Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular In Vitro
3 de octubre de 2014
Este protocolo describe el uso de palancas de silicio microescala como superficies de cultivo flexibles para la medición de la contractilidad de las células musculares in vitro. La contracción celular hace que la flexión en voladizo, que se puede medir, grabada, y se convierte en lecturas de fuerza, proporcionando un sistema no invasivo y escalable para la medición de la función contráctil in vitro.
El objetivo del siguiente experimento es medir la actividad contráctil de fibras musculares cultivadas en respuesta a la estimulación en un entorno in vitro controlado. Esto se logra mediante la colocación de placas de células musculares disociadas en voladizos de silicio a microescala e induciendo la fusión de estas células mononucleadas para formar fibras denominadas miotubos. Estos chips en voladizo que soportan células musculares diferenciadas se transfieren a un microscopio de electrofisiología modificado para soportar un láser y un fotodetector utilizado para medir la deflexión del voladizo en respuesta a la contracción muscular después de la colocación del chip en el equipo.
El láser se coloca de manera que se enfoca en la punta del voladizo y el fotodetector también se alinea para que atrape el haz desviado. Se obtienen resultados que muestran el grado de deflexión del voladizo, que es causado por la contracción muscular en respuesta a un tratamiento eléctrico o químico, proporcionando una medición directa del perfil de contracción de las células sembradas en tiempo real. En última instancia, el desplazamiento en voladizo se puede procesar para proporcionar una lectura de la fuerza. Este sistema está multiplexado para proporcionar un banco de pruebas potencial de alto rendimiento para la evaluación de cambios en la función contráctil en respuesta al tratamiento con medicamentos, enfermedades, estado o protocolos de ejercicio.
La principal ventaja de esta técnica en comparación con los métodos existentes, como la electrofisiología de la pinza de parche, es que este método de análisis funcional no es invasivo y se adapta fácilmente a estudios de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de fármacos, como la identificación de las concentraciones adecuadas de dosis-respuesta antes de la evaluación clínica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de múltiples enfermedades musculares, ya que proporciona medios para investigar el rendimiento funcional de células de diferentes fenotipos patológicos. Sin embargo, en tiempo real, este método puede proporcionar información sobre las patologías del músculo esquelético.
También se puede utilizar para otros sistemas de tejidos, como el cardíaco y el músculo liso. Esterilizado, virutas en voladizo previamente preparadas y 13 F cubreobjetos en solución de etanol al 70% y permite que se seque al aire en una campana de flujo. A continuación, coloque las virutas individuales en voladizo encima de los cubreobjetos 13 F. Dentro de una placa estándar de 12 pocillos, cubra los voladizos con el biopolímero o la modificación de la superficie optimizada para el tipo de célula que se utiliza. De acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular, el recubrimiento de la superficie tarda 30 minutos utilizando nuestro método de preparación, pero puede modificarse según el protocolo de cultivo específico del investigador.
Reese ha sido las células en su medio de crecimiento específico a la concentración deseada, luego cientos de microlitros de la suspensión celular en la superficie del voladizo, asegurando que la burbuja del medio cubra las ventanas en voladizo por completo. Transfiera la placa que contiene las virutas a una incubadora y permita que las células se adhieran durante al menos una hora después de este período de siembra. Use pinzas estériles para transferir el chip a un pozo limpio sin un cubreobjetos de 13 F y agregue un mililitro de medio de crecimiento a cada uno.
Bien devuelva la placa a la incubadora, mantenga las celdas de acuerdo con su protocolo estándar para el mantenimiento in vitro. En los cubreobjetos, coloque una placa de cultivo caliente sobre la platina de un microscopio electrofisiológico vertical. Agregue tres mililitros del medio de alimentación de células actual al microscopio calentado.
Electrodos de acero inoxidable montados en la etapa en el interior de la placa de cultivo calentada a una distancia de separación de 15 milímetros. Conéctelos a un generador de pulsos capaz de producir estimulación de campo, pulsos de diversa intensidad, frecuencia y forma de onda para permitir que el sistema produzca estimulación de campo de las células cuando sea apropiado. Atornille un láser de helio y neón montado en etapas de traslación XY a la parte inferior de la mesa del microscopio.
Luego ajuste el láser para que el rayo láser se dirija a través de la base de la placa de cultivo calentada en un ángulo de 30 grados en relación con el plano del voladizo. A continuación, un módulo fotodetector de cuadrante montado en etapas de traslación XY en la parte inferior de la etapa del microscopio. Ajuste su posición para que el rayo láser reflejado caiga en el centro de los cuatro cuadrantes.
Escriba un programa de software para controlar los actuadores lineales que escanean a través de los voladizos con referencia al diagrama de flujo proporcionado en el protocolo de texto. Encienda el hardware de análisis en voladizo y el software asociado. Inserte la etapa calentada ther mrta en el medio y espere a que marque 37 grados centígrados.
A continuación, inserte el chip en voladizo en el escenario con los voladizos orientados hacia el lado derecho del escenario. Encienda la fuente de luz del microscopio. Enfoque el microscopio para ver los bordes de los voladizos y utilice el software de control del fotodetector láser para colocar el rayo láser en la punta del voladizo, suponiendo que los voladizos estén orientados a la derecha del voladizo de la etapa.
Uno es el que se coloca en la parte superior izquierda de la matriz y los números bajan hasta 16. En la parte inferior izquierda. El voladizo 17 está en la posición superior derecha y llega hasta el 32.
En la parte inferior derecha, pulsa reproducir en el software de grabación. Coloque el fotodetector de modo que la señal lea cero en los fotogramas x e y ajustando los motores paso a paso que controlan el fotodetector. A continuación, ajuste el voladizo en una posición en el software de control del fotodetector láser.
A continuación, mueva el láser a la punta del voladizo 16. Repita el posicionamiento del fotodetector y configure la posición en voladizo 16 en el software de control del fotodetector láser. Ahora mueva el láser a la punta del voladizo 32.
Repita el posicionamiento del fotodetector y configure la posición en voladizo 32 en el software de control del fotodetector láser. Finalmente, mueva el láser a la punta del voladizo 17. Repita el posicionamiento del fotodetector y configure la posición en voladizo 17 en el software de control del fotodetector láser.
Apague la fuente de luz del microscopio y luego la luz del techo en el laboratorio. Presione grabar en el software de grabación. Configure el hardware del generador de pulsos a 40 milisegundos y pulsos de cinco voltios, una frecuencia de un hercio.
A continuación, encienda la máquina Con el software de control del fotodetector láser, configure el hardware para escanear a través de la matriz de 32 voladizos. Deteniéndose durante cinco segundos en cada uno. Cuando se complete el escaneo de los 32 voladizos, apague el estimulador.
A continuación, detenga el software de grabación y abra el archivo de datos. Examine el rastro registrado de cada voladizo. Para evidencia de actividad contráctil.
Una contracción se define como un pico. Si la deflexión es de al menos 0,1 voltios por encima de la línea de base, tome nota de cada voladizo con respuestas positivas. Retire los voladizos que no respondan del protocolo de escaneo en el software de control del fotodetector láser.
A continuación, los voladizos activos se pueden volver a escanear sin estimulación para obtener una lectura de la actividad contráctil espontánea de la célula. A continuación, agregue un compuesto terapéutico al medio para observar su efecto en la producción funcional de las células cultivadas. Después de la adición de exploraciones de ejecución compuesta con o sin estimulación eléctrica de campo amplio, se realizan evaluaciones de fatiga mediante la estimulación eléctrica de las células durante períodos prolongados, seguidas de niveles de contractilidad de exploración para medir cuánto tiempo tarda la fuerza máxima en caer por debajo de un umbral específico.
En experimentos en los que las neuronas motoras se mantienen en cocultivo con la medición muscular de la formación de la unión neuromuscular mediante el tratamiento de cocultivos en voladizo de tubos miológicos motores con un estimulante neuronal o un inhibidor sináptico y la exploración de aumentos y disminuciones en la actividad espontánea, proceda a analizar los datos de deflexión en voladizo como se detalla en el protocolo de texto. El cultivo exitoso de células contráctiles en voladizos es un procedimiento relativamente sencillo que utiliza técnicas estándar de cultivo celular. El software electrofisiológico estándar se puede utilizar para analizar los datos brutos, lo que facilita el cálculo de las propiedades funcionales relevantes, como la fuerza máxima, el tiempo hasta la fuerza máxima y el tiempo hasta la mitad de la relajación.
Los protocolos de estimulación ampliados proporcionan los medios para evaluar las tasas de fatiga en las células cultivadas, ampliando así el nivel de datos fisiológicos que se pueden obtener de este sistema. El sistema de cultivo en voladizo puede modificarse para incluir neuronas motoras en el sistema de cultivo con miotubos de músculo esquelético, a fin de permitir la evaluación de la formación de sinapsis neuromuscular in vitro. En tales culturas, las tasas de actividad contráctil espontánea se comparan con las tasas de contracción en respuesta al tratamiento con un estimulante específico de la neurona como el glutamato.
Cualquier aumento observado inducido por glutamato en las tasas de contracción sugiere la activación de neuronas cultivadas que conduce a la liberación de acetilcolina y la posterior activación del tubo mio. El tratamiento con inhibidores sinápticos como el bloqueador de los receptores de acetilcolina, que conducen al cese de la actividad inducida por el glutamato, proporciona más evidencia de la presencia de sinapsis neuromusculares funcionales en estos cultivos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar voladizos de silicio a microescala para evaluar las propiedades funcionales del músculo esquelético cultivado.
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Descripción general
Este protocolo describe el uso de voladizos de silicio a microescala como superficies de cultivo flexibles para medir la contractilidad de células musculares in vitro. La contracción celular provoca la flexión del voladizo, que puede medirse y convertirse en lecturas de fuerza, proporcionando un sistema no invasivo para evaluar la función contráctil.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Electrofisiología
Antecedentes
- Las fibras musculares pueden cultivarse in vitro para análisis experimentales.
- Los micrométricos en voladizo proporcionan un método novedoso para medir la contracción muscular.
- La medición en tiempo real de la actividad contráctil es crucial para comprender la fisiología muscular.
- Este método permite pruebas de alto rendimiento de la función muscular.
Objetivo del estudio
- Medir la actividad contráctil de fibras musculares cultivadas.
- Evaluar la respuesta de las células musculares a la estimulación eléctrica o química.
- Desarrollar un sistema escalable para evaluar la contractilidad muscular.
Métodos Utilizados
- Se siembran células musculares disociadas sobre voladizos de silicio a escala microscópica.
- Se induce a las células a fusionarse en miotúbulos para la medición de la contracción.
- Los chips de voladizo se colocan en un microscopio de electrofisiología con láser y detector de luz.
- Se mide la deflexión del voladizo en respuesta a la contracción muscular.
Resultados principales
- Los resultados indican que el grado de deflexión del micromuelle se correlaciona con la contracción muscular.
- Los datos en tiempo real proporcionan información sobre el perfil de contracción de las células musculares.
- El sistema permite la evaluación multiplexada de la función contráctil.
- Las aplicaciones potenciales incluyen la evaluación de tratamientos farmacológicos y de protocolos de ejercicio.
Conclusiones
- Este método ofrece un enfoque no invasivo para estudiar la contractilidad muscular.
- Proporciona una plataforma para el análisis de alto rendimiento de la función muscular.
- Los hallazgos pueden contribuir a la comprensión de la fisiología y la patología musculares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los sistemas de micrométricos en voladizo de silicio permiten mediciones no invasivas y en tiempo real de la función contráctil celular, proporcionando una plataforma in vitro predictiva para evaluar la eficacia y toxicidad de fármacos en tejidos musculares. Este enfoque apoya la validación temprana de objetivos y la identificación de compuestos prometedores al ofrecer datos cuantitativos y reproducibles sobre las respuestas contráctiles frente a perturbaciones farmacológicas o genéticas. El diseño de matriz multiplexada facilita el cribado de moderado a alto rendimiento, mejorando la selección de carteras y reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas en el desarrollo de terapias para músculos neuromusculares, cardíacos y lisos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de salidas funcionales directas de células musculares esqueléticas, cardíacas y lisas en respuesta a la estimulación.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación precisa y sin marcadores de la actividad contráctil como lectura fenotípica del acoplamiento al blanco.
- Valor predictivo: Genera datos de respuesta a la dosis y cinéticos que orientan la optimización de compuestos líderes y las decisiones preclínicas de avance o interrupción.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Proporciona mediciones contractiles estandarizadas y reproducibles en matrices de micromuelles multiplexadas para una evaluación consistente de compuestos.
- Escalabilidad: Permite protocolos de throughput medio a alto para evaluar cambios inducidos por fármacos en la función contractil, apoyando la eficiencia de campañas de cribado.
- Calidad de los datos: Ofrece lecturas de fuerza en tiempo real basadas en la deflexión que reducen la variabilidad y aumentan la confianza en las relaciones estructura-actividad.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Modelado de enfermedades: Permite evaluar la disfunción contráctil en células con fenotipos patológicos, apoyando la selección fenotípica para enfermedades neuromusculares y otras afecciones musculares.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Facilita la evaluación de la formación de la unión neuromuscular y la comunicación entre neuronas y músculos en sistemas de co-cultivo, aportando información para la validación del mecanismo diana.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al permitir la evaluación longitudinal del rendimiento contráctil bajo condiciones de fatiga, estimulación o exposición a compuestos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El sistema de microvoladizos se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento desde la validación temprana de dianas hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación preclínica, ofreciendo una plataforma fenotípica funcional que complementa los enfoques de cribado bioquímico y genético.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al vincular perturbaciones genéticas o farmacológicas con cambios medibles en la contractilidad celular.
- Selección: Permite la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante mediciones multiplexadas de desviación, facilitando la selección confiable de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos, incluyendo la fuerza máxima, el tiempo hasta el pico y la cinética de relajación, que ayudan a comparar la eficacia y el mecanismo de acción de los compuestos.
- Investigación Traducional: Apoya la continuidad preclínica mediante la modelización de fenotipos contractiles relevantes a enfermedades y la evaluación de la recuperación terapéutica en modelos basados en músculo.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad reutilizable y adaptable a través de diferentes tipos de células musculares y modelos de enfermedad, reduciendo el desarrollo redundante de ensayos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al medir puntos finales funcionales y fisiológicos en lugar de marcadores sustitutos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante la detección automatizada por desviación láser y formatos de matriz multiplexados.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la triage funcional temprana de compuestos, reduciendo la inversión en falsos positivos.
- Impacto en la cartera: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar información mecanicista sobre la toxicidad o eficacia contráctil antes de los estudios in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, diferenciación muscular y microscopía compatible con electrofisiología.
- Depende de instrumentación láser y foto-detectores, etapas traslacionales XY y hardware de generador de pulsos para estimulación y medición.
- Necesita estandarización entre equipos en los protocolos de siembra celular, recubrimiento de superficies y estimulación para obtener resultados reproducibles en diferentes centros.
- La adaptación a diferentes tipos de músculo (esquelético, cardíaco, liso) puede requerir optimización de los recubrimientos de superficie y condiciones de cultivo.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de un alineado cuidadoso de los componentes ópticos y la posible deriva de la señal durante grabaciones prolongadas, como se indica en el protocolo.
