Name: Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a genotipar rápidamente ratones recién nacidos y establecer cultivos primarios de neuronas cerebrales sobre capas de células gliales. Este método eficiente facilita el estudio de modelos murinos letales neonatalmente.

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Los autores agradecen a los investigadores de la Universidad de Iowa, los Dres. Luis Tecedor, Ines Martins y Beverly Davidson por sus instrucciones y comentarios útiles sobre los cultivos estriatales, y a los Dres. Kara Gordon, Nicole Bode y Pedro Gonzalez-Alegre por la asistencia y las discusiones sobre el genotipado. También agradecemos al Dr. Eric Weyand (Sistemas de Identificación y Marcado de Animales) por sus útiles comentarios sobre el tatuaje, y al Dr. Shutaro Katsurabayashi (Universidad de Fukuoka) por sus útiles comentarios sobre la cultura del ratón. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón, el Departamento de Defensa (premio del Programa de Investigación Médica Revisada por Pares W81XWH-14-1-0301), la Fundación de Investigación Médica de la Distonía, la Fundación Edward Mallinckrodt, Jr., la Fundación Nacional de Ciencias y la Fundación Whitehall (N.C.H.).

El autor (Zhengmin Huang) es el presidente de EZ BioResearch LLC que produce los reactivos descritos en este artículo.

El protocolo que aquí se presenta incluye procedimientos para tatuar etiquetar / identificar los ratones, para el genotipado de los ratones de cola consejos, y para el cultivo de neuronas del cerebro del ratón en baja densidad. En una ronda de experimentos utilizando 6-8 crías, estos procedimientos requieren típicamente ~ 0,5 h, ~ 4 horas y ~ 2 h, respectivamente, en un total de 07.06 h. Esto hace que sea práctico para un solo experimentador para completar todos los trámites necesarios desde el momento del nacimiento de...

Modelos de roedores de enfermedades genéticas han demostrado ser útiles en el establecimiento de las funciones fisiológicas de las proteínas normales y ácidos nucleicos, así como las consecuencias fisiopatológicas de defectos en estos. Los ejemplos incluyen ratones deficientes para proteínas implicadas en funciones celulares clave, así como modelos de ratón de trastornos tales como la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, ciertas manipulaciones genéticas pueden conducir a la letalidad neonatal poco o unos pocos días después del nacimiento. En estos casos, los cultivos celulares primarios son una herramienta importante porque las células vivas se pueden obtener de las crías de embriones o neonatales antes de la muerte, que pueden mantenerse durante al menos un par de semanas in vitro, y durante este tiempo el desarrollo neuronal temprana pueden ser seguidos por experimentos bioquímicos, morfológicos y funcionales. Para los cultivos primarios, puede ser beneficioso para la placa de las neuronas a baja densidad; esto hace que sea posible visualizar la somata individual, dendritas, árboles axonal y termi nervionales en alta resolución espacial. Sin embargo, la supervivencia y la diferenciación de las neuronas a baja densidad típicamente requiere que se colocan en una capa alimentadora glial, co-cultivadas con células gliales en la ausencia de contacto físico con ellos, o se cultivaron en medio acondicionado por células gliales 1. El establecimiento de cultivos neuronales de baja densidad en capas alimentadoras gliales puede depender de rápido y fiable de genotipado de antemano - dentro de unas pocas horas en contraste con unos pocos días. La velocidad es especialmente importante cuando el genotipo neuronal necesita ser adaptada a la de una capa alimentadora glial preparado de antemano. Como un ejemplo más práctico, puede ser necesario decidir que las crías de que el genotipo para usar en cultivos de generación, para optimizar la eficiencia de un experimento. Aquí demostramos el protocolo de trabajo que se ha utilizado para una rápida y simplificada y fiable de genotipado de ratón en publicaciones anteriores 2-6. Colas de ratón yse utilizó un kit disponible comercialmente. Este protocolo incluye la extracción de una sola etapa de los ácidos nucleicos a partir del tejido, y no requiere ni una etapa de purificación de ácido nucleico ni el uso de un tampón de terminación (&quot;solución de parada &#39;). La fiabilidad de este método de genotipificación se ilustra mediante la presentación de los resultados de una serie de pruebas cuando se introducen las diferencias con respecto a la cantidad de partida de los especímenes, la edad de los animales y la longitud de los amplicones de PCR. Este kit ofrece las ventajas de la extracción y la fiabilidad automatizado. Por el bien de ser integral, también se demuestra el uso de los tatuajes para la identificación a largo plazo de los ratones con genotipo. El tatuaje se logra mediante la aplicación de la tinta de tatuaje en la dermis de la piel (debajo de la epidermis) 7. Se describe un procedimiento para el tatuaje las almohadillas de las patas de ratones recién nacidos o 1 día de edad, aunque los tatuajes se pueden aplicar a otras partes del cuerpo, tales como colas y dedos de los pies, y para animals, de todas las edades. Además, los procedimientos se demostrarán para el recubrimiento y el cultivo de neuronas de ratón a una densidad baja, basado en la preparación optimizada de diferentes tipos de capas de alimentación gliales 2,8. Usamos un modelo genético de ratón de la enfermedad neurológica DYT1 distonía heredado - un trastorno de movimiento autosómica dominante causada por una mutación en el gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La proteína codificada, torsinA, pertenece a los &quot;ATPasas asociados a diversas actividades celulares&quot; (AAA +) familia de proteínas, cuyos miembros en general, desempeñará las funciones de tipo chaperón, la asistencia en: proteína que se desarrollan, desmontaje-proteína compleja, el tráfico de membrana, y la fusión de vesículas 10-13. La mutación en un marco de supresión de un codón para el ácido glutámico, y pueden llevar a la manifestación de &quot;inicio temprano generalizado aislado distonía &#39;14,15. Sin embargo, el caminomecanismos ophysiological responsables de este trastorno siguen siendo poco conocidos. En un modelo de ratón knock-in, el alelo mutante es TOR1A tm2Wtd, mencionado en lo sucesivo como TOR1A AE. Heterocigota? E-torsinA knock-en ratones son pacientes humanos viables genéticamente y mímicas con distonía DYT1, mientras homocigotos ronda en ratones mueren después del nacimiento 16,17, con la latencia a la muerte postnatal afectados por los antecedentes genéticos 18. La temprana muerte de homocigotos ratones knock-in requiere que tanto la determinación del genotipo de los animales y el establecimiento de cultivos neuronales se completan rápidamente. Como otro ejemplo de genotipado, TFAP2A (factor de transcripción AP-2α, la activación de la proteína de unión a 2α potenciador) se utilizará. La proteína codificada por este gen es importante en la regulación de múltiples procesos celulares, tales como la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y apoptosis 19.

<table><tbody><tr><td>REACTIVOS - Limpiador de Máquinas de Tatuar Sistemas de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Identificación y Marcaje de Animales, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>Se utiliza para limpiar las agujas y el soporte después de tatuar.</td></tr><tr><td>Agente de secado a máquina</td><td>Sistemas de identificación y marcaje de animales, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>Se utiliza para secar las agujas y el soporte después de la limpieza.</td></tr><tr><td>Tatuaje neonato pigmento negro</td><td>sistemas de identificación y marcado de animales, inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de Preparación de</td><td>la Piel Sistemas de Identificación y Marcado de Animales, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Q-tip.</td></tr><tr><td>Solución de preparación de la piel</td><td>Sistemas de identificación y marcaje de animales, Inc.</td><td>NSP01</td><td>Este reactivo proporciona una fina capa de aceite que mejora la eficiencia del tatuaje y evita la decoloración del tatuaje, al (información del proveedor): 1) evita que la piel no tatuada se manche temporalmente, lo que permite evaluar fácilmente la calidad de un tatuaje de la almohadilla de la pata antes de que el cachorro regrese a su jaula de origen. La superficie de la piel manchada se puede confundir con la piel tatuada, 2) reducir el daño de la piel durante el tatuaje &ndash; Suavizar la piel y lubricar la aguja ayudará a que la aguja penetre en la piel sin causar daño a la piel, y 3) evitará que el oxígeno molecular ingrese a la piel, reduciendo así las respuestas inflamatorias a las especies reactivas de oxígeno que se pueden generar.</td></tr><tr><td>REACTIVOS - genotipado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Formato de tubo de tira)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Se incluye un colorante rojo de carga para electroforesis en la solución 2X PCR Ready Mix.</td></tr><tr><td>Solución de lisis de tejidos A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare la solución de extracción de ADN mezclando 20 y micro; l de la solución de lisis tisular A y 180 &micro; l de solución de lisis tisular B por muestra.</td></tr><tr><td>Solución de lisis de tejidos B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare la solución de extracción de ADN mezclando 20 y micro; l de la solución de lisis tisular A y 180 &micro; l de solución de lisis tisular B por muestra.</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Grado optimizado de agarosa, grado de biología molecular</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>Utilizamos geles de agarosa al 2% en tampón TAE que contienen la tinción de gel SYBR Safe DNA (diluida 10.000 veces) o bromuro de etidio (0,5 y micro; g/ml de volumen de gel).</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta filtradas, sin aerosoles, 0.1-10 &micro; l</td><td>Punto Científico Inc</td><td>UG104-96RS&nbsp;</td><td>Utilice puntas de pipeta estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa. Para todos los pasos relacionados con el ADN, utilice puntas de pipeta filtradas para evitar la contaminación cruzada.</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta filtradas, puntas de filtro Premium Fit, 0,5-20 y micro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Utilice puntas de pipeta que sean estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa. Para todos los pasos relacionados con el ADN, utilice puntas de pipeta filtradas para evitar la contaminación cruzada.</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta filtradas, puntas de filtro Premium Fit, 1-200 y micro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Utilice puntas de pipeta que sean estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa. Para todos los pasos relacionados con el ADN, utilice puntas de pipeta filtradas para evitar la contaminación cruzada.</td></tr><tr><td>Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>Utilizamos cualquiera de estos tres marcadores de peso molecular.</td></tr><tr><td>Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de peso molecular, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR, tiras de 8 tubos con tapas superiores de cúpula acopladas individualmente, natural, 0,2 ml&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Utilice tubos estériles y libres de ADN, ARNasa y DNasa. Una tira de 8 tubos es más fácil de manejar y agrupar las muestras que los tubos individuales.</td></tr><tr><td>Tubos de PCR, Ultraflux Individual&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Utilice tubos estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa.</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga Seal-Rite de 0,5 ml, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Utilice tubos estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa.</td></tr><tr><td>SYBR Tinción de gel de ADN seguro * concentración de 10,000x en DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primers para amplificar el gen Tor1a en &Delta; E-torsinA, ratones</td><td></td><td></td> knock-in, <td>5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CTC, CC-3' (adelante) y 5'-CCT CAG, GCT, GCT, CAC, AAC CAC-3' (reverso) (referencia 18). Estos cebadores se utilizaron a una concentración final de 1,0 ng/&micro; l (~0.16 &micro; M) (referencia 2).</td></tr><tr><td>Cebadores para amplificar el gen Tfap2a en ratones</td><td></td><td></td> de tipo salvaje <td>5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (adelante), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverso) para el amplicón de 498 bp, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (adelante), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverso) para el amplicón de 983 pb, y 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (adelante), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverso) para el amplicón de 1990-bp. Estos cebadores se utilizan a 0,5 &micro;M.</td></tr><tr><td>REACTIVOS - cultivo</td><td></td><td></td><td></td>celular</tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Consulte la sección de comentarios de uridina para obtener más información.</td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular 35 x 10 mm Placas, BD falcon tratado con cultivo de tejidos</td><td></td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular, T25, tratamiento con cultivo de tejidos, cuello inclinado, tapón de sellado, 25 cm2 Área de crecimiento, 70 ml</td><td>BD halcón</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular, T75, tratados con cultivo de tejidos, cuello inclinado, tapón ventilado, 75 cm2 Área de crecimiento, 250 ml</td><td>BD falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico, polipropileno, 15 ml</td><td>BD falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess (contador de números de células) portaobjetos de cámara</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de citosina &beta;-D-arabinofuranósido (clorhidrato de Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa (Dextrosa) anhidro, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Plato, Petri glass 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNasa Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>La solución madre se prepara a 1.500 unidades/20 &mu; l = 75.000 unidades/ml en agua destilada.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido en glucosa, GlutaMAX, piruvato</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro rápido de PES, 250 ml, membrana de 50 mm de diámetro, 0,2 y micro; m Tamaño de poro</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro PES rápido, 500 ml, membrana de 90 mm de diámetro, 0,2 y micro; m Tamaño de poro</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, 12 mm Redondo, espesor 0,09&ndash; 0,12 mm, Nº 0</td><td>Carolina 633017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sales equilibradas de Hanks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5% (titulación)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, 37%, reactivo A.C.S.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4&bull;( 7H2O), BioUltra, &ge; 99.5% (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Solución de Matriz de Membrana Basal, Libre de Rojo de Fenol</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>Este es el material de recubrimiento para cubreobjetos y matraces. 1) Para prepararlo, descongele la solución Matrigel Basement Membrane Matrix en hielo, lo que generalmente toma ~ 1 día. Con una pipeta preenfriada, alícuota la solución descongelada en matraces T25 preenfriados en hielo y almacene los matraces a -20 °C. Para preparar la solución de trabajo de Matrigel, descongele el Matrigel alícuota en un matraz con hielo, diluya 50 veces agregando una solución MEM preenfriada y mantenga la solución diluida a 4 °C. Es importante enfriar previamente todos los materiales y materiales que entren en contacto con Matrigel, excepto durante y después del recubrimiento de los cubreobjetos, para evitar que se forme un gel prematuramente. 2) Para recubrir los cubreobjetos de vidrio o matraces de cultivo con Matrigel, aplique la solución Matrigel sobre la superficie. Antes de enchapar las celdas, es importante secar completamente la superficie. Para este propósito, podría ser útil aspirar Matrigel durante la centrifugación celular inmediatamente antes de colocar las células y dejar suficiente tiempo para el secado.</td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Diluyente de suero, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Placas Multipocillo, Tratamiento con Cultivo de Tejidos Placa de 24 pocillos</td><td>BD falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Placas Multiwell, Placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejidos</td><td>BD falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal-A (1X), líquido</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nítrico</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Suplemento neuronal) 21&nbsp;</td><td>preparado en el laboratorio</td><td></td><td>Fuente: referencia 69</td></tr><tr><td>pipetas Pasteur, 5 y frac34; &rdquo; &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Utilice este 5 &frac34 tapón de algodón; &rdquo; Pipeta Pasteur para trituración celular. Pula la punta al fuego de antemano para alisar la superficie de corte y reducir el diámetro interno al 50-80% del original. Una punta demasiado pequeña romperá las células y reducirá la viabilidad de la célula, pero una punta demasiado grande disminuirá la eficiencia de la trituración.</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur, 9" &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl), SigmaUltra, &ge; 99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 2 ml</td><td>BD falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 5 ml&nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 10 ml</td><td>BD falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 25 ml</td><td>BD falcon</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 50 ml&nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3, Hidrogenocarbonato de sodio), SigmaUltra, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH), pellets, base de metales traza al 99,998%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4&bull;( 7H2O)), &ge; 99.99%, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa, SigmaUltra, &ge; 99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, estéril, 0.2 y micro; m</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 3 ml</td><td>BD halcón</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina, Holo, plasma bovino</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de azul de tripán, 0,4%</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Se utiliza para contar células vivas/muertas. Renueve una solución vieja de azul de tripano si se reutiliza muchas veces (por ejemplo varias veces a la semana durante varias semanas), porque formará precipitados y dará lugar a lecturas erróneas de la densidad celular.</td></tr><tr><td>Tripsina, tipo XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA, 0,25%&nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>La solución madre se prepara a 50 mg de 5-fluoro-2'-desoxiuridina y 125 mg de uridina en 25 ml de DMEM (8,12 y 20,48 mM, respectivamente).</td></tr><tr><td>REACTIVOS - inmunocitoquímica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de conejo anti-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo, cóctel monoclonal anti-GFAP de ratón</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT - tatuaje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NEO&#8211; 9</td><td>Este sistema de tatuaje de roedores neonatos es un sistema eléctrico que funciona moviendo rápidamente agujas de tatuaje de 1 o 3 puntos verticalmente en la piel. Activa la máquina de tatuar una vez durante aproximadamente 0,5 segundos, mientras las puntas de las agujas de tatuar se mantienen perpendiculares a la superficie de la piel. Preferimos el tatuaje de tres agujas para maximizar el área tatuada, pero el tatuaje de una aguja es efectivo en áreas más estrechas, por ejemplo los dedos de los pies, o si es necesario un control mecánico fino, por ejemplo cuando se tatúan números. Dos rondas de tatuaje a la velocidad más lenta (configurando "1" de 3 pasos) suelen ser suficientes para producir un tatuaje visible y duradero de las almohadillas de las patas.</td></tr>EQUIPO - sistema de electroforesis <tr><td>de genotipado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, horizontal, Wide Mini&#8211; Sub Célula GT</td><td>BIO&#8211; RAD</td><td>170&#8211; 4405</td><td>Los parámetros típicos de electroforesis son la intensidad del campo eléctrico a 6 V/cm y la duración de 25 min para un gel de 10 cm.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini termociclador</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Nuestras reacciones de PCR para el gen Tor1a en &#916; Los ratones knock-in E-torsinA son los siguientes: 1 ciclo de desnaturalización a los 94 &#176; C durante 3 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 &#176; C durante 30 segundos, recocido a 58 &#176; C durante 30 segundos, extensión en 72 &#176; C durante 2 min. A esto le sigue la extensión final en 72 &#176; C durante 10 min, y manteniéndolo a 4 &#176;C.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPO - cultivo</td><td></td><td></td><td></td>celular</tr><tr><td>Contador de células automatizado, Countess</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>Este contador de células automatizado mide por separado las densidades de las células vivas y muertas (no teñidas y teñidas con azul de tripano, respectivamente). Es importante conocer el rango óptimo de mediciones de densidad: el contador que utilizamos tiene la mayor precisión en el rango de 1 x 105 a 4 x 106 células/ml. Si los valores de densidad celular medidos se encuentran fuera del rango recomendado, ajuste el volumen de resuspensión de manera adecuada.</td></tr><tr><td>Cabina de Seguridad Biológica, Clase II, Tipo A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>Esta campana se utiliza para todos los procedimientos de cultivo celular, excepto para la disección cerebral.</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora, AutoFlow, control de humedad Camisa de agua</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Banco de limpieza horizontal</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>Este banco de limpieza se utiliza para la disección del cerebro (pasos 3.1.1 y 3.1.2 de "Disección del cerebro y disociación celular)".</td></tr><tr><td>Orbit LS Agitador de baja velocidad</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Centrífuga de supervelocidad</td><td>Fisher</td><td>46910 (centrífuga)/46922 (rotor)</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Análisis de alta resolución de la morfología y función de las neuronas de mamíferos a menudo requiere la determinación del genotipo de los animales individuales, seguido por el análisis de cultivos primarios de neuronas. Se describe un conjunto de procedimientos para: etiquetado de los ratones recién nacidos que se genotipo, genotipificación rápida, y el establecimiento de cultivos de baja densidad de las neuronas del cerebro de estos ratones. Ratones individuales están etiquetados por los tatuajes, que permite la identificación a largo plazo que dura hasta la edad adulta. Genotipado por el protocolo descrito es rápido y eficiente, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico con una buena fiabilidad. Esto es útil en circunstancias donde el tiempo suficiente para el genotipado convencional no está disponible, por ejemplo, en los ratones que sufren de letalidad neonatal. Cultivos primarios de neuronas se generan a baja densidad, que permite a los experimentos de imagen a alta resolución espacial. Este método de cultivo requiere la preparación de capas de alimentación gliales antes de chapado neuronal. El protocol se aplica en su totalidad a un modelo de ratón de la distonía trastorno del movimiento DYT1 (AE-torsinA ratones knock-in), y cultivos neuronales se prepara a partir del hipocampo, la corteza cerebral y el estriado de estos ratones. Este protocolo se puede aplicar a los ratones con otras mutaciones genéticas, así como a animales de otras especies. Además, los componentes individuales del protocolo se pueden utilizar para los sub-proyectos aislados. Por lo tanto este protocolo tendrá amplias aplicaciones, no sólo en la neurociencia, sino también en otros campos de las ciencias biológicas y médicas.

Como ejemplo de la aplicación de este protocolo, los resultados representativos se muestran para el etiquetado de los ratones por los tatuajes, genotipificación fiable en diversas condiciones experimentales, y el establecimiento de cultivos primarios de neuronas en capas de alimentación gliales. El tatuaje Los cachorros recién nacidos fueron marcadas en las almohadillas de las patas utilizando un sistema de tatuajes ('recién nacido' en la...

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

El objetivo general de este procedimiento es genotipar ratones recién nacidos y generar cultivos neuronales de baja densidad en una capa alimentadora glial. Esto se logra primero genotipificando rápidamente a los ratones recién nacidos usando las puntas de su cola en el segundo paso. El mismo día, los cerebros se diseccionan y se cultivan como capas alimentadoras gliales.Luego, después de unas semanas, otro grupo de ratones recién nacidos se genotipifican rápidamente y se generan células neuronales a partir de los cerebros del animal para su cultivo en las capas de alimentación glial anteriores. En última instancia, este método puede utilizarse para un genotipado rápido y fiable, así como para la generación de neuronas y células gliales sanas. Hay dos ventajas principales de este protocolo.Una de ellas es que podemos cultivar neuronas sanas a una densidad muy baja para experimentos de imagen colocándolas en una capa fetal glial. La segunda ventaja es que los ratones recién nacidos pueden ser genotipados en varias horas, lo que permite la coincidencia de los genotipos de las neuronas y la capa fetal glial. Soy asistente de investigación en el laboratorio de Harta.Demostraré los procedimientos para el genotipado y los cultivos. Comience agregando 200 microlitros de solución de extracción de ADN a cada tubo de PCR que contenga una muestra. Coloque la tira de tubos en un termociclador de PCR y luego comience la extracción de ADN cuando finalice la extracción.Retire la tira de tubos del termociclador e invierta los tubos cinco veces. A continuación, transfiera cuatro microlitros de extracto de ADN de cada muestra a un tubo no utilizado en una tira de ocho tubos y mezcle la muestra con 10 microlitros de dos XPCR listos. Mezcle dos, dos microlitros de cebadores mixtos hacia adelante y hacia atrás, y cuatro microlitros de agua libre de nucleasas.Para cada muestra, coloque las muestras en un termociclador e inicie el programa de ciclo térmico. Una vez finalizado el programa, cargue 20 microlitros de cada muestra amplificada o marcador de peso molecular directamente en el pocillo apropiado de un gel aros. A continuación, ejecute el gel y adquiera imágenes fluorescentes de las bandas bajo luz ultravioleta.Para detectar los productos de ADN amplificados, comience por eliminar las regiones de interés de cada hemisferio del cerebro y luego transfiera los tejidos cerebrales a un tubo de 15 mililitros. Deje que el pañuelo se asiente en el fondo del tubo y luego reemplace la solución de la parte superior de las rodajas con cinco a 10 mililitros de hielo frío. Solución de madeja con o sin suero fetal bovino como se indicó anteriormente, aspirando completamente toda la solución.Después del cuarto lavado, use una jeringa de tres mililitros para colar dos mililitros de solución de digestión que contenga tryin recién preparada a través de una jeringa de 0,2 micrómetros. Filtre directamente en el tubo que contiene los tejidos cerebrales y deje que la tripsina proceda a temperatura ambiente. Después de 13 minutos, neutralice la reacción aspirando primero la mayor parte de la solución de tripsina y luego agregando de siete a 10 mililitros de solución de madeja helada con suero fetal bovino.A continuación, enjuague los tejidos en solución de Hank con o sin suero fetal bovino como se acaba de demostrar. A continuación, filtre dos mililitros de solución de disociación en los tejidos cerebrales. A continuación, disocie mecánicamente las células con un trier suave de 10 a 20 veces utilizando un PE pulido al fuego taponado con algodón en su pipeta.Continúe el trier hasta que desaparezcan los trozos de tejido visibles. Espere tres minutos para que las piezas pequeñas se asienten y luego use la pipeta de PE para transferir aproximadamente 1,5 mililitros de la solución a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene tres mililitros de solución de Hank helada con suero fetal bovino, gire por los tubos durante 13 minutos a 185 G y cuatro grados Celsius. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con la misma pipeta pasteur.Vuelva a suspender suavemente el pellet en un mililitro de medio de recubrimiento precalentado. Luego agregue aproximadamente cuatro mililitros de medio de recubrimiento precalentado. Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T 25 sin recubrimiento y coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular.En un día in vitro, enjuague las células dos veces con cinco mililitros de medio de recubrimiento helado, una inclinando suavemente el matraz varias veces en un movimiento giratorio durante seis a nueve días in vitro, coloque 100 microlitros de material de recubrimiento con proteínas de matriz extracelular en trozos de cubierta de vidrio en una placa de cultivo celular y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, enjuague el matraz aspirando toda la solución dentro del matraz y agregando aproximadamente 13 mililitros de solución de madeja helada. A continuación, aspire la solución por completo.A continuación, filtre cuatro mililitros de una solución de tripsina EDTA más ADN directamente sobre las células y permita que las células se disocien del matraz de cultivo celular en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de 13 minutos, neutralice la reacción con dos mililitros de suero bovino 100% fetal helado y use una pipeta de cinco a 10 mililitros para transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, lavar las células añadiendo aproximadamente cuatro mililitros de solución de madeja helada con centrifugación de suero bovino fetal, y luego volver a suspender el pellet en un mililitro de medio de siembra precalentado. Uno.Ahora aspire el material de recubrimiento completamente de la cubierta, los deslizamientos y coloque aproximadamente 50 microlitros de las células gliales resuspendidas en los cubreobjetos. Para establecer la capa alimentadora glial, incube las células gliales durante 20 a 60 minutos a 37 grados centígrados, y luego agregue un mililitro de medio de recubrimiento precalentado, uno a cada cubreobjetos mientras se agrega el medio de recubrimiento. Es útil utilizar otra pipeta para presionar hacia abajo en la periferia del cubreobjetos de modo que el cubreobjetos no flote en el medio.Después de la cultura de la noche a la mañana. Reemplace el medio con un mililitro de medio de recubrimiento precalentado fresco, uno a los dos o tres días. In vitro, agregue 10 microlitros de inhibidor mitótico a cada cultivo de la capa alimentadora para inhibir la replicación del ADN y la proliferación de células gliales a los siete a nueve días.In vitro, reemplace el medio de cultivo con el medio de recubrimiento precalentado dos. A continuación, coloque suavemente aproximadamente 50 a 100 microlitros de células neuronales de ratón en un medio de siembra precalentado dos en cada capa del alimentador glial. En esta imagen, se amplificó el gen tour one a partir del ADN genómico, aislado de los clips de la cola de los recién nacidos, de las crías heterocigóticas y homocigóticas de tipo salvaje del modelo de distonía knockin DYT one.Las bandas separadas para el tipo salvaje y los alelos mutados son claramente visibles. En esta figura se muestran dos campos representativos de un cultivo neuronal del hipocampo de ratón. Se generaron a partir de la región del hipocampo CA tres, CA uno de ratones de tipo salvaje.14 días después de la siembra en una capa de alimentación glial del hipocampo preestablecida ca tres, ca una de ratones de tipo salvaje en las imágenes de contraste de interferencia diferencial, se pueden observar signos de buena salud, como un margen claro del cuerpo de la célula neuronal, procesos neuronales extendidos y una capa relativamente uniforme de células gliales. Tinción inmunocitoquímica adicional para el mapa de marcadores neuronales. Dos, también se puede observar la identificación de las neuronas y sus procesos en cada campo.Con este protocolo, se puede completar un genotipado en una ronda de cultivo en 67 horas. Este protocolo es especialmente útil para cultivar neuronas de ratones modificados genéticamente que pueden morir varios días después de nacer.

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JoVE Journal

Neuroscience

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Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

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