Name: Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Aprende a fabricar microcavidades de PDMS para estudiar la morfología celular en 3D usando células mamíferas y levadura. Este método reduce la variabilidad y mejora el análisis de organelos en entornos fisiológicos.

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Reconocemos L. Brino (planta de filtrado de contenido de alta IGBMC, Illkirch, Francia) para que nos proporciona el anticuerpo anti-Giantin, M. Labouesse laboratorio. para C. elegans (IGBMC) y B. Séraphin laboratorio. de levadura en ciernes (IGBMC), E. y A. Hyman Paluch para las células HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresde), J. Moseley (Dartmouth Medical School) y JQ Wu (Universidad del Estado de Ohio) para células de levadura de fisión; A. Hoël y F. Evenou ayuda experimental, C. Rick (IBMC, Estrasburgo, Francia) para la ayuda técnica, y JC Jeannot (Femto-st, Francia) para ayudar en la microfabricación. Este trabajo fue apoyado por fondos del CNRS, la Universidad de Estrasburgo, conectus, La Fundación para la Investigación Médica y el ci-FRC de Estrasburgo.

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No tenemos nada que revelar.

moldeo de réplica se utilizó con el fin de fabricar las &#39;hueveras. El proceso de fabricación no necesita una habitación limpia; es fácil y simple, aunque puede ser necesario un poco de práctica. En particular, la liberación de la marca de PDMS es el paso más crítico con el fin de producir una gran área de &#39;&#39; hueveras de alta calidad. Por esta razón, especial cuidado tiene que ser tomado en este paso. Si este paso se abstiene repetidamente, tenga en cuenta para optimizar los parámetros del plasma más limpios ...

Actual en ensayos basados ​​en células in vitro son de dos dimensiones (2D). Esta configuración no es natural para las células de mamíferos y, por tanto, no es fisiológicamente relevante 1; las células muestran una diversidad de formas, tamaños y fenotipos heterogéneos. Presentan serias limitaciones adicionales cuando se aplica a las aplicaciones de cribado, tales como una distribución desordenada dentro del plano y fenotipos extremos de los orgánulos celulares (fibras de estrés, en particular). Esto es particularmente importante en los ensayos clínicos de las pruebas de drogas, donde los presupuestos altos se gastan cada año. La mayoría de estos fármacos fracasan, aunque cuando se aplica a los modelos animales debido a la condición de cultivo 2D artificial en las primeras etapas de la detección de drogas. Además, mediante el uso de este enfoque, los orgánulos celulares específicos no pueden ser correctamente visualizados, tal como el anillo de actomiosina cytokinetic durante la mitosis celular, y en general estructuras que se están desarrollando en el plano perpendicular al plano de observación. Algunosnuevos ensayos 2D se han propuesto con el fin de superar los inconvenientes antes mencionados y importantes conocimientos sobre la organización del citoesqueleto se han observado 2,3. Sin embargo, estos ensayos todavía presentes una seria limitación: células muestran un fenotipo muy propagación en contraste con lo que se observa in vivo, donde las células presentan una arquitectura 3D. Estos artefactos asociados con el método de cultivo pueden desencadenar características no fisiológicas tales como las fibras de estrés mejoradas 1,4,5. Ensayos de cultivos celulares tridimensionales proporcionan múltiples ventajas en comparación con los entornos 2D 6,7. Ellos son fisiológicamente más relevantes, y los resultados son por lo tanto significativa. Como un ejemplo, las células embebidas en hidrogeles muestran estructuras 3D-como pero sus morfologías difieren de una célula a otra 8,9. Sin embargo, sus morfologías difieren de una célula a otra, lo que complica las aplicaciones de cribado. Una estrategia alternativa es la de insertar solacélulas en cavidades microfabricados 10,11. posición de la célula, la forma, la polaridad y la organización interna de la pila pueden entonces convertirse normalizado. Además de proporcionar una arquitectura 3D-como a las células, microcavidades cuenta también los estudios de cribado de alto contenido 10,12-14; células individuales pueden ser ordenados en microarrays y orgánulos celulares y sus evoluciones se pueden observar en paralelo. Esta regularidad ofrece buenas estadísticas con bajo número de células y mejores resoluciones temporales / espaciales. Los compuestos útiles son más fáciles de identificar de forma fiable. En este estudio, mostramos la fabricación y aplicación de un nuevo sistema de células sola cultura 3D-como para aplicaciones de alto contenido de cribado 10,12,13. El dispositivo consiste en una serie de microcavidades elastoméricos (10 5 cavidades / cm2), acuñadas &#39;&#39; hueveras (EC). Las dimensiones y el volumen total de la CE en este trabajo se han optimizado para el volumen típico de las células HeLa y NIH3T3 individualesdurante la división celular. La morfología de las cavidades cilíndricas - - se selecciona de forma de la célula orientar correctamente para la visualización de procesos activos. Moldeo de réplica se utiliza para una variedad de patrones CE sobre una delgada polidimetilsiloxano (PDMS) capa adherida sobre un vidrio cubreobjetos 15,16. Las células se introducen en la CE por centrifugación. Presentamos aquí la observación y la normalización de los orgánulos celulares (fibras de estrés de actina, aparato de Golgi y el núcleo) en 3D (CE) en comparación con las mismas células en 2D (plano) superficies. Nos informan también de la observación de los procesos dinámicos activos, tales como el cierre del anillo de actomiosina cytokinetic durante la mitosis celular 17. Finalmente, se muestran los resultados de esta metodología en otros sistemas con paredes rígidas, como la levadura en ciernes, levadura de fisión y C. embriones elegans que confirma la aplicabilidad de nuestra metodología para una amplia gama de sistemas modelo. A continuación presentamos una p detallado y exhaustivorotocolo con el fin de fabricar y aplicar las hueveras &#39;&#39; para la microfabricación 3D. Nuestro enfoque es simple y no necesita una habitación limpia. Anticipamos que esta nueva metodología será particularmente interesante para los ensayos de cribado de fármacos y la medicina personalizada, en sustitución de las placas de Petri. Finalmente, nuestro dispositivo será útil para estudiar la distribución de respuestas de las células a los estímulos externos, por ejemplo en el cáncer de 18 o en la investigación básica 19.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultrapuro)</td><td>Millipore-Utilice</td><td></td> <td>siempre agua dulce.</td></tr><tr><td>Parafilm (película de plástico)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Adherir Parafilm a la mesa de laboratorio con unas gotas de agua y garantizar una planitud perfecta de la superficie.</td></tr><tr><td>Foto-máscara</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="¡RANGO! D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>Oblea de silicio</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 fotorresistente</td><td></td><td>MicroChem 2000 series</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>requiere trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Revelador de SU-8</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>requiere trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>Disponible en varias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (reactivo siliconizante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>es necesario trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano (TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS produce inhalación aguda y toxicidad dérmica, y es altamente inflamable (con retroceso de ignición capaz de ocurrir a distancias considerables), por lo tanto, debe usarse en una vitrina de gases lejos de las fuentes de ignición</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m</a></td></tr><tr><td>Disponible en varias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio #0</td><td>Vidrio de punto</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>Muy frágil. Manipula suavemente.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas rectas afiladas</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>tubo de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>Disponible en varias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 kit</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131ES">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN&nbsp; </a></td></tr><tr><td>El paquete contiene tanto la base de PDMS como el agente de curado. Elastómeros similares están disponibles en varias compañías.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopio</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>Disponible en varias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de alta glucosa DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Suero para terneros bovinos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS está en 10x y debe diluirse a 1x usando el medio ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>Fisher Scientific</td><td>21083-027</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Medio para atmósferas sin control</td><td></td><td></td><td></td>de CO2</tr><tr><td>Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Penicilina & Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM</a></td></tr><tr><td>Placa de Petri P35</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a>Placa de</td></tr> <tr><td>Petri P60</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>Placa de Petri P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>Dañino en particular para los ojos, se requiere trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton 0.5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término=93443-100ML& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término=93443-100ML& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=search-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=buscar-a12379&nbsp; </a></td></tr>disolver <tr><td>polvo en 1,5 ml de metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>dilución 1:200 en PBS 1x</td></tr><tr><td>conejo policlonal anti-Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>dilución 1:500 en PBS 1x</td></tr><tr><td><a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp; </a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>conejo anti-anillina</td><td>Cortesía de M. Glotzer, Publicado en Piekny, A. J. & Glotzer, M. La anillina es una proteína de andamiaje que une RhoA, actina y miosina durante la citocinesis. Biología actual 18, 30&ndash; 6 (2008).</td><td></td><td>Dilución 1:500 en PBS 1x</td></tr><tr><td>Laboratorio de transducción</td><td>antifosfotirosina</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3 anti-conejo de cabra&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp; Dilución </a></td></tr><tr><td>1:1.000 en PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1 mg/ml durante 1 min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término = G2025 & lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término = G2025 & lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; término = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>-</td><td>-</td><td>Las células de mamíferos están disponibles en muchas compañías. Ver también Tabla 1</células</td></tr> <tr><td>NIH3T3</td> fuertes> las células <td>ATCC3T3</td><td></td> <td>están disponibles en muchas compañías. Véase también <fuerte>Tabla 1</levadura ></td></tr><tr><td>fisión fuerte&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Para más detalles sobre las cepas, contactar al autor correspondiente.&nbsp; Véase también Tabla 1</td></tr><tr><td>C. elegans gusanos</td><td>-</td><td>-</td><td>Para más detalles, póngase en contacto con el autor correspondiente.&nbsp; Ver también Tabla 1</td></tr><tr><td>YES (Agar) + 5 Suplementos incluidos</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Buscar">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Buscar&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Para la preparación: siga las instrucciones que figuran en la caja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SÍ (Medios) + 5 Suplementos incluidos</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Buscar">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Buscar&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Para la preparación: siga las instrucciones que se dan en la caja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM (Media)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Buscar">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Buscar&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Para la preparación: siga las instrucciones que se indican en la caja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro EMM esterilizado (Medios) - Solo para imágenes</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>Para la preparación: siga las instrucciones que se indican en la caja. Filtre y esterilice los medios con un 0.22 &micro; M en lugar de esterilizar en autoclave. Esto da transparencia al medio y reduce la autofluorescencia.</td></tr><tr><td>Suplementos (para EMM)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Buscar">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Buscar</a></td></tr><tr><td>&nbsp;( Añadir 225 mg/L en el medio EMM antes de esterilizar en autoclave o filtrar)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros estériles accionados por vacío Stericup y Steritop</td><td>Millipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2</a></td></tr></tbody></table>

ordenando las células individuales y solo los embriones en 3d confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Las células biológicas se observan generalmente en las superficies planas (2D). Esta condición no es fisiológico y fenotipos y formas son muy variables. Selección basada en células en estos entornos tienen limitaciones, por lo tanto graves: orgánulos celulares muestran fenotipos extremos, morfologías celulares y tamaños son orgánulos celulares heterogéneas y / o específicos no se pueden visualizar correctamente. Además, las células in vivo se encuentran en un entorno 3D; en esta situación, las células muestran diferentes fenotipos principalmente debido a su interacción con la matriz extracelular que rodea el tejido. Con el fin de estandarizar y generar orden de las celdas individuales en un entorno 3D fisiológicamente relevante para los ensayos basados ​​en células, se presenta aquí la microfabricación y las aplicaciones de un dispositivo para el cultivo in vitro de células en 3D. Este dispositivo consiste en una matriz 2D de microcavidades (típicamente 10 5 cavidades / cm 2), cada uno lleno con células individuales o embriones. posición de la célulación, la forma, la polaridad y la organización interna de la celda se convierten entonces normalizado que muestra una arquitectura 3D. Utilizamos moldeo réplica al patrón de una serie de microcavidades, hueveras &#39;&#39;, sobre una delgada polidimetilsiloxano (PDMS) capa adherida sobre un cubreobjetos. Las cavidades se cubrieron con fibronectina para facilitar la adhesión. Las células se insertan por centrifugación. porcentaje de llenado se ha optimizado para cada sistema que permite hasta 80%. Las células y los embriones se confirmó la viabilidad. Se aplicó esta metodología para la visualización de orgánulos celulares, tales como aparato de Golgi y el núcleo, y para estudiar los procesos activos, tales como el cierre del anillo cytokinetic durante la mitosis celular. Este dispositivo permitió la identificación de nuevas características, tales como la acumulación y la falta de homogeneidad de la miosina y actina periódicas durante el cierre del anillo cytokinetic y fenotipos compactados de Golgi y la alineación núcleo. Nos caracteriza el método de células de mamífero, levadura de fisión, la levadura en ciernes, C. elegans wITH adaptación específica en cada caso. Por último, las características de este dispositivo lo hacen particularmente interesante para los ensayos de cribado de fármacos y la medicina personalizada.

Las hueveras '' (EC) son una metodología novedosa de alto contenido de cribado que permite la visualización de las células y embriones orientadas en un entorno 3D. Además, algunos procesos celulares, que son difíciles de observar en cultivos estándar 2D (planos), pueden ser observados por este nuevo método. La figura 1a muestra un resumen del procedimiento de la microfabricación CE (ver también la Sección 1 en el protocolo anteriormente descrito ). El método es simple, rápido, eficiente y sin ningún req...

Se presenta un dispositivo y un nuevo método para estudiar las células y embriones. Las células individuales se ordenan precisamente en matrices microcavidad. Su confinamiento en 3D es un paso hacia entornos 3D se encuentran en condiciones fisiológicas y permite la orientación orgánulo. Mediante el control de la forma celular, esta configuración reduce al mínimo la variabilidad reportado en ensayos estándar.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar la morfología y la dinámica de los orgánulos celulares en una serie de microcavidades que imitan el entorno 3D que se encuentra en condiciones fisiológicas. Para las células con paredes rígidas, como la levadura de fisión, las cavidades pueden organizar y orientar las estructuras celulares. Esto se logra fabricando primero una matriz de pilares de PDMS a partir de un maestro para obtener una matriz de microcavidades de PDMS, denominadas hueveras, mediante moldeo de réplica.Como segundo paso, las hueveras se funcionalizan con proteínas de la matriz extracelular y se introducen en un tubo con una pieza cilíndrica de plástico hecha a medida, que soporta la muestra de microcavidad y permite la introducción de células individuales de mamífero en cada una de las microcavidades. A continuación, se retiran las hueveras llenas de células y se incuban con el fármaco o compuesto de interés con el fin de estudiar el fenotipo y los procesos dinámicos de las células en un confinamiento 3D. Se obtienen resultados que muestran diferencias en el fenotipo celular y nuevas estructuras dinámicas observadas en comparación con los ensayos 2D in v

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Bioengineering

Bioingeniería

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células individuales con una plataforma microfluídica, que utiliza un nuevo concepto de diseño de micropozos para permitir el aislamiento de células individuales de alta eficiencia y el cultivo clonal a largo plazo.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Presentamos un procedimiento para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener una formación de patrón repetible. Un dispositivo cúbico que contiene dos diferentes hidrogeles se emplea para lograr la proyección de imagen multi-direccional para la formación de patrones de tejido.

Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Este protocolo explica cómo preparar y montar muestras bacterianas para imágenes tridimensionales en vivo y cómo reconstruir la forma tridimensional de E. coli a partir de esas imágenes.

Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

Este protocolo detalla un método para la producción de tres tipos diferentes de esferoides de una manera que los hace adecuados para la detección y el análisis de alto contenido a gran escala. Además, se presentan ejemplos que muestran cómo se pueden analizar a nivel de células esferoides e individuales.

Un método robusto para la producción a gran escala de esferoides para aplicaciones de detección y análisis de alto contenido

Aprende a fabricar microcavidades de PDMS para estudiar la morfología celular en 3D usando células mamíferas y levadura. Este método reduce la variabilidad y mejora el análisis de organelos en entornos fisiológicos.

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Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

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