante de ácidos nucleicos solución de trabajo mediante la adición de 15 l 10,000x de ácido nucleico mancha, solución madre de 50 ml de agua bidestilada (DDW) con NaCl 0,1 M (0,29 g). Manchar el gel durante 20 min con agitación suave. </li><li> Utilice transiluminador UV con longitud de onda de 302 nm para ver las bandas de ADN escalera TRAP. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
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<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
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<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Análisis de la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón a través de la trampa de ensayo consiste en 4 pasos principales: 1) proteínas de extracción a partir de regiones específicas del tejido cerebral 2) TS de elongación de iniciador de telomerasa por - reacción de la telomerasa 3) amplificación de los productos de reacción de telomerasa mediante PCR 4 ) separación de los productos de PCR usando gel de agarosa de alta resolución. Este ensayo TRAP modificado aborda dos grandes dific...

La telomerasa es una ribonucleoproteína compuesta de la telomerasa transcriptasa inversa (terc), la subunidad catalítica de la telomerasa, y un componente de ARN (TERC). El papel canónica de la telomerasa es preservar la longitud adecuada de los telómeros mediante la adición de secuencias repetitivas (TTAGGG) a los extremos teloméricas, por lo tanto, la promoción de la integridad genómica, y la proliferación celular 1. Funciones adicionales se atribuyeron a de TERT en células, es decir, que confiere resistencia a la inducida por diversos agente que daña el 2 apoptosis, protege a las células madre mesenquimatosas humanas del estrés oxidativo 3, y desempeña un papel pro-supervivencia en neuronas completamente diferenciadas por su asociación a TIA1 ARN positivo gránulos 4. De TERT se expresa y se activa principalmente en las células somáticas de dividirse y en la mayoría de tipos de cáncer, mientras que los niveles de expresión y actividad de la enzima están estrechamente regulado en las células que no se dividen 5,6. Los estudios han demostrado que en el rOdent cerebro, actividad de la telomerasa se ​​convierte en indetectable por día postnatal 10, mientras que el ARNm de TERT se mantiene a niveles más bajos en la edad adulta 7. Otros estudios demostraron actividad de la telomerasa en la zona sub-ventricular adulto, el bulbo olfatorio, el hipocampo, y en el cerebelo y la corteza adultos 8. Recientemente hemos demostrado que nuevos compuestos que aumentan la expresión y la actividad de la telomerasa en las cuerdas cerebro y la médula ejercen efectos neuroprotectores en N-metil-D-aspartato (NMDA) - ratones inyectados, retrasaron el inicio y la progresión de la enfermedad esclerosis lateral amiotrófica en transgénicos SOD1 ratones y aumentó la supervivencia de las neuronas motoras en la médula espinal de estos ratones 9. Para entender completamente la función pro-supervivencia de la telomerasa en las neuronas y en el cerebro, es esencial para desarrollar un ensayo rápido simple y relativamente sensible para la detección de la actividad de la telomerasa en las diversas regiones del cerebro. El telomérica rprotocolo de amplificación EPEAT (TRAP) es un ensayo sensible conocida la combinación de la actividad de la telomerasa y canónica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este ensayo, la telomerasa añade TTAGGG repite a un sustrato de telomerasa (TS imprimación) oligonucleótido, seguido de la amplificación por PCR que genera 6 pares de bases (pb) escalera de ADN utilizando el TS cebador inverso -. ACX marcado con 32P dCTP de se utilizan para detectar la baja cantidad de productos de PCR. La escalera de ADN se resolvió por electroforesis en gel de poliacrilamida de secuenciación (PAGE). Tanto la intensidad de las bandas de ADN y la longitud de la escalera de ADN reflejan la cantidad de moléculas de enzimas activas y su procesividad respectivamente 10. Este ensayo tradicional tiene algunas dificultades importantes: El peligro de la exposición a sustancias radiactivas, grandes y difíciles de manejar PÁGINA secuenciación y el consumo de tiempo de la carrera en gel y exposición de la película del producto radiactivo (durante la noche en ambos casos). </p&gt; Este protocolo ofrece un ensayo de agarosa no radiactivo mejora mini-gel a base. La escalera del ADN 6 pb se resuelve usando gel de agarosa de alta resolución de 4,5% y la detección se logra utilizando colorante de ácidos nucleicos altamente sensibles. La combinación de alta resolución de agarosa usando mini-gel y tinción de ácido nucleico sensible ofrece fácil de manejar ensayo, elimina los peligros de la exposición a la radiactividad y se reducirá considerablemente la duración total del ensayo de 3 días a varias horas.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>Hecho manualmente, mezcle lo siguiente en UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (comprado en Sigma). Las alícuotas se congelan a -20 °C.</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de Ringer</td><td>Hecho manualmente, mezcle lo siguiente en DDW: 124 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1.25 mM de NaH2PO4&middot; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-glucosa anhidra.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Manéjelo con cuidado en una cubierta química</td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligos ordenados en formato DRY y UPW añadidos según la concentración requerida</td></tr><tr><td>ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligos ordenados en formato DRY y UPW añadidos según el requierd concentración</td></tr><tr><td>Titanio Taq Polimerasa/Tampón</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de alta resolución</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>Cualquier agarosa de alta resolución de alta calidad puede ser utilizable</td></tr><tr><td>Aparato de mini-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de ácido nucleico (GEL-RED)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td> Oligonucleótidos de ADN <td>Sigma</td><td></td><td>ordenados en formato DRY y UPW añadidos según la concentración requerida</td></tr><tr><td>Tampón de lisis CHAPS</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9852S</td><td>Agregue PMSF (inhibidor de la proteasa) a una concentración final de 1 mM</td></tr><tr><td>Agua ultrapura (UPW)</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>Ratones CD-1</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: la telomerasa no radiactivo repetir protocolo de amplificación (trap) ensayo

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

La telomerasa, una ribonucleoproteína, es responsable de mantener la longitud de los telómeros y por lo tanto la promoción de la integridad genómica, la proliferación, y la vida útil. Además, la telomerasa protege la mitocondria de estrés oxidativo y confiere resistencia a la apoptosis, lo que sugiere su posible importancia para el sobreviviente de la no-mitótico, las células altamente activos, tales como neuronas. Hemos demostrado previamente la capacidad de los nuevos activadores de telomerasa para aumentar la actividad y la expresión de la telomerasa en las diversas regiones de cerebro de ratón y para proteger a las células neuronas motoras del estrés oxidativo. Estos resultados refuerzan la noción de que la telomerasa está implicado en la protección de las neuronas de diversas lesiones. Para subrayar el papel de la telomerasa en el cerebro, que aquí comparamos la actividad de la telomerasa en el cerebro de ratones macho y hembra y su dependencia de la edad. Ensayo TRAP es un método estándar para la detección de actividad de la telomerasa en varios tejidos o líneas celulares. Aquí se demuestra el anásis de la actividad de la telomerasa en tres regiones del cerebro de ratón por no desnaturalizante de extracción de proteínas utilizando CHAPS tampón de lisis seguido por modificación del ensayo TRAP estándar. En este ensayo de 2 pasos, la telomerasa endógena se alarga un sustrato específico de la telomerasa (cebador TS) mediante la adición de 6 repeticiones TTAGGG pb (reacción de la telomerasa). Los productos de reacción de telomerasa se amplifican por reacción PCR crear una escalera de ADN de incrementos de 6 pb. El análisis de la escalera de ADN se realizó por electroforesis en gel de agarosa de alta resolución 4,5% seguido de tinción con colorante de ácidos nucleicos altamente sensibles. En comparación con el ensayo TRAP tradicional que utilizan marcado con 32P radiactivo dCTP de para la detección de ADN y la electroforesis en gel de poliacrilamida para la resolución de la escalera del ADN, este protocolo ofrece un ahorro de ensayo TRAP para evaluar la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón, lo que demuestra la capacidad de tiempo no tóxica detectar diferencias en telomerasactividad de correo en los distintos región del cerebro del ratón hembra y macho.

Extractos de proteínas de células enteras se han preparado desde el lóbulo frontal (FL), el tronco cerebral (BS) y el cerebelo (CR), derivado de 3 mujeres y 3 CD-1 ratones macho-1 CD en las edades de 1 y 3 meses de edad para la ensayo TRAP modificado y 3 CD-1 ratones machos a la edad de 2 meses de edad para el ensayo TRAP radiactivo. Actividad de la telomerasa se detectó en 1 mg de extracto de proteínas usando el ensayo TRAP modificado y 2 mg extracto de proteínas para el ensayo TRAP radiactivo. La detección de activida...

La telomerasa se expresa en el cerebro neonatal y también en distintas regiones del cerebro adulto. Presentamos un ensayo TRAP no tóxico que ahorra tiempo para el análisis de la actividad de la telomerasa en varias regiones del cerebro del ratón y la detección de diferencias en la actividad de la telomerasa entre los cerebros de ratones machos y hembras.

Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de la telomerasa en el tejido cerebral normal. Esto se logra preparando primero extractos de proteínas de células enteras de varios tejidos cerebrales como fuente de una enzima telomerasa activa. El segundo paso es agregar cantidades equivalentes de los extractos de proteínas a una mezcla específica de reacción de telomerasa que contiene el sustrato y los nucleótidos necesarios para la actividad de la telomerasa.A continuación, los productos de la reacción de la telomerasa se amplifican por PCR y se analizan mediante electroforesis en gel de aros de alta resolución. El paso final es visualizar los productos de la reacción de la telomerasa amplificada tiñendo el gel aros con un agente de tinción de ADN altamente sensible, en última instancia, los resultados de este ensayo del protocolo de amplificación repetida de thoma ray muestran un incremento de seis pares de bases, escaleras de ADN equivalentes a la actividad de thoma ray en varios tejidos cerebrales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como un ensayo de trampa radiactiva o kits de ensayo de trampa comerciales, es que este protocolo ofrece una alternativa relativamente eficiente en términos de tiempo y costo.Aunque este método puede proporcionar información sobre la actividad en el tejido cerebral, también se puede aplicar a cualquier otro tejido vivo o cultivo celular. Antes de comenzar este procedimiento, prepare tres tubos de 15 mililitros cada uno que contengan cinco mililitros de solución de ringer. Coloque los tubos en hielo después de extraer el cerebro de un ratón sacrificado.Enjuague el cerebro durante unos segundos con una solución helada de timbre para evitar daños en el tejido cerebral. Con una cuchilla quirúrgica, separe el cerebelo y el tronco encefálico de la corteza frontal. A continuación, separa el cerebelo del tronco encefálico.Retire el bulbo olfatorio del lóbulo frontal y corte el lóbulo frontal de la corteza frontal. Coloque las tres regiones del cerebro en los tubos designados de 15 mililitros, homogeneice el tejido en cada tubo. A continuación, agregue una solución de timbre helada fresca para que cada tubo contenga el mismo volumen y centrifugue durante siete minutos a 800 veces G, retire el sobrenadante y agregue 100 microlitros de rodajas de chap.Tampón a cada tubo. Mezcle bien pasando la solución unas 10 veces a través de una jeringa de un mililitro con un fideo de calibre 21 e incube en hielo durante 30 minutos. Después de 30 minutos, transfiera el contenido de cada tubo a un nuevo tubo de microcentrífuga y centrifugue durante 30 minutos.A 13.000 veces, G, transfiera el supinato a un nuevo tubo de microcentrífuga. Después de determinar la concentración de proteínas mediante un método previamente establecido, almacene los extractos de proteínas en alícuotas de 10 microlitros a menos 80 grados centígrados. Comience esta parte del protocolo preparando el número apropiado de tubos de microcentrífuga marcados para las diluciones de extracto de proteínas y el tampón de reacción de telomerasa para las siguientes soluciones en hielo.10 x mezcla de reacción de trampa DS primer dn tps, agua ultrapura y extractos de proteínas diluyen la solución del extracto de proteínas hasta una concentración final de un microgramo por microlitro. Con agua ultrapura, realice todo el pipeteo con puntas de filtro para evitar la contaminación o la reacción de los telómeros. Cada muestra requiere una mezcla de reacción de telómeros que consta de dos microlitros de mezcla trampa, un microlitro de cebador TS, un microlitro de DN NTP y 15 microlitros de agua ultrapura para múltiples muestras.Multiplique estos volúmenes por el número de muestras más uno, agregue 19 microlitros de la mezcla de reacción MASE a cada tubo de reacción, seguido de un microlitro del extracto de proteína diluido. Para un volumen final de 20 microlitros, coloque los tubos de reacción en un baño de agua precalentada a 30 grados centígrados durante 45 minutos. 15 minutos antes del final de la reacción Thres, prepárese para la amplificación de los productos de la reacción Thres aplicando las siguientes soluciones, un cebador CX, un tampón de titanio y agua ultrapura.Cada muestra requiere una mezcla de reacción de PCR que consta de 2,5 microlitros de tampón tecnológico de titanio, un microlitro de un cebador CX, dos microlitros de agua ultrapura y 0,5 microlitros de polimerasa tecnológica de titanio para muestras múltiples. Multiplique estos volúmenes por el número de muestras más dos. Agregue seis microlitros de la mezcla de reacción de PCR a cada tubo de PCR y agregue todo el volumen con la reacción de masa a cada tubo.Para un volumen final de 26 microlitros, inserte los tubos de PCR en un termociclador de PCR y ejecute el siguiente programa, 90 grados centígrados durante dos minutos, seguido de 34 ciclos de 94 grados centígrados durante 30 segundos. 60 grados centígrados durante 30 segundos y 72 grados centígrados durante 45 segundos. Y dos minutos finales a 72 grados centígrados.Cuando se complete la reacción de PCR, almacene los productos de PCR a menos 20 grados centígrados. Para preparar las rosas de huevo para lanzar el mini gel, primero agregue 25 mililitros de tampón de electroforesis TBE enfriado y una barra agitadora a un vaso de precipitados que tenga de dos a cuatro veces el volumen de la solución tampón y comience a agitar. A continuación, espolvorea lentamente 1.125 gramos del polvo aros de alta resolución.Mientras la solución se revuelve rápidamente, retire la barra de estrella. Cubra el vaso de precipitados con una envoltura de plástico y perfore un pequeño orificio para ventilar. Al golpear los agros, es fundamental alcanzar el punto de ebullición para disolver los agros por completo.Asegúrese de prestar toda la atención al vaso de precipitados en el microondas para asegurarse de que la espuma generada no se derrame. Caliente el vaso de precipitados en el microondas a baja potencia durante tres minutos, luego cambie a alta potencia y caliente la solución en pulsos cortos, teniendo cuidado para evitar derrames. Mezcle el gel en un mini aparato de gel horizontal y déjelo solidificar a temperatura ambiente, después de que el gel se haya solidificado, el gel durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Antes de usar para la electroforesis, cargue cada carril con 25 microlitros de muestra de trampa y hágalo funcionar a 110 voltios durante tres horas en una cámara fría de cuatro grados centígrados mientras el gel está funcionando. Prepare una solución de trabajo de tinción de ácido nucleico de tres x nucleico añadiendo 15 microlitros de 10.000 x solución de tinción de ácido nucleico a 50 mililitros de agua bidestilada con cloruro de sodio 0,1 molar. Una vez finalizada la electroforesis de las muestras, tiñir el gel durante 20 minutos a temperatura ambiente agitando suavemente.Por último, utilice un iluminador trans UV con una longitud de onda de 302 nanómetros. Para ver la escalera de trampas, se detectó la actividad de los telómeros de las bandas de ADN en regiones del cerebro del ratón mediante los ensayos de trampa tradicionales y modificados. Se observó una mejor visualización y resolución de los productos de ADN de los telómeros con el ensayo modificado, como se ve por la longitud e intensidad de la escalera de ADN.Se observó una reducción gradual en los productos de ADN de los telómeros cuando se utilizaron concentraciones decrecientes de extractos de proteínas en el ensayo de trampa modificado, lo que sugiere su sensibilidad para la detección de la actividad de los telómeros a concentraciones más bajas de proteínas, la detección de la actividad de la telomerasa mediante el ensayo modificado en tres regiones cerebrales de ratones hembra y macho de un mes de edad no mostró diferencias significativas. Sin embargo, en ratones de tres meses de edad, se muestra una mayor actividad de telomerasa en el lóbulo frontal y el tronco encefálico en comparación con el cerebelo, como lo revela la intensidad de las bandas de ADN y la longitud de la escalera de productos de ADN. Durante la transición del ratón a la edad adulta, la actividad de la raya thoma aumenta en el lóbulo frontal y disminuye en el tronco encefálico y el cerebelo.La actividad de los telómeros también parece ser mayor en el lóbulo frontal en las mujeres. En contraste con la mayor actividad de los telómeros en el tronco encefálico y el cerebelo en los hombres, una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis o siete horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar fácilmente la actividad de thoma en el tejido de su elección.

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El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis se puede utilizar para analizar y cuantificar la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina dentro de un lugar específico de la SPE. El kit distingue 5-MC de 5 HMC por la adición de glucosa al grupo hidroxilo de la 5-HMC a través de una reacción enzimática utilizando β-glucosiltransferasa (T4-BGT). Cuando el 5-HMC se produce en el contexto de las CCGG, esta modificación convierte un sitio escindible MspI a un sitio no escindibles.

Alta sensibilidad de detección de 5 hidroximetilcitosina en el tejido cerebral Balb / C

Un método preciso, breve, sofisticado y barato se describe que evalúa la longitud del telómero en múltiples tejidos y especies utilizando QRT-PCR. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

La longitud del telómero y la actividad de la telomerasa, una Yin y Yang de la senescencia celular

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

Los telómeros y la telomerasa juegan un papel esencial en el envejecimiento y la tumorigénesis. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo generar dos alelos knock-in de telomerasa inducibles en murinos y cómo utilizarlos en los estudios de degeneración/regeneración de tejidos y cáncer.

Utilizando murino Inducible telomerasa alelos en los Estudios de la degeneración del tejido / Regeneración y Cáncer

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) sintetiza la DNA telomeric, pero también ARN bicatenario a través de la actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente. Aquí, describimos un análisis recién creado para detectar actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente del terc endógena.

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Aquí, presentamos un protocolo para generar clones de células de cáncer que contiene una etiqueta de secuencia de MS2 en un sola subteloméricas. Este enfoque, basándose en el sistema MS2-GFP, permite la visualización de los transcritos endógenos de telomeric repetición que contiene ARN (TERRA) de un telómero solo en las células vivas.

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

Aquí describimos un protocolo para generar un modelo murino femenino viable con inactivación cromosómica no aleatoria, es decir, el cromosoma X de herencia maternalmente está inactivo en el 100% de las células. También describimos un protocolo para probar la viabilidad, la tolerabilidad y la seguridad de la reactivación farmacológica del cromosoma X inactivo in vivo.

Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

Hemos convertido con éxito el ensayo estándar de protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) que se empleara en las reacciones de la cadena de polimerasa digital de gotas. Este nuevo ensayo, llamado ddTRAP, es más sensible y cuantitativo, lo que permite una mejor detección y análisis estadístico de la actividad de la telomerasa dentro de varias células humanas.

TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Aprende a medir la actividad de la telomerasa en tejido cerebral de ratón mediante el ensayo TRAP no radiactivo. Este método eficiente permite comparar la actividad entre diferentes regiones cerebrales y sexos.

Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo (Video) | JoVE Journal

Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo

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