Name: Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Aprende a realizar grabaciones ópticas y electrofisiológicas en roedores despiertos y libres de moverse usando una jaula móvil elevada por aire. Este método permite combinar microscopía de dos fotones o técnicas de patch clamp con comportamiento natural en ratones.

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Los autores agradecen al profesor Eero Castren por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. El trabajo es apoyado por becas de la Academia de Finlandia, Centro para la Movilidad Internacional de Finlandia, y el finlandés Graduate School of Neuroscience (Programa de Doctorado Mente Cerebro y).

<ol><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li>
<li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903-912 (2001).</li>
<li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li>
<li>Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+evoked+activity+in+cortical+cells+imaged+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).</li>
<li>Fee, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+stabilization+of+electrodes+for+intracellular+recording+in+awake+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals.</a> Neuron. 27, 461-468 (2000).</li>
<li>Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).</li>
<li>Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80, 371-384 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li>
<li>Parry, T. J., McElligott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+restraining+awake+rats+using+head+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolog+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">A method for restraining awake rats using head immobilization.</a> Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).</li>
<li>Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisker+movements+evoked+by+stimulation+of+single+pyramidal+cells+in+rat+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex.</a> Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).</li>
<li>Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conventional+anesthesia+on+auditory+brainstem+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice.</a> Hearing research. 193, 75-82 (2004).</li>
<li>Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+is+the+major+target+of+sedative+concentrations+of+volatile+anaesthetics%3A+strong+depression+of+firing+rates+and+increase+of+GABAA+receptor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition.</a> The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).</li>
<li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li>
<li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li>
<li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li>
<li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li>
<li>Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+psychophysical+channels+of+whisker+deflection+in+rats+align+with+two+neuronal+classes+of+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents.</a> J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67, 1048-1061 (2010).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461, 941-946 (2009).</li>
<li>Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+vision+and+movement+combine+in+the+hippocampal+place+code%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How vision and movement combine in the hippocampal place code.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neocortical+Neurons+through+a+Chronic+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internally+mediated+developmental+desynchronization+of+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity.</a> The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).</li>
<li>Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensor.%2C+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para entender mejor la fisiología del cerebro y de la patología, la investigación se debe realizar en una variedad de niveles de complejidad de preparación, la utilización de las técnicas más apropiadas para cada preparación. En la actualidad, una amplia gama de metodologías de neurociencia (de todo el cuerpo fMRI para microscopía STED sub-orgánulo) se aplican fácilmente a los animales anestesiados, mientras que los experimentos en animales despiertos y comportándose han representado un desafío metodológico significativo. Aquí, un nuevo enfoque se describe en el animal de laboratorio, a pesar de estar firmemente fijado cabeza-, se puede mover alrededor de un homecage móviles de aire levantado y explorar su entorno tangible en condiciones sin estrés. La preparación de animales cabeza-fijo comportarse presentado aquí proporciona una serie de ventajas cruciales. En primer lugar, los datos electrofisiológicos o imágenes obtenidas con este método son sin compromisos ni por la anestesia, ni por el estrés inducido por la constricción. Posicionamiento del ratón en la casa móviljaula es rápida y no requiere anestesiar al animal, incluso de forma transitoria. En segundo lugar, la homecage aire levantado asegura la estabilidad mecánica que es necesaria para cuantificar los cambios en la morfología neuronal y fina para grabar una sola célula de la actividad electrofisiológica en animales despiertos. Por último, el diseño de la homecage móvil es más compacto en comparación con la cinta de correr esférica, permitiendo así el posicionamiento de la homecage móvil bajo un microscopio vertical estándar para dos fotones de imágenes o la grabación de patch-clamp en el cerebro de ratón despierto. Fijación de la cabeza firme en el homecage móvil requiere la implantación de un soporte de metal de cuatro alas de diseño especial, con una abertura redonda en el centro de acceso óptico o eléctrico a la región cerebral subyacente. Estos soportes metálicos están unidos al cráneo por medio de una combinación de pegamento, cemento dental y un pequeño perno atornillado en el hueso del cráneo. Este procedimiento quirúrgico se desarrolló sobre la base de un gran número de anterioridadprocedimientos publicados, y se encontró que resultar en una preparación de ventana craneal estable y reproducible. Para experimentos in vivo electrofisiológicos, una ventana en forma de luna 34, un pequeño tamaño de la craneotomía (menos de 0,5 mm) 32, y una preparación de cubiertas de vidrio perforado 35 se han utilizado. Aquí, la ventana craneal &quot;invertida&quot; se implantó con cualquiera de un gran (3,5 mm de diámetro) o pequeña (menos de 0,5 mm de diámetro) craneotomía. Minimizar el movimiento del cerebro es fundamental para las grabaciones de células individuales estables, por lo que es aconsejable realizar la craneotomía de pequeño tamaño para experimentos electrofisiológicos. Tras la implantación de la ventana craneal para los experimentos de imagen óptica, los animales se dejaron recuperar durante al menos 2 o 3 semanas, período durante el cual la ventana pierde el primero transitoriamente su transparencia y a continuación, recupera (con un rendimiento de 50-70%, dependiendo el fondo genético de la cepa de ratón). La transparencia de la ventana craneal y estabilidaddad del cemento &quot;tope&quot; dental ajustado al cráneo puede ser verificada por medio de un microscopio binocular regular y la inspección física durante el manejo animal. Al final del período de recuperación de 2-3 semanas, los animales que exhiben ningún signo de inflamación post-operativa residual o defectos mecánicos en el cemento dental deben ser excluidos de los experimentos y se termina. La edad óptima para el inicio de la formación de los ratones es de 2-4 meses (correspondientes al peso corporal de 20-40 g). En animales jóvenes, el anclaje del cemento &quot;tope&quot; dental en el cráneo puede ser poco fiable, lo que puede disminuir su capacidad de resistencia a la tensión mecánica que se impone por la locomoción del ratón de cabeza fija en el homecage móvil. Aunque los ratones masculinos y femeninos aparecen igualmente dispuestos para navegar en homecage móvil, hay una tendencia para lograr un mejor porcentaje de ventanas craneales recuperar su transparencia en ratones hembra (datos no mostrados). Por lo tanto, con el fin de to asegurar una mezcla equilibrada de los géneros en la cohorte de animales seleccionados para la imagen, la implantación de las ventanas craneales en aproximadamente el 30% de los ratones más masculina se recomienda. Las interacciones sociales son conocidos por mejorar el bienestar de los animales y reducir el estrés, por lo tanto, es aconsejable que las camadas son operadas y entrenados en paralelo y se mantienen juntos en jaulas de alojamiento en grupo. En contraste con los procedimientos publicados para la preparación cinta de correr esférica 13, el método que utiliza la homecage móvil no requiere anestesiar el ratón en el momento de la fijación de la cabeza. Esta diferencia es importante porque permite descartar la existencia de efectos residuales que incluso una breve y &quot;luz&quot; episodio anestesia es probable que tenga sobre las medidas fisiológicas obtenidas poco después. De hecho, a pesar de que en los estudios en los que la fijación de la cabeza se realiza con anestesia y los experimentos reales se iniciaron después de un breve tiempo de espera 13, no se puedeexcluir posibles efectos a largo plazo del breve episodio de anestesia en los datos experimentales. Otros estudios se han basado en la privación de agua durante la habituación sistemática de los animales a la cabeza de la fijación y utilizado recompensa agua como medio de motivar al animal a permanecer inmóvil 36. Sin embargo, el método de fijación de la cabeza basado en recompensas limita la elección de pruebas de comportamiento aplicables y, sobre todo, ocupa una de las asociaciones de estímulo-recompensa bien establecidos. En contraste, el método de la habituación ratón para cabeza de fijación en homecage móvil no requiere privación de agua y la posterior recompensa. Que complementa la homecage móvil con un sistema de distribución de agua se recomienda para los experimentos de larga duración. Las sesiones de entrenamiento de los animales y los experimentos que aquí se presentan se realizaron durante el día (08 a.m.-6 p.m.), que corresponde al período fisiológicamente pasivo para aquellos ratones que se mantienen en el marco del programa de luz de 12 horas estándar (lilos dere a las 6 de la mañana y sale a las 6 horas). Desde la toma de agua está directamente relacionada con la actividad del ratón, durante los pasivos ratones período no requieren el suministro de agua si la duración de una sesión de entrenamiento / imagen / grabación no exceda de 2 horas. Además de la fecha y la duración de las sesiones de entrenamiento, hay que abordar el tema del número óptimo de sesiones necesarias para habituar a los animales a homecage móvil. Para este fin, se usaron dos criterios para evaluar inducida por procedimientos cabeza de fijación estrés: i) la pérdida de peso, y ii) el nivel de actividad locomotora. Como se muestra en la Figura 6, la pérdida de peso alcanza el nivel promedio de 6% en el día de entrenamiento 2, y está completamente revertida por día de entrenamiento de 4 (Figura 6A). En consonancia con la dinámica de pesaje, el nivel de actividad locomotora de los animales en la cabeza-fijo se suprime el primer día de entrenamiento, pero se estabiliza por día de entrenamiento de 4 (Figura 6D). Sobre la base de estas mediciones, que sugerenciast que la duración mínima del período de formación del ratón en homecage móvil es de 4 días, como se describe en el protocolo de la presente. El uso de la, homecage móvil plana con piso aire levantado permite agregar tareas complejas (sensoriomotoras, perceptivas y cognitivas) a los paradigmas de formación para la cabeza de ratones fijo. En el presente estudio se presentan dos protocolos de pruebas de comportamiento. Ambos protocolos utilizan señales del olor y pueden combinarse con longitudinales de formación de imágenes / grabaciones en la corteza del ratón. Aunque el homecage móvil está fabricado a partir de materiales no absorbentes, todavía se tiene que tomar en cuenta las posibles interferencias entre el olor del dispositivo y olor (s) de prueba. Otro factor que puede interferir con las señales visuales / táctiles de un experimento conductual es la unión entre la pared y el inserto, lo que no es perfecto y puede, por tanto, ser percibidos por el animal como un hito. Vale la pena señalar aquí que, a fin de reducir al mínimo la angustia del animal durante tales interventions como la colocación de un algodón olor presentadoras a la pared homecage móvil, el experimentador deben practicar para realizar este tipo de intervenciones tan rápidamente como sea posible y evitar la manipulación prolongada de la jaula de carbono. Estrategias alternativas para novela presentación olor / objeto son concebibles, por ejemplo, la colocación de solución a base de hidrogel gotas o objetos (tales como virutas de alimento) en pequeños estantes unidos a la superficie interior de la pared de la jaula de carbono en la altura compatible con el posicionamiento de la cabeza del animal. Homecage Mobile permite a los animales en la cabeza-fija para llevar a cabo una amplia gama de movimientos de dos dimensiones incluyendo la locomoción horizontal, situp, el aseo, batiendo, lamiendo, nariz-poking, los movimientos de la pata delantera cualificados, y tocar la pared con las extremidades anteriores, como se ilustra en el presente estudio . Usando homecage móvil y los protocolos que aquí se presentan, los investigadores pueden estudiar el sistema neuronal sensoriomotor con un alto nivel de control sobre tanto la condición de estimulacións y los conductuales read-outs. Por otra parte, los estudios de las capacidades cognitivas en ratones despiertos se pueden realizar durante el acondicionamiento, la navegación espacial y tareas de toma de decisiones. Existen varias limitaciones prácticas de este método. En primer lugar, se necesita una cantidad significativa de aire a presión para alcanzar la potencia homecage-elevación y para llevar a cabo experimentos de larga duración. En segundo lugar, la homecage móvil en su presente aplicación es sólo 18 cm de diámetro, y por lo tanto proporciona un espacio relativamente pequeño y sencillo en comparación con la realidad virtual, donde un entorno experimental complejo puede ser diseñado sin ningún tipo de restricciones espaciales. En tercer lugar, durante la estimulación bigote y experimentos basados ​​en recompensa presentados aquí, se utilizó un dispositivo que limita la posibilidad de que la pared de contacto para el ratón. La adición de un canal de estimulación visual o sensorial externo (como un proyector de luz del ojo dirigida) requeriría el diseño de un dispositivo más ergonómico y compacto en comparación conlas soluciones de pantalla múltiple o de cúpula de proyección que se han utilizado en los experimentos de cinta rodante esféricas. En resumen, el uso de los ratones de cabeza-fijo se mueven en la homecage móviles de aire levantado facilita en gran medida los estudios que combinan niveles celulares, moleculares y de comportamiento de observación y manipulación dentro de un solo experimento. Aplicaciones específicas ilustradas aquí son imágenes microscópicas de dos fotones, las imágenes de la señal óptica intrínseca y patch-clamp grabaciones en ratones comportando no anestesiados. Se espera que este enfoque abrirá nuevos horizontes en la experimentación sobre despierto, ratón comportarse y de servir como una herramienta útil tanto para el desarrollo de fármacos e investigación básica de la función cerebral.

Un emocionante tendencia reciente en las Neurociencias es desarrollar enfoques experimentales para la molecular y celular de sondeo de las redes neuronales en el cerebro de despierto, comportándose roedores. Estos enfoques son prometedores para arrojar nueva luz sobre los procesos neurofisiológicos que subyacen a la función motora, la integración sensoriomotora, la percepción, el aprendizaje, la memoria, así como la progresión de la lesión, la neurodegeneración y enfermedades genéticas. Además, la grabación desde el cerebro de los animales despiertos es prometedora en el desarrollo de los agentes y de los tratamientos terapéuticos. Hay una conciencia creciente de que la anestesia, que se ha utilizado comúnmente en experimentos neurofisiológicos, puede afectar a los mecanismos básicos de la función del cerebro, que puede conducir a una interpretación errónea de los resultados experimentales. Por lo tanto, la ketamina anestésica ampliamente utilizada aumenta rápidamente la formación de nuevas espinas dendríticas y mejora la función sináptica 1; otra anesthet comúnmente utilizadoic isoflurano en los niveles de anestesia quirúrgica suprime completamente la actividad cortical espontánea en ratas recién nacidas y bloquea las oscilaciones husillos estallar en animales adultos 2. En la actualidad, sólo un número limitado de enfoques permiten experimentos en ratones no anestesiados por medio de dos fotones de imágenes microscópicas o patch-clamp grabaciones. Estos enfoques se pueden dividir en las preparaciones que se mueve libremente y de la cabeza-fijo. El atractivo única de una preparación de animales que se mueve libremente es que permite la evaluación de comportamiento natural, incluyendo movimientos de todo el cuerpo durante la navegación. Una forma de imagen dentro del cerebro de un roedor libremente en movimiento es para fijar un microscopio montado en la cabeza en miniatura o fibroscopio 3-5. Sin embargo, los dispositivos miniaturizados tienden a tener un rendimiento óptico limitado en comparación con la microscopía de dos fotones basado en objetivos, y no se puede combinar fácilmente con grabaciones de células enteras patch-clamp 6. La exisoluciones de picadura para la cabeza de fijación de un roedor despierto se han basado principalmente ya sea por la restricción física o 7,8 en el entrenamiento del animal para exhibir reposacabezas voluntaria 9. Otro enfoque popular es para permitir que las extremidades del animal se mueva colocándolo en, por ejemplo, una cinta de correr esférica 10; este enfoque se combina a menudo con la realidad virtual generada por ordenador. Los experimentos electrofisiológicos sobre la cabeza de ratones fijo han utilizado sobre todo las grabaciones extracelulares y se utiliza para estudiar la regulación central de la función cardiovascular 11, los efectos de la anestesia en la actividad neuronal 12, la respuesta auditiva en el tronco cerebral y el procesamiento de la información 13 14. Las grabaciones / intracelulares pioneros de células enteras en animales despiertos se realizaron en la década de 2000 y se han centrado en la actividad neural relacionada con la percepción y el movimiento 15-20. Por la misma época, se publicaron los primeros estudios de imágenes microscópicas en ratones despiertoscido, donde se utilizó microscopía de dos fotones en la corteza sensorial de ratas refrenados físicamente 7 y en los ratones que se ejecutan en una cinta de correr esférica 21. Vivo de microscopía y de electrofisiología Estudios posteriores demostraron que en una preparación de fijación de la cabeza se puede combinar con éxito con los paradigmas de comportamiento basados ​​en los movimientos de las extremidades anteriores, el reconocimiento de olores, batiendo, y lamiendo 8,22-25. Los ratones colocados en la cinta esférica pueden ser entrenados para navegar por el entorno visual virtual generado por una computadora 10,26. Grabaciones intracelulares / extracelulares demostraron que, en un animal de cabeza-fijo navegación tales entorno virtual, la activación de células de lugar del hipocampo se puede detectar 27. En un entorno virtual visual, los ratones demuestran normal de ritmo theta relacionada con el movimiento en el potencial de campo local y la precesión theta-fase durante el movimiento activo 27. Recientemente, el activit espacial y temporalpatrones xey de poblaciones neuronales se registraron ópticamente en ratones durante el trabajo tareas de decisión de la memoria en un entorno virtual 28. A pesar de haber permitido la investigación de vanguardia, el diseño de la rueda de ardilla esférica tiene varias limitaciones inherentes. En primer lugar, se requiere que el animal se mueva en una superficie ilimitada de una pelota de aire elevada rotación, lo que plantea obstáculos tangibles, tales como paredes o barreras. Esta limitación es sólo en parte compensada por la &quot;realidad virtual&quot; generada por ordenador, porque la información visual es posiblemente menos eficaz en ratones y ratas, en comparación con la entrada sensorial táctil (por ejemplo, la barba-toque o lamer), que estas especies dependen naturalmente en. En segundo lugar, la considerable curvatura de la superficie de la bola puede ser incómodo para los ratones de laboratorio que se utilizan para caminar sobre un piso plano en sus jaulas. Por último, el gran diámetro de la bola (por lo menos 200 mm para los ratones y de 300 mm para ratas) hace que el tamaño vertical de la esféricadispositivo de cinta relativamente grande. Esto hace que sea difícil de combinar cinta de correr esférica con la mayoría de las configuraciones de microscopía disponibles comercialmente, y a menudo requiere la construcción de una nueva configuración alrededor de la cinta de correr por medio de marcos de microscopio a medida. Aquí, un nuevo método se describe que un ratón de frente fijo puede moverse alrededor de un homecage móviles de aire levantado que cuenta con un suelo plano y paredes tangibles, y explorar el entorno físico en condiciones sin estrés. Este artículo demuestra los procedimientos de formación del ratón y fijación de la cabeza, y proporciona ejemplos representativos donde microscopía de dos fotones, imagenología óptica intrínseca y patch-clamp grabaciones se realizan en el cerebro de los ratones comportando despierto.

<table><tbody><tr><td>Pinzas, Acero inoxidable, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora de animales, máquina de afeitar</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binocular</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura biológico con almohadilla térmica de acero inoxidable</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla microquirúrgica roma</td><td>BD</td><td>REF </td><td></td>374769</tr><tr><td>Tubo de borosilicato con filamento</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Para la producción de pipetas de parche</td></tr><tr><td>Cámara&nbsp;</td><td>Foscam</td><td>FI8903W</td><td>Visibilidad nocturna</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>Taladros desechables</td><td>Meisinger</td><td>HP 310104001001008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinzas, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Lubricante ocular</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td>Para la protección de los ojos durante el funcionamiento y como solución de viscosa para la inmersión&nbsp;</td></tr><tr><td>Control de perforación de</td><td>foredom Foredom&nbsp;</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Micro motor Foredom</td> pieza de mano <td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Soporte metálico de cuatro alas Soporte de</td> cabeza <td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para ratones</td><td>Narishige</td><td>SG-4N</td><td>Montado en instrumento estereotáxico</td></tr><tr><td>Hemostasia Colágeno Esponja</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil&nbsp;</td><td>Láser WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pinza de apósito, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos</td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td>Extractor vertical para la producción de pipetas de vidrio</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sensapex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini tornillo</td><td>Centrostyle Ref</td><td>. 00343 s/acero M1.0x4.5</td><td></td></tr><tr><td>Mobile Homecage</td><td>Microscopio</td> de barrido láser multifotónico Neurotar <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>hisopos no tejidos, 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Tampones quirúrgicos</td></tr><tr><td>Pegamento poliacrílico</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio redondo</td><td>Microscopía electrónica Ciencias 1.5</td><td></td><td> grosor</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para animales pequeños</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris para estudiantes, rectas 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

plataforma levantado-air-plana con piso: un nuevo método para combinar comportamiento con microscopía o electrofisiología en awake moviéndose libremente roedores

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Es ampliamente reconocido que el uso de la anestesia general puede socavar la relevancia de los datos electrofisiológicos o microscópicas obtenidas del cerebro de un animal vivo. Por otra parte, la larga recuperación de la anestesia limita la frecuencia de los episodios de grabación / de formación de imágenes repetidas en estudios longitudinales. Por lo tanto, se espera que los nuevos métodos que permitan grabaciones estables de ratones comportando no anestesiados para avanzar en el campo de la neurociencia celular y cognitivas. Las soluciones existentes van desde la mera restricción física a los enfoques más sofisticados, tales como cintas de correr lineales y esféricos utilizados en combinación con la realidad virtual generada por ordenador. Aquí, un nuevo método se describe que un ratón de frente fijo puede moverse alrededor de un homecage móviles de aire levantada y explorar su medio ambiente en condiciones sin estrés. Este método permite a los investigadores para llevar a cabo las pruebas de comportamiento (por ejemplo, de aprendizaje, de habituación o una novela de reconocimiento de objetos) al mismo tiempo quede dos fotones de imágenes microscópicas y / o grabaciones de patch-clamp, todo combinado en un solo experimento. Esta-artículo de vídeo describe el uso del dispositivo de fijación cabeza de animal despierto (homecage móvil), demuestra los procedimientos de habituación de los animales, y ejemplifica un número de posibles aplicaciones del método.

El método que aquí se presenta está diseñado para imágenes microscópicas unicelulares o registros electrofisiológicos en, cabeza de ratones fijo pero por lo demás se mueven libremente y comportarse despierto. El animal puede moverse en dos dimensiones en un real (en oposición a virtual), el medio ambiente tangible y familiar, mientras que el cráneo de los animales se fija firmemente al brazo de fijación cabeza. Habituar a los ratones a la homecage móviles de aire levantada consta de 4-6 días de las sesiones de entrenamiento de 2 horas dos veces al día (Figura 1). Los animales entrenados a continuación, pueden ser utilizados en los experimentos de inmediato. Un estudio típico incluye una serie de sesiones de formación de imágenes o grabaciones de patch-clamp que están espaciados a intervalos que van desde unas horas hasta varios días o semanas. Es importante destacar que, ambas grabaciones ópticas y electrofisiológicas se pueden realizar simultáneamente con estímulos y lecturas cognitivos o de comportamiento, dentro de un solo experimento. Para evaluar la estabilidad mecánica defijación de la cabeza del ratón en la homecage móvil, se recogieron las secuencias de imágenes de los vasos corticales marcados con dextrano fluorescente conjugado y de dendritas corticales que expresan YFP mientras que los animales de experimentación navegaban el homecage móvil (Figura 2). Los desplazamientos máximos del cerebro durante la locomoción de los animales no suelen superar los 1-1,5 micras. Estos desplazamientos se produjeron en las direcciones horizontal y muy rara vez dieron como resultado un cambio detectable de la plano de la imagen, lo que hace innecesaria cualquier corrección de artefactos de movimiento. Fijación de la cabeza estable en homecage móvil permite la cuantificación de las espinas dendríticas individuales en animales despiertos con la misma fiabilidad que en ratones anestesiados. Densidad de la espina dendrítica, la morfología y la rotación pueden ser monitoreados durante los estudios longitudinales con múltiples sesiones de imagen realizadas a intervalos que van desde unas pocas horas hasta varios días o semanas. La facilidad de uso de la mobile homecage de imagen óptica funcional fue probada en la corteza somatosensorial de los ratones despiertos utilizando dos enfoques: i) microscopía de dos fotones en los ratones transgénicos Thy1-GCaMP3 y ii) de imagen de la señal óptica intrínseca en ratones de tipo salvaje. Ca 2 + de imágenes se realizó en la capa 2/3, que contiene los cuerpos celulares de muchas neuronas marcadas con fluorescencia, así como sus dendritas y axones (Figura 3). Las parcelas de tiempo-fluorescencia a lo largo de las regiones seleccionadas de interés (ROI) se muestran en la Figura 3, lo que demuestra la actividad neuronal espontánea (medida como aumento transitorio en la fluorescencia GCaMP3) durante la navegación activa del ratón en la homecage móvil. De formación de imágenes óptico basado en señales intrínsecas permite el mapeo de la distribución espacial de los dominios funcionales. Figura 4 ilustra cambios en la onda como en el nivel de oxigenación de la sangre (que reflejan la activación neuronal regional) que propagan a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a Vibrissa estimulación a la frecuencia de 0,05 Hz. Para poner a prueba la viabilidad de patch-clamp grabaciones con homecage móvil, hemos utilizado ratones C57Bl/6J 2-3 meses de edad. Layer 2/3 neuronas en la corteza somatosensorial se registraron a partir de la configuración de célula completa utilizando el modo de pinza de corriente. Grabación de Patch-clamp en el cerebro de los ratones despiertos cabeza fija en homecage móvil era esencialmente similar a cegar patch-sujeción en rodajas de cerebro. Aproximadamente el 50% de los intentos resultó en la formación de gigaseal éxito, de los cuales más de 70% produjo la grabación de la configuración de células enteras estable. No se observaron eventos de perder el contacto gigaseal debido al desplazamiento mecánico de las células. Figura 5 muestra un fragmento de 60 segundos de un tiempo de grabación actual-clamp 10-min representante correspondieron a episodios de del ratón activa (en ejecución) y pasivas (descanso) estados. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src='"/' files width='"600"'> Figura 1. El método de fijación de la cabeza de los ratones despiertos en el homecage móvil. A) Descripción general del diseño homecage móviles de aire levantado y las ilustraciones del concepto general. B) Diagrama de una línea de tiempo típica experimental. El estudio se inicia con la implantación de la ventana craneal dos semanas antes de habituar el ratón a la manipulación y embalaje, que es seguido por ocho sesiones de entrenamiento dos veces al día. El estudio típico incluye una serie de sesiones de formación de imágenes o grabaciones de patch clamp que están espaciados a intervalos que van desde unas horas hasta varios días o semanas. Ambas mediciones ópticas y electrofisiológicas se puede hacer en paralelo con los estímulos y lecturas cognitivas o de comportamiento dentro de un solo experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2. Ejemplo de dos fotones de imágenes microscópicas en ratones despiertos moviéndose alrededor del homecage móvil. A, B) vasculatura cortical, etiquetado con el dextrano conjugado con Rojo de Texas 70 kDa. El diámetro de los segmentos de buques individuales se mide mediante el trazado con el tiempo el perfil de las líneas dibujadas a través de la luz del vaso durante períodos de reposo y en funcionamiento de ratón (A). La velocidad del flujo sanguíneo en las arterias y venas se mide por la línea de exploración a lo largo de las líneas dibujadas en paralelo a la pared del vaso (B). C, d) Los detalles finos de la morfología neuronal visualizado en el cerebro de ratones transgénicos que expresan YFP en subpoblación de neuronas bajo el promotor Thy1. Reconstrucción tridimensional de las neuronas piramidales de la corteza somatosensorial del ratón (C). Las imágenes de un b dendríticasrancho adquirida en una, ratón comportarse despierto son suficientemente estables para la cuantificación de la morfología de la espina dendrítica individuo (D). E) Cuantificación de movimiento cerebral causado por los movimientos del ratón. Grandes desplazamientos de amplitud se correlacionan con períodos de funcionamiento del ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600"> Figura 3. Ejemplo de actividad de la población neuronal en despiertos ratón Thy1-GCaMP3 moverse por la homecage móvil. A) Imagen de dos fotones de la capa cortical neuronas II / III. ROI, por ejemplo se muestran los cuerpos celulares neuronales, dendritas y axones en amarillo. B) Df / F rastros de la fluorescencia GCaMP3 de ROIs mostradas en A (tiempo de serie grabado en 1.5 segundos / cuadros). C) zoom en la zona visualizada a 65 ms / frame. D) Fluorescencia de ROIs amarillas en C trazada a través del tiempo, se muestran los aumentos transitorios (rojos) en la fluorescencia GCaMP3 que corresponden a la acción Ca 2 + inducida por episodios potenciales de afluencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600"> Figura 4. Ejemplo de mapeo de la distribución espacial de las respuestas funcionales en la corteza de un ratón despierto por medio de imágenes de las señales ópticas intrínsecas. A) vista de campo brillante de los vasos sanguíneos superficiales a través de la ventana craneal. B) Mapa de la magnitud de la actividad de línea de base en Ho móvilmecage durante un episodio de 6 min. C) Mapa de la magnitud de la actividad neuronal se propaga a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a la estimulación vibrisas a una frecuencia de 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600"> Figura 5. Ejemplo de grabación de patch-clamp de células enteras en la corteza de un ratón despierto en movimiento alrededor de la homecage móvil. A) la grabación actual-clamp de una neurona en la capa cortical del ratón 2/3. A 0,5 segundos, 100 pA inyección de corriente (se indica a continuación la traza) da lugar a una explosión de los potenciales de acción. La célula mostró característico adaptación de frecuencia pico para las neuronas piramidales. B) de grabación actual-clamp Continuode la misma neurona correlacionado con la actividad del ratón 'locomotor (en rosado encima de la traza). Actividad espontánea Representante de la capa 2/3 de las neuronas en los períodos de la del ratón en reposo (C) y en funcionamiento (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600"> Figura 6. Pérdida de peso de los animales y la actividad locomotora de los ratones head-fixed/non-fixed durante las sesiones de entrenamiento en el homecage móvil. A) El peso del animal (media + SD,%), antes de las sesiones de entrenamiento. Tenga en cuenta que la pérdida de peso está totalmente revertido por la 7-8 ª sesión de entrenamiento. B) Trayectoria del ratón locomoción horizontal con respecto al homecage móvil,que fue extrapolada a partir del movimiento de seguimiento del homecage móvil durante la 8 ª sesión de entrenamiento. c) los movimientos de oruga de un ratón fijo-no la cabeza explorar la jaula redonda durante la 8 ª sesión de entrenamiento. D) Duración de la cabeza fija (círculo) y no fijos (triángulo) movimiento ratones durante 1-4 días del entrenamiento (media + SD,%). Tenga en cuenta que, en el día 4, la cabeza de ratones fija muestran ni de congelación (como en el día 1), ni la actividad locomotora excesivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este método crea un entorno tangible, familiar para el ratón para navegar y explorar durante microscópicas de imágenes o una sola célula de registros electrofisiológicos, los cuales requieren una fijación firme de la cabeza del animal.

Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Hola, soy Hel Lin, estudiante de posgrado en el Near Science Center de la Universidad de Helsinki. Hoy mis colegas y yo les mostraremos cómo realizar registros ópticos y electrofisiológicos en animales despiertos, pero por lo demás se mueven y se comportan libremente. Nuestro método crea un entorno tangible y familiar para que el ratón navegue y explore.Durante las imágenes microscópicas o los registros electrofisiológicos de una sola célula, que requieren una fijación firme de la cabeza del animal, implantamos una ventana craneal crónica y habituamos al ratón a una jaula de casa móvil transportada por aire, que se desliza bajo las patas del animal. Durante la locomoción en una superficie plana, la jaula de la casa móvil se puede colocar debajo de un microscopio vertical estándar para obtener imágenes de dos fotones o colocarse en una configuración de electrofisiología para grabaciones de pinzas de parche en el cerebro de un ratón despierto. Todos los procedimientos experimentales presentados aquí han sido aprobados por el comité de ética local.Implantamos ventanas craneales de acuerdo con los protocolos publicados con pequeñas modificaciones tras la implantación de la ventana craneal. Se permite que el animal se recupere durante al menos dos o tres semanas durante este período de recuperación, la ventana normalmente recupera su transparencia. Se excluyen de los experimentos los animales con signos de inflamación postoperatoria residual.Entrenar a los animales seleccionados para un estudio para que se habitúen a la fijación de la cabeza. En la jaula de la casa móvil, manipule el ratón con calma durante cinco a 10 minutos, evitando movimientos y ruidos bruscos, luego devuélvalo a la jaula de la casa. Repita el procedimiento dos o tres veces a intervalos desiguales.La jaula de la casa móvil permite la fijación de la cabeza sin anestesiar al animal antes de la fijación de la cabeza. Use un trapo para envolver el mouse dos o tres veces a intervalos desiguales. Asegúrate de que el animal permanezca tranquilo mientras está envuelto.De lo contrario, repita el procedimiento hasta que el ratón esté completamente habituado a él. Comience el entrenamiento dos veces al día de los ratones en la jaula de la casa móvil al día siguiente de completar el manejo. Pesar a los animales antes de cada sesión de entrenamiento.Los animales que muestren una pérdida de peso superior al 10% deben ser excluidos del estudio. Ajuste la posición del brazo de fijación de la cabeza para que coincida con el tamaño del animal entrenado. Conecte la entrada de aire del dispositivo de jaula de casa móvil a la salida de aire presurizado estándar del laboratorio.Asegúrese de que la presión de aire sea suficiente para la flotación libre de la jaula de la casa transportada por aire. Comenzar el adiestramiento de los animales habituados en la jaula de la casa móvil. Inmoviliza al ratón envolviéndolo en el trapo.Inserte el soporte metálico unido a la cabeza del animal en el brazo de fijación de la cabeza y fíjelo firmemente apretando los tornillos. Encienda el flujo de aire para hacer levitar la jaula de casa transportada por aire. Retira el trapo y deja que el ratón explore la jaula de la casa.Durante la primera sesión de entrenamiento, los ratones pueden exhibir un comportamiento de congelación y temblor y erección de la cola. Para habituar al animal al ruido, proporcione una exposición constante a los sonidos ambientales utilizando, por ejemplo, una traducción de radio o música y habla grabadas durante todas las sesiones de entrenamiento, así como durante los experimentos. Para evitar el estrés crónico, utiliza una iluminación de luz brillante durante la primera hora de la sesión de entrenamiento.Después de la primera hora, realice el entrenamiento en la oscuridad y use una cámara de infrarrojo cercano para monitorear el comportamiento del animal. Una vez finalizada la sesión de entrenamiento, suelte al animal del brazo de fijación de la cabeza soltando los tornillos. Regrese al animal a la jaula de origen durante al menos dos horas antes de la próxima sesión de entrenamiento.Mantener al ratón en una jaula con dos o más ratones disminuirá el nivel de estrés. Opcionalmente, puede colocar la jaula transportada por aire junto con el animal en su jaula de origen. Esto enriquecerá el entorno y puede reforzar la estancia del animal en la jaula de la casa móvil.Durante la última sesión de entrenamiento, los ratones están habituados a la fijación de la cabeza y deben exhibir un comportamiento sin estrés al navegar con calma alrededor de la jaula doméstica transportada por el aire. En ausencia de luz visible, la trayectoria de la locomoción del ratón se puede rastrear monitoreando los movimientos de la jaula con una cámara de infrarrojo cercano o con un mouse óptico de computadora. Durante las sesiones de entrenamiento prolongadas que duren más de una o dos horas, considere proporcionar al ratón agua potable, ya sea manualmente o usando un soporte de pipeta conectado al marco de la jaula de la casa móvil.El siguiente diagrama resume la línea de tiempo de un estudio experimental típico. El estudio comienza con la implantación de la ventana craneal dos semanas antes de la manipulación del ratón, y continúa con ocho sesiones de entrenamiento dos veces al día. El estudio típico incluye una serie de sesiones de diagnóstico por imágenes o sesiones de grabación de pinzas de parche que se espacian en un intervalo de unas pocas horas a varios días o semanas.Tanto los experimentos ópticos como los electrofisiológicos se pueden realizar en paralelo con estímulos cognitivos o conductuales y lecturas. La microscopía de dos fotones es una tecnología óptica no lineal única que permite la visualización en tiempo real de estructuras celulares e incluso subcelulares en capas corticales profundas del cerebro de un roedor. Para realizar un experimento de imágenes microscópicas de dos fotones, coloque un animal entrenado en la jaula de la casa móvil, ajuste los tapones para proteger la óptica del microscopio de daños accidentales.Limpie la cubierta de vidrio de la ventana craneal para eliminar las partículas de polvo. Deje caer un líquido de inmersión sobre el cubreobjetos. Recomendamos usar una solución de visco porque el agua se evapora rápidamente.La plataforma se puede colocar encima de una mesa óptica motorizada típica utilizando el modo de campo amplio del microscopio de fluorescencia y un filtro de emisión de paso largo. Evalúe la vasculatura cerebral y seleccione una región de interés. Para obtener una imagen de la vasculatura cortical inyectar en la vena de la cola de un animal con la cabeza fija e inmovilizada, un Dalton, Texas rojo conjugado de 70 kilos de texto Tran.Esta secuencia de imágenes muestra una grabación de lapso de tiempo de lugares y arterias en la corteza de un ratón que se comporta mientras navega alrededor de la jaula de la casa móvil. Al trazar el perfil de las líneas trazadas a través de la luz del vaso, se pueden medir los cambios en el diámetro del vaso y la motilidad de los segmentos individuales del vaso. La tasa de flujo sanguíneo en las arterias y venas se puede medir mediante un escaneo lineal a lo largo de las líneas trazadas paralelas a la pared del vaso. Multa.Los detalles de la morfología de las neuronas se pueden visualizar en ratones transgénicos que expresan YFP en la subpoblación de neuronas bajo el promotor de Taiwán. Estos dos Zacks comparan la estabilidad de la imagen entre animales anestesiados y despiertos. El panel lateral derecho muestra las dendritas del animal anestesiadas con una mezcla de ketamina y xilacina.Mientras que el panel lateral izquierdo muestra una imagen de dendritas en un animal despierto caminando alrededor de la jaula de una casa móvil. La morfología individual de la columna vertebral en animales despiertos puede analizarse con la misma fiabilidad y precisión que en los ratones anestesiados. El desplazamiento del cerebro durante la carrera de los animales no suele superar de uno a un micrómetro y medio.Estos movimientos se producen en las direcciones horizontales y muy raramente resultan en un cambio del plano de la imagen, lo que hace innecesaria la corrección de los artefactos de movimiento. En la mayoría de los casos, la capacidad de monitorear crónicamente la actividad neuronal en el cerebro vivo despierto es esencial para comprender la organización y función del sistema nervioso. Utilizando el lazo de tres ratones transgénicos, obtuvimos imágenes de la actividad neuronal espontánea en los ratones despiertos que se comportan en la jaula de la casa móvil.Esta secuencia de imágenes de lapso de tiempo muestra ejemplos representativos de picos de calcio en cuerpos celulares neuronales, nitas y axones. Las imágenes ópticas basadas en señales intrínsecas permiten mapear la distribución espacial de los dominios funcionales para realizar un experimento de imágenes ópticas intrínsecas. Coloque al animal entrenado en la jaula casera ubicada debajo del objetivo de la cámara.Limpie el cubreobjetos del polvo. Pon una gota de glicerol y cúbrela con un cubreobjetos redondo de cinco milímetros. Ajusta la posición de una cámara de alta velocidad.Coloque un manipulador con un tubo de soplado de aire opuesto a la vibración contralateral. Use luces verdes para obtener imágenes del mapa de la embarcación. Enfócate más profundamente en la corteza, aproximadamente 400 micrómetros por debajo de los vasos corticales.Coloque un filtro de paso de banda frente a la cámara e ilumine la corteza con una luz roja. Permita que el mouse se adapte a la plataforma durante al menos 30 minutos. Registre la actividad de referencia durante un episodio de seis minutos.Estimule la vibra cada 10 segundos con bocanadas de aire durante el período total de seis minutos. Esta imagen ilustra la actividad neuronal que se propaga a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a la estimulación vibratoria a una frecuencia de 0,05 hercios. Para realizar registros electrofisiológicos de una sola célula, coloque el animal entrenado implantado con una ventana craneal invertida en la jaula de la casa móvil.Lenta y cuidadosamente, retire la cubierta de vidrio del soporte de metal. Refresque el tampón cortical y limpie la ventana craneal de residuos con un tampón hemostático. Coloque el electrodo de tierra en el tampón cortical.Llene la pipeta de pinza de parche con solución intracelular. Aplique una presión positiva a la pipeta de registro utilizando un micromanipulador motorizado, profundice la pipeta en la corteza y obtenga un contacto de sello giga con la celda de interés. Después de grabar, retire la pipeta, refresque el tampón cortical y cierre la ventana craneal pegándola en un cubreobjetos al soporte metálico.El uso de una jaula doméstica transportada por aire permite combinar la imagen y la electrofisiología con paradigmas conductuales clásicos, como el aprendizaje, la rehabilitación o el comportamiento relacionado con la ansiedad. El olfato es una entrada sensorial importante para los ratones y se puede utilizar para la estimulación en pruebas de memoria y para la evaluación de la reacción a la novedad. Para realizar una prueba de habituación al olfato, coloque al animal entrenado en la jaula de la casa móvil y permita que adopte.Durante 30 minutos, fije un trozo limpio de algodón empapado en agua del grifo a la pared interior de la jaula de la casa móvil con una cinta adhesiva de doble cara. Después de cinco minutos, reemplace el algodón limpio en la pared de la jaula de casa por uno nuevo empapado en un líquido que contenga el olor a vainilla. Repita las exposiciones de cinco minutos al olor a vainilla tres veces con intervalos de cinco minutos entre las sesiones.Para medir el nivel de interés por el olor. Cuente el tiempo acumulado que el animal pasa mirando hacia la zona objetivo y el tiempo total de movimiento de la jaula de la casa móvil. Durante la última quinta sesión, presentar un olor socialmente significativo.Humedece el nuevo aplicador de algodón con unas gotas de orina de ratones del sexo opuesto. Para evaluar la reacción a la novedad, divida la jaula de la casa móvil en cuatro zonas. Coloque dos piezas de algodón opuestas entre sí. Color.Codifíquelos con marcadores en el lado externo de las paredes de la jaula de la casa durante la primera prueba. Coloque dos piezas de algodón limpias. A continuación, sustituya ambos por algodón empapado en un extracto de vainilla al 1%.Durante la tercera prueba, coloque el algodón de vainilla en la zona número uno y el trozo de algodón empapado en un extracto de plátano al 1% en la zona. Número dos, para medir la preferencia por la ausencia de olor. Calcule el tiempo que los animales pasan frente a la ausencia de olor como porcentaje del tiempo acumulado frente a otras zonas.Hola, soy Leo Kiro, investigador principal del Centro de Neurociencias de la Universidad de Helsinki. Espero que hayas disfrutado viendo el video y lo hayas encontrado útil. Hemos estado trabajando con doble microscopía in vivo durante los últimos cinco años, y el uso de la estética general siempre ha sido una gran preocupación porque la estética interfiere con la función cerebral, con el flujo sanguíneo y todo.Y hoy estoy feliz de que podamos trabajar en animales despiertos y realizar experimentos de imagen microscópica estable y validar y verificar los resultados que habíamos obtenido anteriormente en animales anestesiados. Estoy seguro de que el uso de jaulas para casas móviles y los métodos que hemos presentado hoy aumentarán la relevancia de la investigación in vivo en general y conducirán a resultados nuevos e innovadores, y estoy deseando que llegue.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Este protocolo describe el diseño y la implantación quirúrgica de un mecanismo de restricción de la cabeza para monitorear la actividad neuronal en las estructuras cerebrales subcorticales en ratas alerta.  Delinea procedimientos para aislar neuronas individuales en la configuración yuxtacelular e identificar eficientemente sus ubicaciones anatómicas.

Monitoreo Juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de Alerta, ratas Head-restringido

Se proporcionan instrucciones para la construcción e implantación quirúrgica de bajo costo de un montaje electroencefalográfico transcraneal crónico de alta densidad en ratones. También se describen las técnicas de grabación, extracción y procesamiento de señales.

De alta densidad Electroencefalográfica Adquisición en un modelo de roedor Uso de recursos de bajo costo y de código abierto

Aquí, presentamos un procedimiento para la realización de gran escala Ca 2 + imágenes con resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se mueven libremente. Cientos de células activas se pueden observar simultáneamente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza acoplado con una sonda de prisma implantada.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

Se introduce un inalámbrico, sistema bidireccional de nervios grabaciones de canales múltiples y la estimulación en comportarse libremente las ratas. El sistema es ligero y compacto, teniendo así un impacto mínimo en el repertorio conductual de la animal´s. Por otra parte, este sistema bidireccional proporciona una sofisticada herramienta para evaluar las relaciones causales entre patrones de activación cerebral y el comportamiento.

Un inalámbrico, interfaz bidireccional para la grabación en Vivo y estimulación de la actividad Neural en comportarse libremente las ratas

Este estudio presenta un método para la grabación simultánea de potenciales de campo local en el cerebro, electrocardiogramas, electromyograms y respirar las señales de una rata libremente móvil. Esta técnica, que reduce los costos experimentales y simplifica el análisis de datos, contribuye a la comprensión de las interacciones entre el cerebro y órganos periféricos.

Grabaciones simultáneas de potenciales de campo Local Cortical, Electrocardiograma, electromiograma y respirar a ritmo de una rata libremente móvil

El protocolo presentado aquí proporciona información sobre la electroencefalografía simultánea (EEG) y la evaluación del comportamiento en tiempo real. Hemos discutido todos los pasos involucrados en este protocolo como una solución atractiva para los investigadores en muchos campos de la neurociencia, particularmente en las áreas de aprendizaje y memoria.

Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo

Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.

Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos

Hemos desarrollado una plataforma única para rastrear el comportamiento animal durante dos tareas de aprendizaje asociativo dependientes de la fibra de escalada. El diseño de bajo costo permite la integración con experimentos optogenéticos o de imágenes dirigidos a la actividad cerebelosa asociada a la fibra de escalada.

Una plataforma flexible para monitorear el aprendizaje asociativo sensorial dependiente del cerebelo

Se describe un nuevo procedimiento detallado para la obtención de imágenes funcionales de ratas despiertas con la cabeza fija.

Implantes de cabeza para la neuroimagen de ratas despiertas con la cabeza fija

El protocolo describe la metodología de registro extracelular en la corteza motora (MC) para revelar propiedades electrofisiológicas extracelulares en ratones conscientes que se mueven libremente, así como el análisis de datos de potenciales de campo local (LFP) y picos, lo que es útil para evaluar la actividad neuronal de la red que subyace a los comportamientos de interés.

Grabación extracelular multicanal en ratones que se mueven libremente

Aprende a realizar grabaciones ópticas y electrofisiológicas en roedores despiertos y libres de moverse usando una jaula móvil elevada por aire. Este método permite combinar microscopía de dos fotones o técnicas de patch clamp con comportamiento natural en ratones.

Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores (Video) | JoVE Journal

Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores

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