Name: Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Aprende a fabricar geles de poliacrilamida con microesferas fluorescentes cerca de la superficie para microscopía de fuerza de tracción. Este método mejora la localización de sondas y permite medir fuerzas mecánicas celulares con mayor precisión.

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Los autores desean dar las gracias al Programa Iniciativa Interdisciplinar de Innovación de la Universidad de Illinois, conceder 12035. SK fue financiado en UIUC de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de Grant 0965918 IGERT: Formación de la Generación de Investigadores Siguiente Celular y Molecular Mechanics y BioNanotecnología.

La fabricación de geles y funcionalización PA de diferente rigidez con microesferas fluorescentes incrustados cerca de la superficie de cultivo de células. 1. funcionalizar los Cubreobjetos Top Glass <ol><li> Limpie cubreobjetos de vidrio (# 1.0, 12 mm diam.) Con agua y jabón, seguido de etanol para eliminar el polvo extraño. </li><li> Coloque la cubierta de vidrio se desliza en un (es decir, soporte de punta de pipeta) superficie de rallado de tal manera que no se toquen para facilitar la facilidad de interacción con los cubreobjetos. </li><li> Escudo toda la superficie de la cubierta se desliza con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 h (Figura 1A). </li><li> Durante este tiempo, realizar una dilución de 1: 10.000 de la solución coloidal de 0,1 m de diámetro, las microesferas fluorescentes rojas con agua desionizada (DI) agua para obtener una densidad de partícula de aproximadamente 1 microesfera por 20 m 2 en la superficie del gel. Ver Figura 2 para los resultados de varias diluciones. Esta dilution puede ser modificado para satisfacer la necesidad de experimentos específicos. </li><li> Coloque la solución diluida en un baño de agua ultrasónico durante 30 min. </li><li> Después de 1 hora, utilizar pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Devolver los cubreobjetos secos a la superficie rallada. </li><li> Retire la solución coloidal diluida del baño ultrasónico y pipeta de 150 l en cada hoja de la cubierta. Dejar durante 10 min (Figura 1B). </li><li> Utilice las pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Volver la cubierta seca se desliza sobre la superficie rallada y almacenar en la oscuridad hasta que la necesite. </li></ol> 2. Preparación de Gel PA Directamente en placas de Petri de vidrio de fondo <ol><li> Placa Precalentar a 100 ° C. </li><li> Coloque el número deseado de fondo de cristal cajas de Petri (35 mm plato con 14 mm micro-bueno, # 1.0) sobre una superficie plana en una campana para vapores químicos. </li><li> Cubra la parte de vidrio de cada plato micro-así Petri con 97% de 3-aminopropil-trimethoxysLiane (3-APTES) durante 7 minutos para la activación química. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario de los 3-APTES a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del poliestireno. </li><li> Después de 7 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en el recipiente de residuos. </li><li> Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco. </li><li> Retire las placas de Petri de la placa caliente y volver a una superficie plana en una campana para vapores químicos. </li><li> En una campana de humos químicos, hacer una solución de 0,5% de glutaraldehído y para abarcar la parte de vidrio de cada placa de Petri bien con la solución durante 30 min. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario del glutaraldehído a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del plástico. </li><li> Después de 30 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en un contenedor de residuos para enjuagar y eliminar el glutaraldehyde. </li><li> Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco. </li><li> Antes de mezclar los componentes de la solución de gel de PA, mover los portaobjetos de vidrio funcionalizadas en la campana de humos química tal que sean fácilmente accesibles, lo que permite la intercalación rápida del gel con el fondo de cristal placas de Petri después de mezclar la solución de gel. </li><li> En un tubo de centrífuga de 15 ml, mezclar 40% de bisacrilamida, 2% de acrilamida y ácido acrílico en sucesión inmediata en las concentraciones que se indican en la Tabla 1 (adaptada de protocolo publicado 10) para lograr la elasticidad de la matriz deseada. </li><li> Añadir HEPES 100 mM, persulfato de amonio al 10%, y TEMED en cantidades enumeradas en la Tabla 1 correspondientes a la elasticidad matriz deseada para completar la solución de gel. </li><li> Inmediatamente pipetear 15 l de solución de gel en el centro de la parte de vidriode los platos de Petri. </li><li> Recoger inmediatamente una hoja de cubierta de vidrio funcionalizado con pinzas. <ol><li> Voltear la hoja de la cubierta de vidrio sobre tal manera que las perlas fluorescentes son en la toma de contacto lateral con solución de gel. </li><li> Coloque la hoja de la cubierta suavemente en la parte superior del gel líquido ahora-PA tal que el lado funcionalizado está en contacto con el gel (Figura 1C). Nota: Para obtener los mejores resultados, una segunda persona se recomienda para el papel de la adición de la hoja de la cubierta con el fin de evitar la posibilidad de polimerización parcial mientras pipeteo solución de gel PA líquido sobre varias placas de Petri. </li></ol></li><li> Voltear todos los platos de Petri a ayudar con evitar los efectos de la gravedad sobre nanopartículas fluorescentes de polimerización en niveles inferiores del gel de PA. </li><li> Espere por lo menos 35 minutos, o hasta que la solución madre de PA gel ha polimerizado visiblemente en su tubo de centrífuga. </li><li> Voltear las cajas de Petri volver una y llenarlos con PBS para ayudar con la eliminación de la hoja de la cubierta. </li><li> Cuidadosamente hacer contacto con la parte de vidrio de la placa de Petri y el contorno de la hoja de la cubierta, con unas pinzas para raspar la circunferencia de la hoja de la cubierta. Realice varios ciclos hasta que se desprendió la hoja de la cubierta. Retire la hoja de la cubierta y deseche en un contenedor para desechos cortopunzantes adecuada. </li><li> Después de eliminar todos los cubres, perlas fluorescentes se han transferido al gel (Figura 1D). Cubra los geles PA completo con PBS, coloque el plato de Petri tapa en cada plato, y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> 3. de funcionalización PA gel con fibronectina <ol><li> Preparar las siguientes soluciones premezcladas como se describe en un protocolo establecido 11: Empapar solución (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) y tampón 2x conjugación (0,2 M 2 (N morfolino) etanosulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5). </li><li> Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar todo el PBS de los platos con fondo de vidrio que contienen los geles PA. </li><li> PipetTE remojo solución sobre cada gel tal que el gel esté completamente sumergido. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h. </li><li> 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida caliente (EDC) y N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar 10x soluciones de EDC (150 mM, 19 mg / ml en agua DI) y NHS (250 mM, 29 mg / ml en agua DI). </li><li> Mezclar 1 parte 10x EDC, 1 parte de 10x NHS, 3 partes de agua DI, y 5 partes 2x tampón de conjugación. </li><li> Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar la solución de remojo. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel. </li><li> Agregue suficiente solución NHS / EDC para cubrir la superficie del gel y llenar el pozo con fondo de cristal de la placa de Petri (150-250 l). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. </li><li> Fibronectina Descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelada, la mezcla de agua DI estéril para crear una solución de fibronectina 50 g / ml. </li><li> Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar las solu NHS / EDCción. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel. </li><li> Añadir 150 l de solución de fibronectina a cada gel. Incubar a temperatura ambiente durante 35 min para permitir la unión de la fibronectina. </li><li> Después de 35 min, añadir PBS a cada placa de Petri y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. </li></ol> 4. Experimentos de tracción Fuerza <ol><li> Medios de calentamiento de células, PBS, y tripsina a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Enjuague geles 5x con PBS estéril, aspirar el PBS entre enjuagues, y dejar tapado en la campana. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina por 25 cm 2 a las células del frasco que contiene. Después las células se levantan de matraz, diluir la tripsina con medio celular y contar las células. Basado en el área de superficie del gel, determinar el número de células requeridas por gel para una densidad de siembra de células final de 3000 células / cm 2. Diluido o concentrado de suspensión de tal manera que 150 l de la mezcla de células-media contiene este número de células. Alícuotas de 150 l de suspens celularesde iones a cada gel. </li><li> Colocar las cápsulas de Petri que contenían las células en una incubadora durante 30 min. A continuación, retirar con cuidado las placas de Petri y llenar el resto de la placa de Petri con los medios de comunicación (aproximadamente 2 ml) tal que la superficie de la placa está completamente sumergido. </li><li> Colocar las placas de Petri de nuevo en la incubadora hasta que la adquisición de imágenes. </li><li> Prepare el sistema de adquisición de microscopio y datos para la imagen: inserte el objetivo de inmersión en agua 40x, inserte el contraste de interferencia diferencial (DIC) de prisma, seleccione el mCherry o filtro fluorescente equivalente, y encienda la cámara ambiental. </li><li> Cuando se prepara para la imagen, retire una placa de Petri de la incubadora y colóquelo sobre la platina del microscopio. Retire la tapa de la placa de Petri para imágenes DIC. </li><li> Localice una sola célula y capturar una imagen fija de la celda en la DIC. </li><li> Sin mover la platina del microscopio, cambiar el modo de imagen a la fluorescencia. Centrarse en las microesferas fluorescentes y recOrd una imagen de las microesferas. </li><li> Retire cuidadosamente los medios de comunicación célula a partir de la placa de Petri con una pipeta y añadir 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Imagen de las microesferas bajo la celda después de que las células han desprendido. </li><li> El uso de imágenes de partículas velocimetría (PIV) Análisis en ImageJ 12 para calcular el campo de desplazamientos debido a las fuerzas celulares. </li></ol>

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
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<li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Cuando se utiliza esta técnica, es esencial que la solución de bolas se diluye apropiadamente y las perlas se eligen basándose en diámetro deseado, PA rigidez sustrato gel, y la escala de tamaño de los fenómenos que se explora en el experimento deseado. Se debe tener cuidado al diluir la solución del grano antes de la funcionalización de los mejores cubreobjetos de vidrio. La separación entre los granos en la superficie del gel puede ser alterado cambiando el factor de dilución de la solució...

La interacción mecánica de una célula viva con su medio ambiente local comúnmente se ha estudiado el uso de geles PA. Estos sustratos se basan en un protocolo simple, bien caracterizado establecido por Dembo y Wang en 1997 1. Una de las principales ventajas de estos sustratos es que su rigidez puede ser sintonizada mediante la modificación de las concentraciones de los componentes específicos de la solución de gel. Esto proporciona una plataforma conveniente para estudiar la interacción células con ambientes de diferentes rigideces. Cuando geles PA se recubren con la matriz extracelular (ECM), las proteínas, las células se adhieren a ellos, la generación de la fuerza. Como resultado de la fuerza de células, el gel se deforma como un cuerpo elástico. Esta deformación depende de la magnitud de la fuerza aplicada por las células y las propiedades elásticas del gel. Varios estudios han empleado geles PA para investigar las fuerzas de tracción celulares. En una variación de la fabricación de gel de PA, microesferas fluorescentes (bolas) están incrustados turante el gel para cuantificar las fuerzas de tracción de células en geles de diferentes rigideces 2. Tras la aplicación de la fuerza de células, las bolas se desplazan desde su ubicación inicial después de la deformación gel. El campo de la deformación se mide a partir de los desplazamientos de cuentas individuales. Este campo se utiliza la deformación con la teoría de la elasticidad y las propiedades elásticas del gel para calcular las fuerzas de tracción. Estas mediciones proporcionan una idea de cómo las células detectan mecánicamente e interactuar con su microambiente local de 3. En muchos protocolos de fabricación gel ampliamente utilizados PA, las perlas se entremezclan en todo el gel de PA en su estado no polimerizado líquido. Un gel de PA totalmente polimerizado contiene perlas fluorescentes en todo su volumen. Al calcular las fuerzas de tracción de células, la mayoría de los granos cerca de la superficie del gel (interfaz célula-sustrato) son monitoreados. Los desplazamientos de estas perlas se supone que se produzca en la superficie de cultivo celular para la simplicidad en la fuerza CÁLCULOn. Se tiene en cuenta la ubicación real de las perlas dentro de la profundidad del gel. Sin embargo, en un medio elástico (como PA gel), un cordón más cerca de un punto de aplicación de la fuerza se moverá más de un cordón que está más lejos del punto. Por lo tanto, el tratamiento de la desplazamiento de un punto (en la ubicación del talón) distal de la superficie como que los resultados de superficie en una subestimación de tracciones celulares. El grado de error depende de la distancia del talón de la superficie. El error no puede ser estimada sin el conocimiento de la ubicación de la perla. La necesidad de un método simple para confinar perlas muy cerca de la superficie de cultivo celular ha sido abordada por algunas técnicas. Una forma es aumentar la densidad de los granos a través de todo el gel de tal manera que hay un número suficiente de perlas en el plano focal superior para medir el movimiento muy cerca de la superficie. Otra técnica consiste en la construcción de una cámara de imagen confocal de imágenes de células vivas de tal manera que la luz desólo las perlas en el plano superior más focal se recoge 4. Un método diferente implica la superposición de una capa extremadamente delgada de gel de PA que contiene perlas en la parte superior de un gel ya polimerizado sin talones 5. Un inconveniente de cada una de estas técnicas es que no se conoce la ubicación exacta de las perlas dentro del gel. Esto introduce un error en el cálculo del campo de desplazamiento de las perlas, y por lo tanto el cálculo de las fuerzas de células. Otra técnica implica la conjugación de perlas a la superficie superior de un gel de PA ya polimerizado usando sulfo-SANPAH 6. Esta técnica asegura las perlas son de hecho sólo en la parte superior del gel de PA, pero el grado en que están incrustados en la profundidad del gel es desconocido. Esto podría crear una topografía local para las células, lo que podría alterar el comportamiento de células, como el trabajo previo ha sugerido que las células pueden sentir la fuerza de varias micras de distancia 7. Recientemente, una técnica para modelando geles PA con 1 m de diámetro fluorescent marcadores de puntos de fibronectina en una matriz regularizado se estableció 8. En este caso, la profundidad de los marcadores fluorescentes se conoce, y es esencialmente cero, como el patrón de fibronectina se imprime indirectamente sobre la superficie del gel. Sin embargo, este método no proporciona un medio continuo en el que las células pueden adherirse, como la proteína ECM se limita a 1 m de diámetro puntos. Un método para la plena integración de los granos de seguimiento dentro de los geles de PA y confinarlos en una ubicación conocida muy cerca de la superficie aún no se ha establecido. Aquí, desarrollamos una técnica para limitar sub-micras de perlas fluorescentes de diámetro micras a un plano focal muy cerca de la superficie de cultivo de células dentro PA gel. Un gel se curan típicamente intercalando solución de gel líquido no polimerizado entre dos placas de vidrio. Una de las placas se funcionaliza para que el gel se adhiere fuertemente a él. La otra es sin funcionalizar y se retira después de las curas de gel. Modificamos este vidrio extraíble dorface por recubrimiento con una capa de perlas. Al intercalar el gel líquido entre el funcionalizado y la superficie de cristal bola recubierta, la transferencia de los granos al gel mientras se está curando. Esto limita la distancia de la integración de las perlas &#39;en el gel dentro de 1,6 m de la superficie. Platos de Petri con fondo de vidrio se utilizan como la superficie adherente en la que se cura el gel. Para formar una superficie superior plana de gel durante la polimerización, un cubreobjetos de vidrio circular se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri con fondo de vidrio. Antes de la fabricación del gel, el cubreobjetos de vidrio superior está recubierta con poli-D-lisina (PDL), produciendo una carga superficial positiva. La PDL se sopla con aire comprimido, y una solución de perlas en agua se deposita sobre los cubreobjetos. Utilizamos microperlas fluorescentes carboxilados, que llevan una carga negativa, e interactuar con la superficie de carga positiva creada por el tratamiento con PDL. Después de soplar la solución del grano de la cubreobjetos con aire comprimido, una sola capa decuentas sigue siendo electrostáticamente acoplan a la hoja de la cubierta seca. El recubrimiento PDL no afecta a la adhesividad de la copa a la superficie del gel, ya que los portaobjetos de vidrio no están dañados y se retira del gel de PA completamente intacto. Los platos de Petri con fondo de cristal se hacen adherentes mediante tratamiento con 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane y 0,5% de glutaraldehído. PA geles de rigideces deseadas se crean mediante la mezcla de concentraciones apropiadas de bisacrilamida y acrilamida a través de un procedimiento estándar 9. Una gota de la solución de gel se pipeta en la placa de Petri con fondo de cristal. La hoja de la cubierta de vidrio que contiene las perlas se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri. Cuando se cura el gel, la hoja de la cubierta superior se retira dejando las microesferas incrustadas en el gel de PA dentro de 1,6 m desde la superficie.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>97% 3-Aminopropil-trimetoxisliano (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% Glutaraldehído</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M solución tampón HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2% Bisacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro; m Microesferas fluorescentes (mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, Humano, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisulfosuccinimida (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acrílico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Materiales</fuerte></td></tr><tr><td>35 mm Plato de fondo de vidrio con micropocillo de 14 mm #1 cubreobjetos</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, 12 mm de diámetro. </td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr></tbody></table>

un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para microscopía de fuerza de tracción

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Geles de PA han sido utilizados como plataforma para estudiar las fuerzas de tracción de células debido a la facilidad de fabricación y la capacidad de sintonizar sus propiedades elásticas. Cuando el sustrato se recubre con una proteína de la matriz extracelular, las células se adhieren al gel y se aplican fuerzas, haciendo que el gel se deforme. La deformación depende de la tracción celular y las propiedades elásticas del gel. Si se conoce el campo de deformación de la superficie, la superficie de tracción puede calcularse utilizando la teoría de la elasticidad. La deformación del gel se mide comúnmente mediante la incorporación de perlas de marcador fluorescente de manera uniforme en el gel. Las sondas desplazan como el gel se deforma. Las sondas cerca de la superficie del gel se realiza un seguimiento. Los desplazamientos reportados por estas sondas se consideran como desplazamientos de superficie. Se ignoran sus profundidades desde la superficie. Esta suposición introduce un error en la evaluación de la fuerza de tracción. Para la medición precisa de las fuerzas de células, es crítico para la ubicación de las perlas para ser conocida. Hemos desarrolladouna técnica que utiliza la química sencilla para confinar perlas de marcadores fluorescentes, 0,1 y 1 m de diámetro, en geles de PA, dentro de 1,6 m de la superficie. Nos capa de un cubreobjetos con poli-D-lisina (PDL) y perlas fluorescentes. PA solución de gel se intercala después entre el cubreobjetos y una superficie adherente. Las perlas fluorescentes se transfieren a la solución de gel durante el curado. Después de la polimerización, el gel PA contiene perlas fluorescentes en un plano cerca de la superficie del gel.

Confocal de imágenes se utilizó para determinar que las perlas eran de hecho por debajo de la superficie del gel y para cuantificar su ubicación precisa dentro de la profundidad de gel. Perlas fluorescentes de una longitud de onda diferente que aquellos en el interior del gel se dejaron sedimentar en la superficie, y la distancia entre las nanopartículas fluorescentes embebidos y los de la superficie se calculó utilizando un algoritmo de identificación centroide. La ubicación del talón sobre la superficie del gel sirve ...

Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar geles de poliacrilamida o PA para el cultivo celular con microesferas fluorescentes incrustadas muy cerca de la superficie del gel. Esto se logra funcionalizando primero los cubreobjetos de vidrio con lisina poli D. El segundo paso es recubrir los cubreobjetos de vidrio con una solución que contenga microesferas fluorescentes.Los geles Next PA se formulan mezclando una concentración adecuada de bis, acrilamida y acrilamida, y se intercalan entre una superficie subyacente y el lado funcionalizado de los cubreobjetos de vidrio. El paso final es funcionalizar el gel con una proteína de matriz extracelular y cultivar células en la superficie del gel. En última instancia, la microscopía de fuerza de tracción se utiliza para medir las fuerzas mecánicas ejercidas por las células como resultado de la deformación del sustrato inducida por las células.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la fabricación tradicional de PHL, es que localiza las microesferas fluorescentes en una ubicación conocida dentro de la profundidad del gel, lo que permite un cálculo más preciso de las fuerzas de tracción celular. La demostración visual de este método es fundamental, ya que se debe tener en cuenta la curación espacial al funcionalizar los deslizamientos de la cubierta de vidrio para garantizar que los bits de fluorescencia se transfieran correctamente al primer lugar de PHL. La cubierta de vidrio previamente limpiada se desliza sobre una superficie rallada de manera que no se toquen.Para facilitar la interacción con los cubreobjetos, cubra toda la superficie de los cubreobjetos con 0,1 miligramos por mililitro de lisina poli D durante una hora. Durante este tiempo, realice una dilución de uno a 10.000 de la solución coloidal de 0,1 micrómetros de diámetro. Microesferas fluorescentes rojas con agua desionizada para obtener una densidad de partícula de aproximadamente una microesfera por cada 20 micras cuadradas en la superficie del gel.Coloque la solución diluida en un baño de agua ultrasónico durante 30 minutos. Después de una hora, use pinzas para levantar con cuidado cada cubreobjetos y séquelo con aire. A continuación, vuelva a colocar los cubreobjetos secos en la superficie rallada.Una vez que la solución coloidal diluida se haya retirado del baño ultrasónico, pipetee 150 microlitros de la solución en cada cubreobjetos. Después de 10 minutos, use pinzas para levantar con cuidado cada cubreobjetos y séquelo con aire. Una vez que los cubreobjetos secos se hayan devuelto a la superficie graduada, guárdelos en la oscuridad hasta que estén listos para usar.A continuación, coloque el número deseado de placas de Petri con fondo de vidrio sobre una superficie plana en una campana de gases químicos. Cubra la porción de vidrio de cada placa de Petri. Micro pozo con el 97% de tres aminoácidos propiltrimetilo durante siete minutos para la activación química.Después de siete minutos, llene la placa de Petri con agua desionizada y deseche la solución en un contenedor de desechos. Cubra con cuidado la porción de vidrio de cada placa de Petri. Pozo con una solución de glutaraldehído al 0,5% previamente preparada durante 30 minutos.Después de 30 minutos, llene la placa de Petri con agua desionizada y deséchela en un contenedor de desechos para enjuagar y eliminar la piel de glutaraldehído. Antes de mezclar los componentes de la solución de gel de poliacrilamida, mueva los portaobjetos de vidrio funcionalizados a la campana de gases químicos de manera que sean fácilmente accesibles, lo que permite el intercalado rápido del gel con las placas de Petri con fondo de vidrio. Después de mezclar la solución de gel en un tubo de centrífuga de 15 mililitros, mezcle 40% bis de acrilamida, 2% de acrilamida y ácido acrílico en sucesión inmediata.Para lograr la elasticidad de la matriz deseada, agregue 100 HEP milimolares, 10% de amonio por sulfato y se combinen en cantidades correspondientes a la elasticidad de la matriz deseada. Para completar la solución de gel, pipetee inmediatamente 15 microlitros de solución de gel en el centro de la porción de vidrio de las placas de Petri. Después de recoger un cubreobjetos de vidrio funcionalizado con pinzas, gírelo de modo que las perlas fluorescentes queden en el lado que hace contacto con la solución de gel.A continuación, coloque suavemente el cubreobjetos sobre el gel de poliacrilamida ahora líquido, de modo que el lado funcionalizado esté en contacto con el gel. Después de esto, voltee todas las placas de Petri para ayudar a evitar los efectos de la gravedad en las nanopartículas fluorescentes. Polimerización en niveles inferiores del gel de poliacrilamida.Después de la polimerización, voltee las placas de Petri y llénelas con BS. Haga contacto con cuidado con la parte de vidrio de la placa de Petri y el contorno del cubreobjetos con pinzas para raspar la circunferencia del cubreobjetos. Después de varios ciclos de raspado. Retire el cubreobjetos y deséchelo en un contenedor de residuos punzocortantes adecuado.Después de quitar todas las tapas, coloque la tapa de la placa de Petri en cada placa y guárdela a cuatro grados centígrados. Una vez que los geles de poliacrilamida se hayan calentado a temperatura ambiente, use una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar todo el PBS de los platos con fondo de vidrio que contienen los geles pipetea la solución de remojo previamente preparada en cada gel de modo que el gel quede completamente sumergido. Después de la incubación a temperatura ambiente durante al menos una hora, agregue de 150 a 250 microlitros de una solución de H-S-E-D-C previamente preparada para cubrir la superficie del gel y llene el pozo del fondo de vidrio de la placa de Petri.A continuación, incubar los geles a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Una vez que la solución N-H-S-E-D-C se haya eliminado al vacío, agregue 150 microlitros de una solución de fibronectina previamente preparada a cada gel. Una vez más, incube a temperatura ambiente durante 35 minutos para permitir la fijación de la fibronectina.En este punto, caliente los medios celulares PBS y tripsina a 37 grados Celsius en un baño de agua. Enjuague los geles cinco veces con agua desionizada estéril. Aspirando el agua entre enjuagues, cubra los geles, dejándolos en la capucha.Agregue un mililitro de tripsina por cada 25 centímetros cuadrados al matraz que contiene las células. Después de levantar las células del matraz, diluya la tripsina con medios celulares. A continuación, cuente las células con un hemocitómetro en función de la superficie del gel.Determine el número de células necesarias por gel para una densidad de asiento final de células de 3000 células por centímetro cuadrado, diluya o concentre la suspensión de modo que 150 microlitros de la mezcla de medios celulares contengan este número de células. A continuación, Eloqua aplica 50 microlitros de la suspensión celular en cada gel. A continuación, las placas de Petri que contienen las células en una incubadora durante 30 minutos.Después de retirar con cuidado las placas de Petri de la incubadora, llene el resto de la placa de Petri con aproximadamente dos mililitros de medio de modo que la superficie de la placa quede completamente sumergida. Vuelva a colocar las placas de Petri en la incubadora hasta la adquisición de la imagen. Cuando esté preparado para la obtención de imágenes, coloque una de las placas de Petri suavemente sobre la platina del microscopio.Después de quitar la tapa de la placa de Petri para la obtención de imágenes de DIC, localice una sola célula y capture una sola imagen fija de la célula en DIC sin mover la platina del microscopio. Cambie el modo de imagen a fluorescencia. Concéntrese en las microesferas fluorescentes y grabe una imagen de las microesferas.Retire con cuidado el medio celular de la placa de Petri con la pipeta y agregue 0,05% de tripsina EDTA. Concéntrese en la imagen DIC para mostrar el gel del que se ha desprendido la célula. A continuación, obtenga una imagen de las microesferas debajo de la célula después de que las células se hayan desprendido.Se utilizaron imágenes confocales para determinar que las perlas estaban debajo de la superficie del gel y para cuantificar su ubicación precisa, se permitió que se depositaran en la superficie perlas fluorescentes de un tamaño y longitud de onda diferentes a las del interior del gel. La ubicación de las perlas asentadas sirve como referencia para la superficie superior del gel, donde las células aplican fuerza sobre la adherencia. Después de las imágenes confocales, se calculó la distancia entre las nanopartículas fluorescentes incrustadas y las de la superficie.Esta distancia determinaba la profundidad precisa de las perlas dentro del gel. Aquí se muestra la distribución espacial del cordón y la vista proyectada en el plano YZ. La escalera proporciona las profundidades de todas las perlas de la superficie del gel.La profundidad media de las perlas de 0,1 micras es de 619 nanómetros, 467 nanómetros, 278 nanómetros para los geles de poliacrilamida de rigidez de 10 y 40 kilopascales, respectivamente. Las profundidades correspondientes para las perlas de una micra de diámetro son menos 20 nanómetros en geles de 40 kilopascales, 12 nanómetros en geles de 10 y 1.255 nanómetros en geles de un kilopascale. Se midió la profundidad de las perlas dispersas por todo el gel y se comparó con las profundidades.Utilizando la técnica presentada. Aquí se muestra la variabilidad de la dispersión de las perlas dentro de la profundidad de un gel de poliacrilamida utilizando métodos de fabricación tradicionales. Aquí se muestra el campo de desplazamiento de una célula de fibroblasto y la capa de perlas fluorescentes correspondiente.Las cuentas cerca de la periferia de la imagen aparecen ligeramente desenfocadas, lo que es un efecto óptico debido al objetivo de inmersión en agua. Tras la adición de tripsina, la célula se libera de la superficie, lo que hace que la superficie del gel de poliacrilamida deformada vuelva a su estado original. Una vez dominada, esta técnica de fabricación y funcionalización de PHL se puede realizar en seis horas si se realiza correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar geles de poliacrilamida con microesferas fluorescentes, localizadas en una ubicación conocida dentro de la profundidad del gel cerca de la superficie del cultivo celular. Para un cálculo más preciso de las fuerzas de tracción de la célula.

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Investigación

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Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción (Video) | JoVE Journal

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

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