Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

El objetivo general del siguiente experimento es observar la morfología y la dinámica de los orgánulos celulares en una serie de microcavidades que imitan el entorno 3D que se encuentra en condiciones fisiológicas. Para las células con paredes rígidas, como la levadura de fisión, las cavidades pueden organizar y orientar las estructuras celulares. Esto se logra fabricando primero una matriz de pilares de PDMS a partir de un maestro para obtener una matriz de microcavidades de PDMS, denominadas hueveras, mediante moldeo de réplica.

Como segundo paso, las hueveras se funcionalizan con proteínas de la matriz extracelular y se introducen en un tubo con una pieza cilíndrica de plástico hecha a medida, que soporta la muestra de microcavidad y permite la introducción de células individuales de mamífero en cada una de las microcavidades. A continuación, se retiran las hueveras llenas de células y se incuban con el fármaco o compuesto de interés con el fin de estudiar el fenotipo y los procesos dinámicos de las células en un confinamiento 3D. Se obtienen resultados que muestran diferencias en el fenotipo celular y nuevas estructuras dinámicas observadas en comparación con los ensayos 2D in vitro estándar basados en la orientación de las células.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ensayos estándar de cultivo celular en 2D, es que las células de mamíferos en hueveras experimentan un entorno 3D similar a los microentornos lógicos, pero están dispuestas en un grado ordenado y estandarizado. El orden y la orientación también son mejoras significativas en el caso de la levadura de fisión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del esqueleto celular y el descubrimiento de fármacos, como la identificación de fármacos nuevos y anticancerígenos con cribado de alto contenido.

Las implicaciones de esta técnica se extienden al diagnóstico de enfermedades multifactoriales como el cáncer, ya que los ensayos de cribado de fármacos se pueden realizar y analizar fácilmente mediante hueveras, lo que hace que este método sea especialmente interesante para la medicina personalizada. Este método puede proporcionar información clave para las estructuras organizadas y la dinámica en células individuales de mamíferos y células de levadura de fisión, y también se puede aplicar para organizar el estudio, desarrollar embriones como C. elegans y ri-so-flu-a. En este protocolo, una serie de microcavidades o hueveras se modelan sobre una capa de polidimetilsiloxano o PDMS adherida en un cubreobjetos mediante una moldura de réplica.

El primer paso es la fabricación del maestro, que no se mostrará, pero se describe en el protocolo de texto. Una vez que se ha hecho el maestro, el siguiente paso es fabricar la réplica del PDMS. En un tubo de 50 mililitros, mezcle bien el reticulante y el prepolímero en una proporción de uno a 10 peso a peso o volumen a volumen para un total de 30 gramos.

Centrifugar el tubo a 1.800 veces g durante cinco minutos para eliminar las burbujas de aire. Deje caer suavemente el PDMS sobre el maestro. Si aparecen burbujas, desgasifica la mezcla.

Coloque la muestra en un horno a 65 grados centígrados durante cuatro horas. Después de curar el PDMS, use un bisturí para cortar suavemente el área de interés de aproximadamente un centímetro cuadrado, que incluye aproximadamente de 10 a la quinta microcavidades, o hueveras. Despegue el sello PDMS suavemente.

Para comenzar el procedimiento de moldeo de réplicas, active el sello PDMS mediante tratamiento con plasma de oxígeno durante 30 segundos. Guarde el sello activado temporalmente en una placa de Petri cerrada para evitar la deposición de polvo. Trabajando en una campana extractora, coloque el sello PDMS activado con el lado con las estructuras hacia arriba o boca arriba en una placa de Petri junto a una tapa de 15 mililitros.

Llene el tapón con 200 microlitros de trimeticlorosilano. Cierre la placa de Petri y deje que el sello se salinice durante siete minutos. Coloque el sello PDMS en la máquina de recubrimiento giratorio con las estructuras al revés.

Coloque una pequeña gota de PDMS líquido encima de las estructuras. Gire la capa a 1500 RPM durante 30 segundos para depositar una fina capa de PDMS en la parte superior de las estructuras. Coloque el sello en el horno a 65 grados centígrados durante cuatro horas para curar la capa de PDMS recubierta de centrifugado depositada.

A continuación, active la capa delgada de PDMS colocando el sello de PDMS boca arriba junto con un engobe de cubierta de vidrio en un limpiador de plasma de oxígeno durante 30 segundos. Coloque inmediatamente el sello en contacto con la cubierta de vidrio y presione suavemente alrededor de la superficie del sello con pinzas para la unión. Después de eso, mantenga una presión constante sobre el sello durante unos 10 segundos.

30 minutos después, despegue suavemente el sello de la cubierta para liberar las hueveras. Tenga mucho cuidado de no romper la muestra. Enjuague bien las hueveras con etanol y séquelas.

Si las hueveras de PDMS no están en el envase de la cubierta de vidrio y se desprenden durante el paso de desfijación, considere ajustar la configuración del limpiador de plasma y reinicie el procedimiento para el moldeo de réplicas. Para facilitar la manipulación de la muestra posterior, se recomienda pegar un pequeño trozo de PDMS curado en el borde del cubreobjetos. En el caso de las células de mamíferos presentadas en este vídeo, la superficie del PDMS debe funcionalizarse con proteínas de adhesión de la matriz extracelular.

Hidrofililice las hueveras en el limpiador de plasma de oxígeno durante 30 segundos. Después de eso, esterilice las hueveras con luz ultravioleta durante cinco minutos. Deposite una pequeña gota de solución de fibronectina para cubrir toda el área de la huevera e incube durante una hora a temperatura ambiente.

Proteja la muestra del secado. Enjuague suavemente las hueveras con aproximadamente un mililitro de PBS, utilizando una pipeta dispensadora de plástico. Repita un total de tres veces.

A continuación, coloque una pieza cilíndrica de plástico hecha a medida en un tubo de 50 mililitros. Agregue 13 mililitros de medio de cultivo celular al tubo. El medio debe alcanzar al menos dos centímetros por encima de la pieza cilíndrica para garantizar la inmersión completa de la muestra.

Usando pinzas afiladas y rectas para sujetar la muestra por el mango del PDMS, coloque con cuidado las hueveras dentro del tubo, presionando suavemente el cubreobjetos hasta que quede encima de la parte superior de la pieza de plástico y esté completamente sumergido. Las células que se introducirán en las hueveras deben cultivarse hasta una confluencia del 80 al 100% y resuspenderse en cinco mililitros de medio de cultivo. Pipetear 200 microlitros de células encima de las hueveras, dejando caer las células lo más centradas posible sobre las hueveras, pero evitando el contacto físico.

Esto evitará roturas y/o daños en la muestra. Centrifugar el tubo de 50 mililitros a 1.800 veces g durante dos minutos. Pipetear otros 200 microlitros de células encima de las hueveras y centrifugar de nuevo a 1.800 veces g durante dos minutos.

Repita un total de tres veces para optimizar el porcentaje de llenado. Después de la última centrifugación, verifique el porcentaje de llenado de las hueveras con un microscopio. Usando las pinzas para sujetar el mango de PDMS, retire la muestra con cuidado del tubo sin alterar las células de las hueveras y coloque la muestra en una placa de Petri con medio.

Para eliminar el exceso de células que no están en las hueveras, enjuague pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces a cada lado de la matriz de microestructuras. Por último, reemplace el medio con medio nuevo para eliminar las células no adheridas. Para observar orgánulos celulares fijos, coloque las hueveras con una muestra fija en la platina de un microscopio invertido de epifluorescencia y seleccione el objetivo de aceite 60x.

En este ejemplo, la muestra son fibroblastos NIH 3T3, donde se han teñido el aparato de Golgi, el núcleo y las fibras de actina. Enfoque cuidadosamente usando luz de campo brillante hasta que las hueveras y las células estén en el plano de observación. Seleccione y enfoque la región de interés e inicie la captura de la imagen.

Comience este procedimiento colocando las hueveras en un soporte de microscopio y llenándolo con un mililitro de medio de cultivo celular FCS L15 al 10%. Instale el soporte en la platina del microscopio. Para evitar la evaporación, coloque una tapa de vidrio encima del soporte.

Observe las células con un microscopio invertido de epifluorescencia equipado con un objetivo de aceite de 60x. En este ejemplo se utilizan células HeLa que expresan miosina y actina marcadas con fluorescencia, dos moléculas clave implicadas en el cierre del anillo citocinético durante la mitosis. Seleccione la región de interés y busque un anillo citocinético, utilizando el canal GFP o Texas Red.

Enfócate con precisión. Ejecute la adquisición automática en ambos canales hasta que el anillo esté completamente cerrado. Las imágenes de microscopio electrónico de barrido de las hueveras muestran que su forma y tamaño son muy regulares.

Para células con paredes rígidas, como la levadura de fisión, las hueveras pueden orientar el anillo citocinético. En el caso de las células de mamíferos, una comparación entre las células de las hueveras en 3D y las superficies planas en 2D revela que las primeras forman una matriz ordenada con un fenotipo homogéneo de tipo esférico, mientras que las segundas muestran una morfología desordenada y heterogénea. Las células de las hueveras también muestran una reducción en el número de fibras de estrés, como lo indica el número de efectos modestos del tratamiento con blebbistatina.

El aparato de Golgi en los cultivos 2D suele mostrar un fenotipo extendido, mientras que en las hueveras muestra un fenotipo más compactado. Esto fue confirmado por una cuantificación de los fenotipos de Golgi. Por último, en las superficies 2D, el núcleo celular está orientado aleatoriamente, mientras que en las hueveras, está orientado ortogonalmente en el plano xy, tanto en las células de tipo salvaje como en las tratadas con blebbistatina.

Una determinación de los valores de esfericidad del núcleo revela que las hueveras no afectan la esfericidad normal del núcleo celular. Sin embargo, la diferencia entre las células de tipo salvaje y las tratadas con blebbistatina en las hueveras sugiere que las hueveras están revelando un efecto real del fármaco que se enmascara en 2D. Los estudios con células vivas con hueveras permiten identificar nuevos procesos activos, que no son visibles en los cultivos estándar.

Por ejemplo, se observaron acumulaciones periódicas de miosina que se mueven radialmente a medida que el anillo citocinético se cierra durante la mitosis en las células HeLa. Una vez dominadas, las hueveras se pueden preparar a partir de una réplica en menos de seis horas, y el llenado de las celdas se puede hacer en unos 15 minutos. Al intentar este proceso, es importante tener el tamaño de las hueveras para las células en estudio.

Este procedimiento se puede adaptar aún más a las plataformas de cribado de alto contenido de las empresas farmacéuticas para actividades de cribado masivo y también en ensayos diagnósticos personalizados de pacientes para evaluar tratamientos específicos individuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar y usar las microcavidades de las hueveras. Las hueveras estandarizan y generan orden a una variedad de sistemas similares, que van desde células individuales sin paredes, como las células de mamíferos, hasta sistemas con paredes, como la levadura y el embrión.