Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores

Hola, soy Hel Lin, estudiante de posgrado en el Near Science Center de la Universidad de Helsinki. Hoy mis colegas y yo les mostraremos cómo realizar registros ópticos y electrofisiológicos en animales despiertos, pero por lo demás se mueven y se comportan libremente. Nuestro método crea un entorno tangible y familiar para que el ratón navegue y explore.

Durante las imágenes microscópicas o los registros electrofisiológicos de una sola célula, que requieren una fijación firme de la cabeza del animal, implantamos una ventana craneal crónica y habituamos al ratón a una jaula de casa móvil transportada por aire, que se desliza bajo las patas del animal. Durante la locomoción en una superficie plana, la jaula de la casa móvil se puede colocar debajo de un microscopio vertical estándar para obtener imágenes de dos fotones o colocarse en una configuración de electrofisiología para grabaciones de pinzas de parche en el cerebro de un ratón despierto. Todos los procedimientos experimentales presentados aquí han sido aprobados por el comité de ética local.

Implantamos ventanas craneales de acuerdo con los protocolos publicados con pequeñas modificaciones tras la implantación de la ventana craneal. Se permite que el animal se recupere durante al menos dos o tres semanas durante este período de recuperación, la ventana normalmente recupera su transparencia. Se excluyen de los experimentos los animales con signos de inflamación postoperatoria residual.

Entrenar a los animales seleccionados para un estudio para que se habitúen a la fijación de la cabeza. En la jaula de la casa móvil, manipule el ratón con calma durante cinco a 10 minutos, evitando movimientos y ruidos bruscos, luego devuélvalo a la jaula de la casa. Repita el procedimiento dos o tres veces a intervalos desiguales.

La jaula de la casa móvil permite la fijación de la cabeza sin anestesiar al animal antes de la fijación de la cabeza. Use un trapo para envolver el mouse dos o tres veces a intervalos desiguales. Asegúrate de que el animal permanezca tranquilo mientras está envuelto.

De lo contrario, repita el procedimiento hasta que el ratón esté completamente habituado a él. Comience el entrenamiento dos veces al día de los ratones en la jaula de la casa móvil al día siguiente de completar el manejo. Pesar a los animales antes de cada sesión de entrenamiento.

Los animales que muestren una pérdida de peso superior al 10% deben ser excluidos del estudio. Ajuste la posición del brazo de fijación de la cabeza para que coincida con el tamaño del animal entrenado. Conecte la entrada de aire del dispositivo de jaula de casa móvil a la salida de aire presurizado estándar del laboratorio.

Asegúrese de que la presión de aire sea suficiente para la flotación libre de la jaula de la casa transportada por aire. Comenzar el adiestramiento de los animales habituados en la jaula de la casa móvil. Inmoviliza al ratón envolviéndolo en el trapo.

Inserte el soporte metálico unido a la cabeza del animal en el brazo de fijación de la cabeza y fíjelo firmemente apretando los tornillos. Encienda el flujo de aire para hacer levitar la jaula de casa transportada por aire. Retira el trapo y deja que el ratón explore la jaula de la casa.

Durante la primera sesión de entrenamiento, los ratones pueden exhibir un comportamiento de congelación y temblor y erección de la cola. Para habituar al animal al ruido, proporcione una exposición constante a los sonidos ambientales utilizando, por ejemplo, una traducción de radio o música y habla grabadas durante todas las sesiones de entrenamiento, así como durante los experimentos. Para evitar el estrés crónico, utiliza una iluminación de luz brillante durante la primera hora de la sesión de entrenamiento.

Después de la primera hora, realice el entrenamiento en la oscuridad y use una cámara de infrarrojo cercano para monitorear el comportamiento del animal. Una vez finalizada la sesión de entrenamiento, suelte al animal del brazo de fijación de la cabeza soltando los tornillos. Regrese al animal a la jaula de origen durante al menos dos horas antes de la próxima sesión de entrenamiento.

Mantener al ratón en una jaula con dos o más ratones disminuirá el nivel de estrés. Opcionalmente, puede colocar la jaula transportada por aire junto con el animal en su jaula de origen. Esto enriquecerá el entorno y puede reforzar la estancia del animal en la jaula de la casa móvil.

Durante la última sesión de entrenamiento, los ratones están habituados a la fijación de la cabeza y deben exhibir un comportamiento sin estrés al navegar con calma alrededor de la jaula doméstica transportada por el aire. En ausencia de luz visible, la trayectoria de la locomoción del ratón se puede rastrear monitoreando los movimientos de la jaula con una cámara de infrarrojo cercano o con un mouse óptico de computadora. Durante las sesiones de entrenamiento prolongadas que duren más de una o dos horas, considere proporcionar al ratón agua potable, ya sea manualmente o usando un soporte de pipeta conectado al marco de la jaula de la casa móvil.

El siguiente diagrama resume la línea de tiempo de un estudio experimental típico. El estudio comienza con la implantación de la ventana craneal dos semanas antes de la manipulación del ratón, y continúa con ocho sesiones de entrenamiento dos veces al día. El estudio típico incluye una serie de sesiones de diagnóstico por imágenes o sesiones de grabación de pinzas de parche que se espacian en un intervalo de unas pocas horas a varios días o semanas.

Tanto los experimentos ópticos como los electrofisiológicos se pueden realizar en paralelo con estímulos cognitivos o conductuales y lecturas. La microscopía de dos fotones es una tecnología óptica no lineal única que permite la visualización en tiempo real de estructuras celulares e incluso subcelulares en capas corticales profundas del cerebro de un roedor. Para realizar un experimento de imágenes microscópicas de dos fotones, coloque un animal entrenado en la jaula de la casa móvil, ajuste los tapones para proteger la óptica del microscopio de daños accidentales.

Limpie la cubierta de vidrio de la ventana craneal para eliminar las partículas de polvo. Deje caer un líquido de inmersión sobre el cubreobjetos. Recomendamos usar una solución de visco porque el agua se evapora rápidamente.

La plataforma se puede colocar encima de una mesa óptica motorizada típica utilizando el modo de campo amplio del microscopio de fluorescencia y un filtro de emisión de paso largo. Evalúe la vasculatura cerebral y seleccione una región de interés. Para obtener una imagen de la vasculatura cortical inyectar en la vena de la cola de un animal con la cabeza fija e inmovilizada, un Dalton, Texas rojo conjugado de 70 kilos de texto Tran.

Esta secuencia de imágenes muestra una grabación de lapso de tiempo de lugares y arterias en la corteza de un ratón que se comporta mientras navega alrededor de la jaula de la casa móvil. Al trazar el perfil de las líneas trazadas a través de la luz del vaso, se pueden medir los cambios en el diámetro del vaso y la motilidad de los segmentos individuales del vaso. La tasa de flujo sanguíneo en las arterias y venas se puede medir mediante un escaneo lineal a lo largo de las líneas trazadas paralelas a la pared del vaso. Multa.

Los detalles de la morfología de las neuronas se pueden visualizar en ratones transgénicos que expresan YFP en la subpoblación de neuronas bajo el promotor de Taiwán. Estos dos Zacks comparan la estabilidad de la imagen entre animales anestesiados y despiertos. El panel lateral derecho muestra las dendritas del animal anestesiadas con una mezcla de ketamina y xilacina.

Mientras que el panel lateral izquierdo muestra una imagen de dendritas en un animal despierto caminando alrededor de la jaula de una casa móvil. La morfología individual de la columna vertebral en animales despiertos puede analizarse con la misma fiabilidad y precisión que en los ratones anestesiados. El desplazamiento del cerebro durante la carrera de los animales no suele superar de uno a un micrómetro y medio.

Estos movimientos se producen en las direcciones horizontales y muy raramente resultan en un cambio del plano de la imagen, lo que hace innecesaria la corrección de los artefactos de movimiento. En la mayoría de los casos, la capacidad de monitorear crónicamente la actividad neuronal en el cerebro vivo despierto es esencial para comprender la organización y función del sistema nervioso. Utilizando el lazo de tres ratones transgénicos, obtuvimos imágenes de la actividad neuronal espontánea en los ratones despiertos que se comportan en la jaula de la casa móvil.

Esta secuencia de imágenes de lapso de tiempo muestra ejemplos representativos de picos de calcio en cuerpos celulares neuronales, nitas y axones. Las imágenes ópticas basadas en señales intrínsecas permiten mapear la distribución espacial de los dominios funcionales para realizar un experimento de imágenes ópticas intrínsecas. Coloque al animal entrenado en la jaula casera ubicada debajo del objetivo de la cámara.

Limpie el cubreobjetos del polvo. Pon una gota de glicerol y cúbrela con un cubreobjetos redondo de cinco milímetros. Ajusta la posición de una cámara de alta velocidad.

Coloque un manipulador con un tubo de soplado de aire opuesto a la vibración contralateral. Use luces verdes para obtener imágenes del mapa de la embarcación. Enfócate más profundamente en la corteza, aproximadamente 400 micrómetros por debajo de los vasos corticales.

Coloque un filtro de paso de banda frente a la cámara e ilumine la corteza con una luz roja. Permita que el mouse se adapte a la plataforma durante al menos 30 minutos. Registre la actividad de referencia durante un episodio de seis minutos.

Estimule la vibra cada 10 segundos con bocanadas de aire durante el período total de seis minutos. Esta imagen ilustra la actividad neuronal que se propaga a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a la estimulación vibratoria a una frecuencia de 0,05 hercios. Para realizar registros electrofisiológicos de una sola célula, coloque el animal entrenado implantado con una ventana craneal invertida en la jaula de la casa móvil.

Lenta y cuidadosamente, retire la cubierta de vidrio del soporte de metal. Refresque el tampón cortical y limpie la ventana craneal de residuos con un tampón hemostático. Coloque el electrodo de tierra en el tampón cortical.

Llene la pipeta de pinza de parche con solución intracelular. Aplique una presión positiva a la pipeta de registro utilizando un micromanipulador motorizado, profundice la pipeta en la corteza y obtenga un contacto de sello giga con la celda de interés. Después de grabar, retire la pipeta, refresque el tampón cortical y cierre la ventana craneal pegándola en un cubreobjetos al soporte metálico.

El uso de una jaula doméstica transportada por aire permite combinar la imagen y la electrofisiología con paradigmas conductuales clásicos, como el aprendizaje, la rehabilitación o el comportamiento relacionado con la ansiedad. El olfato es una entrada sensorial importante para los ratones y se puede utilizar para la estimulación en pruebas de memoria y para la evaluación de la reacción a la novedad. Para realizar una prueba de habituación al olfato, coloque al animal entrenado en la jaula de la casa móvil y permita que adopte.

Durante 30 minutos, fije un trozo limpio de algodón empapado en agua del grifo a la pared interior de la jaula de la casa móvil con una cinta adhesiva de doble cara. Después de cinco minutos, reemplace el algodón limpio en la pared de la jaula de casa por uno nuevo empapado en un líquido que contenga el olor a vainilla. Repita las exposiciones de cinco minutos al olor a vainilla tres veces con intervalos de cinco minutos entre las sesiones.

Para medir el nivel de interés por el olor. Cuente el tiempo acumulado que el animal pasa mirando hacia la zona objetivo y el tiempo total de movimiento de la jaula de la casa móvil. Durante la última quinta sesión, presentar un olor socialmente significativo.

Humedece el nuevo aplicador de algodón con unas gotas de orina de ratones del sexo opuesto. Para evaluar la reacción a la novedad, divida la jaula de la casa móvil en cuatro zonas. Coloque dos piezas de algodón opuestas entre sí. Color.

Codifíquelos con marcadores en el lado externo de las paredes de la jaula de la casa durante la primera prueba. Coloque dos piezas de algodón limpias. A continuación, sustituya ambos por algodón empapado en un extracto de vainilla al 1%.

Durante la tercera prueba, coloque el algodón de vainilla en la zona número uno y el trozo de algodón empapado en un extracto de plátano al 1% en la zona. Número dos, para medir la preferencia por la ausencia de olor. Calcule el tiempo que los animales pasan frente a la ausencia de olor como porcentaje del tiempo acumulado frente a otras zonas.

Hola, soy Leo Kiro, investigador principal del Centro de Neurociencias de la Universidad de Helsinki. Espero que hayas disfrutado viendo el video y lo hayas encontrado útil. Hemos estado trabajando con doble microscopía in vivo durante los últimos cinco años, y el uso de la estética general siempre ha sido una gran preocupación porque la estética interfiere con la función cerebral, con el flujo sanguíneo y todo.

Y hoy estoy feliz de que podamos trabajar en animales despiertos y realizar experimentos de imagen microscópica estable y validar y verificar los resultados que habíamos obtenido anteriormente en animales anestesiados. Estoy seguro de que el uso de jaulas para casas móviles y los métodos que hemos presentado hoy aumentarán la relevancia de la investigación in vivo en general y conducirán a resultados nuevos e innovadores, y estoy deseando que llegue.