Name: La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende a medir cambios conformacionales en proteínas de membrana mediante LRET con sitio de corte proteásico en células de mamífero. Este método permite observar dinámicas proteicas en tiempo real sin necesidad de purificación previa.

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Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM094246, la American Heart Association Beca 11GRNT7890004, y la Fundación Nacional de Ciencia de subvención MCB-1110501.

1. Cree la construcción que contiene la proteína de interés Clonar el gen que expresa la proteína de interés en un vector adecuado. Use vectores tales como la serie pcDNA o pRK5 ya que son muy adecuados para la expresión en sistemas de mamíferos como células HEK293 y CHO. 2. Seleccione los sitios en la proteína que se han etiquetado con la Fluoróforos <ol><li> Elija los sitios de etiquetado que son capaces de reflejar posibles cambios conformacionales en la proteína. Si es posible, utilice una estructura cristalina de la proteína o de una proteína homóloga a ayudar a hacer esta determinación. Si no hay ninguna estructura cristalina disponible, utilizar software en línea para predecir la posible estructura de la proteína y por lo tanto recibir penetración en los sitios apropiados. </li><li> Elija residuos tales que las cadenas laterales de los residuos seleccionados son de superficie expuesta y accesible para los fluoróforos de modo que la proteína puede ser etiquetado. <ol><li> Elija residuos queno son críticos para la función de proteínas, por ejemplo, los sitios que no están involucrados en la unión del ligando. </li><li> En la introducción de la mutación cisteína, dar preferencia a los sitios que son similares, por ejemplo, serina, que podrían causar perturbación mínima a la estructura de la proteína. </li><li> Después de la elección de los sitios de etiquetado, que las mutaciones para asegurar que la proteína sólo da LRET de estos sitios previstos. Utilice protocolos estándar de mutagénesis dirigida al sitio para mutar de distancia cisteínas no unidas por disulfuro que podrían unirse a maleimida conjugados etiquetas fluorescentes. No mutar distancia cisteínas unidas por disulfuro y enterrados, cisteínas libres ya que no deben reaccionar con tintes fluorescentes en forma plegada de la proteína. </li></ol></li><li> Introducir residuos de cisteína en los sitios deseados por hacer mutaciones puntuales utilizando protocolos estándar de mutagénesis dirigida al sitio. </li><li> Incluir un sitio de escisión de la proteasa que puede escindir específicamente de una de las cisteínas de la proteína. Si elsecuencia proteica permite, introducir el sitio por conservadoramente mutando la proteína para tener una trombina (secuencia de reconocimiento LVPRGS) o Factor Xa (secuencia de reconocimiento IDGR o IEGR) secuencia cerca de la cisteína introducida y accesible a la proteasa de escisión; de otro modo la secuencia de tetra o hexa-péptido puede ser insertado como un todo. Elige el sitio de tal manera que tras la escisión una de las cisteínas introducidas se disocia del resto de la proteína-en ciertos casos, esto puede requerir dos sitios de escisión que flanquean una cisteína mutado. </li></ol> 3. Pruebe la Expresión y la funcionalidad de la proteína <ol><li> Realizar una transferencia de Western para confirmar la expresión de la proteína mutada. </li><li> Realizar un ensayo funcional de la proteína para asegurar que las mutaciones han alterado la función de la proteína sólo mínimamente, en todo caso, para evitar estudiar los cambios conformacionales de una proteína disfuncional. NOTA: Dado que todas las proteínas tienen diferentes funciones, no existe una única f ensayo unctional que se utiliza específicamente para LRET; sin embargo, algunos ejemplos de ensayos funcionales incluyen ensayos enzimáticos de actividad de enzimas, ensayos de unión a ligandos para los receptores, y los estudios de electrofisiología para canales iónicos. </li></ol> 4. Seleccione los fluoróforos para ser usados Seleccionar fluoróforos basados ​​en el rango de distancia de esperar que se mide de tal manera que el rango es entre 0 0.5-1x la R del par fluoróforo. NOTA: Esto permite una más fácil sustracción del fondo, que tiene típicamente tiempos de vida más largos. Por ejemplo, si se mide el rango de distancia esperada es de alrededor de 35 Å, un par fluoróforo apropiado utilizar sería quelato de terbio como donante y Alexa 594 como receptor, ya que el R 0 para este par es de 53 Å (Tabla 1). 5. expresar la proteína mediante transfección transitoria de la cantidad necesaria de células de mamíferos ntent "&gt; transitoriamente transfectar la proteína de interés en las células de mamíferos escogidos utilizando cualquiera de los reactivos de transfección comunes Normalmente, utilice cuatro placas de 10 cm por experimento LRET para líneas de células HEK y CHO;. Sin embargo, esta cantidad puede variar en función de la expresión de proteínas , estabilidad, etc. permitir que las células expresan la proteína de 36-48 h antes de la cosecha. 6. Rotula las Proteínas <ol><li> Separar las células de la placa de cultivo. Separar las células HEK simplemente pipeteando amortiguador contra la parte inferior del plato. Separe las células CHO con un raspador de células, lavarse de los medios de comunicación con tampón extracelular. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 1100 xg durante 3 min. Utilice estos mismos ajustes de centrífuga para recoger células después de etiquetado, así como después de los lavados posteriores. </li><li> Suspender las células en 3 ml de tampón extracelular, a continuación, añadir los fluoróforos donador y aceptor en cantidades equimolares hasta una concentración final de 100-300 nM. Incubar en un rotador fo 1 hora a TA. </li><li> Lavar estas células marcadas 3-4 veces con tampón extracelular para eliminar fluoróforos no unidos, a continuación, suspender estas células en tampón extracelular (por lo general 2 ml) para las mediciones de LRET. </li><li> Como control, etiquetar un conjunto separado de las células con sólo fluoróforo donante (quelato de terbio) sin la adición de cualquier fluoróforo aceptor. NOTA: Los datos de estos experimentos de donante sólo es necesario para completar el análisis. Estos experimentos se pueden realizar en el mismo o diferentes días. </li><li> Una vez más, realizar la validación funcional, esta vez con la proteína mutante marcado, como el proceso de etiquetado también puede interferir con la función dependiendo del sitio utilizado para el etiquetado. NOTA: Estos experimentos se pueden realizar en el mismo o diferentes días. </li></ol> 7. preparar el experimento LRET <ol><li> Colocar las células resuspendidas en una cubeta de cuarzo con un volumen mínimo de 1 ml. </li><li> Encienda el ordenador y el instrumento y ajustar los parámetros de la datun programa de adquisición en consecuencia. <ol><li> Establecer la longitud de onda de excitación a la gama de absorbancia del fluoróforo donante (330-340 nm funciona bien para quelato de terbio). </li><li> Ajuste la longitud de onda de emisión de forma adecuada, teniendo en cuenta que la emisión del aceptor varía en función del aceptor utilizado. Es importante destacar que seleccionar una longitud de onda de detección que mide sólo la emisión del aceptor y no incluye cualquier sangrado a través de la emisión del donante. Por ejemplo, utilizar una longitud de onda de 565 nm para Alexa 555 como un aceptor Tabla 1. Para las mediciones de donante único, en el que la proteína se marcó sólo con donantes pero sin aceptador, utiliza una longitud de onda de 545 nm para la medición de emisiones de quelato de terbio. </li><li> Establezca el tiempo de detección de emisiones sea al menos tres veces el tiempo de vida esperado LRET para asegurar que un componente de largo curso de la vida no se puede perder. </li></ol></li><li> Lleve a cabo la exploración. Hacer por lo menos tres exploraciones de 99 barridos para asegurar la consistencia de los resultados. Ahorra ªe los resultados como un archivo de texto (* txt). </li><li> Para medir los cambios conformacionales de una proteína con respecto a las diferentes condiciones (tales como la adición de un ligando), alterar esas condiciones y de nuevo realizar al menos tres exploraciones de 99 barridos cada uno en la misma muestra en esta nueva condición. Si el estudio de los efectos del glutamato sobre la conformación de receptores de glutamato, por ejemplo, añadir glutamato a 1 mM a la misma muestra de escaneado en el paso 7.3, y luego escanear de nuevo. </li><li> Agregue hasta cinco unidades de la proteasa adecuada y tomar las exploraciones continuamente hasta que la escisión es completa y no profundizar el cambio es visto en el curso de la vida de tres exploraciones sucesivas. Por lo general, la escisión se completa en dos a 3 hr. Si un sitio de escisión de Factor Xa se usa para la escisión de la proteasa, por ejemplo, añadir 3 l de Factor Xa a la muestra, y escanear cada 30 min durante 3 horas. </li></ol> 8. Analizar los datos obtenidos <ol><li> Abra el software de análisis de datos. </li><li> Cargue el tiempo de vida de fluorescenciadatos mediante la importación ASCII para abrir los archivos de texto. Cargar todas las réplicas, así como las mediciones de fondo final, en un solo archivo. </li><li> La media de los datos de todas las exploraciones para cada condición experimental para obtener los datos finales. Para ello, seleccione las columnas que contienen los ensayos individuales, a continuación, en el menú Datos en la barra de menú, haga clic en Estadísticas en filas para mostrar las intensidades medias de fluorescencia de los ensayos, así como la desviación estándar y error estándar. </li><li> Representar gráficamente los valores medios como un gráfico de líneas con la intensidad de fluorescencia en el eje Y y la vida útil en microsegundos en el eje X para crear una curva que representa el tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor. Cambiar el eje Y de la parcela a una escala logarítmica, para permitir una mejor visualización de los datos. </li><li> Repita el paso 8.3 en los datos de medición de fondo, con un promedio de las exploraciones finales que muestran la superposición indica la escisión completa. </li><li> Visualizar los datos de la media de antecedentes sobre lamisma trama que contiene los datos en bruto en promedio. Para ello, abra el cuadro de diálogo Control de capas se encuentra bajo el menú Plot. Luego, transferir los datos que contienen el fondo significa en la lista de contenidos de capa. </li><li> Alinear los datos de la media de fondo a los datos brutos medios. Para ello, utilice la función matemática simple en el menú Math para multiplicar o dividir los datos de fondo como sea necesario hasta que el extremo de la cola del fondo coincide con el final de los datos en bruto. NOTA: En este extremo de la cola, el tiempo de vida de la proteína de interés debería tener ya completamente decaído; lo que está alineado es simplemente la señal de fondo presente antes y después de la escisión de la proteasa. </li><li> Reste la señal de fondo alineado de la señal inicial LRET prima, siempre con la función matemática simple. </li><li> Ajustar los datos a un decaimiento exponencial (exponenciales únicos o múltiples, dependiendo de los sitios y el diseño experimental). <ol><li> Establecer el límite de inicio para el montaje para comenzar después del finaldel pulso de láser. Utilice este mismo punto de inicio para todos los accesorios de curvas posteriores. </li><li> En el cuadro de diálogo Función de montaje Select, seleccione decaimiento exponencial con el fin de adaptarse a la vida con la siguiente ecuación para una sola caída exponencial: <img alt="Ecuación 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200"> Eq. 4 donde, Y representa la intensidad de fluorescencia, y 0 representa la intensidad de fondo debido al ruido del sistema, A 1 es la intensidad de la señal, t es el tiempo de vida de fluorescencia, x es el tiempo, y x 0 es el desfase de tiempo. </li><li> Fijar x 0 hasta 0, comenzar la función de ajuste, y ajustar los datos. NOTA: Si el experimento está diseñado para tener la señal sólo de un par de sitios, los datos resultantes deben ser de fácil ajuste por un único decaimiento exponencial 8. El residual del ajuste es un buen método para determinar la bondad del ajuste y si vidas decaimiento adicionales son required. </li></ol></li><li> Usa los tiempos de vida obtenidos a partir de los datos para calcular la distancia entre los fluoróforos usando la ecuación de Förster (un reordenamiento de las ecuaciones 1 y 2 anteriores): <img alt="Ecuación 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200"> Eq. 5 NOTA: Todas las variables son como se ha mencionado anteriormente, con τ DA haber sido medido como el tiempo de vida de emisión sensibilizada del aceptor. Más detalles y ejemplos sobre las mediciones de R 0 y R se pueden encontrar en otro lugar 7,9,10. </li><li> Repetir el análisis experimento y los datos de al menos tres veces para asegurar la reproducibilidad. La inconsistencia entre las repeticiones individuales de la misma medida pone en duda la validez de los datos; utilizar experimentos o repeticiones de control adicionales. Calcular errores en la medición utilizando el Gustavus calculadora libre Análisis de errores (desarrollado por el Dr. Thomas Huber) o un sistema similar que se propaga el error en elarrebatos de la vida. </li></ol>

<ol><li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li>
<li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate%3A+improvements+on+fluorescence+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li>
<li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li>
<li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates%3A+part+2%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li>
<li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li>
<li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li>
<li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+%28NMDA%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li>
<li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbium%28III%29+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

LRET es una técnica poderosa que permite a los científicos para medir distancias entre dominios dentro de una única proteína, así como entre las subunidades en una proteína multimérica. Como tal, LRET está bien adaptado para el examen de los cambios conformacionales y dinámica de las proteínas u otras macromoléculas. El protocolo anterior debe permitir el laboratorio debidamente equipado para probar fácilmente sus hipótesis; Sin embargo, hay muchas fuentes comunes de error que pueden plagar el nuevo investigador. Si se ...

Transferencia de Energía de Resonancia de luminiscencia (LRET) es un derivado de la técnica bien conocida de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) 1. Similar a la FRET, LRET se puede utilizar para medir distancias y los cambios de distancia entre donante y aceptor fluoróforos unidos a sitios específicos en la proteína de interés dentro de la gama de 10-100 Å 1-3. Los principios de LRET son también similares a FRET en que la transferencia de energía de resonancia se produce entre dos fluoróforos proximales cuando el espectro de emisión del fluoróforo donante se solapa con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. La eficiencia de esta transferencia está relacionada con la distancia entre los dos fluoróforos por la siguiente ecuación: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120"> Eq. 1 donde R es la distancia entre los dos fluoróforos, E es la eficiencia de la norma ENtransferencia ener-, y R 0, se discute a continuación, es el radio de Förster para el par fluoróforo, es decir, la distancia a la que la eficiencia de la transferencia es la mitad de la máxima. A partir de esta ecuación, se puede ver que la eficiencia está relacionada con la magnitud de la distancia elevado a la sexta potencia inversa 1. Es esta dependencia sexta potencia inversa que permite la FRET y las mediciones lRet ser exquisitamente sensible, incluso a pequeños cambios de distancia cuando está cerca del 0 R del par de FRET. La capacidad para etiquetar específicamente sitios deseados en proteínas u otras macromoléculas permite a uno tomar ventaja de esta sensibilidad para monitorizar los cambios conformacionales. Cuando se compara con FRET, que utiliza moléculas de colorantes orgánicos convencionales, LRET ofrece ventajas adicionales. En LRET, en lugar de utilizar un colorante orgánico como el fluoróforo donante, un catión serie de los lantánidos, normalmente Tb 3 + o Eu 3 +, se utiliza 1,4-6. Los fluoróforos que u caennder esta categoría, por ejemplo, quelato de terbio, son también muy versátil en que se pueden utilizar con una amplia gama de fluoróforos aceptores. Esta flexibilidad es posible porque los espectros de emisión de los lantánidos quelados contienen múltiples picos de emisión agudos, lo que permite una única especie de fluoróforo donante para ser utilizado con una de una amplia variedad de fluoróforos aceptores. Por lo tanto, la emisión aceptor sensibilizado puede ser detectado sin ningún temor a la contaminación de sangrado a través de la emisión de los donantes 5. El experimentador selecciona el aceptor específico basado en la distancia esperada entre los dos fluoróforos (Figura 1 y Tabla 1). En estos fluoróforos lantánidos quelados, el ión metálico es quelado por una molécula que contiene un grupo de antenas que sensibiliza al lantánido normalmente mal de absorción a la excitación, así como un grupo funcional biorreactivo para atar el ion a un grupo funcional específico de la macromolécula 1, 5,6. Once excitado, lantánidos relajarse al estado fundamental a través de la liberación de fotones con una tasa de atenuación en el rango de milisegundos. Debido a que la descomposición es ni una relajación-singlete-singlete ni a una relajación triplete a singlete, la emisión de fotones no puede adecuadamente ser llamado fluorescencia o fosforescencia, pero se denomina más correctamente la luminiscencia 1. La larga decadencia de la luminiscencia de los lantánidos ayuda mucho en las mediciones de toda la vida. Mediciones de por vida se pueden utilizar para determinar la eficacia a través de la siguiente relación: <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120"> Eq. 2 donde, E es la eficiencia de la transferencia, τ D es el tiempo de vida del donante (lantánido quelado) cuando no participan en la transferencia de energía, y τ DA es el tiempo de vida del donante cuando se participa en la transferencia de energía con el aceptor. Con LRET, DA τ puede colasí ser medido como el tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor debido a la vida de terbio es mucho más grande que un fluoróforo aceptor orgánico. El aceptor emite con la misma vida útil como su excitación incitar (lantánido donante), y cualquier contribución a la vida útil de la propia vida de la fluorescencia intrínseca del aceptor es relativamente insignificante. Mediante la medición de la emisión sensibilizada lugar de emisión del donante, también eliminamos la necesidad de garantizar el etiquetado exactamente en una proporción 1: 1 de los donantes al aceptor. La proteína puede marcarse en lugar simultáneamente con ambos fluoróforos donantes y aceptor. Dará como resultado una población heterogénea marcada, pero las proteínas marcadas con doble donantes no emitirá en la longitud de onda y aceptor proteínas marcadas doble aceptor no le hará ilusión. Por otra parte, la distancia entre fluoróforos debe ser la misma, independientemente de qué sitio cisteína un fluoróforo dado se une a, especialmente cuando se utilizan los lantánidos isotrópicas como un donante, por lo que el need para especificar un sitio determinado para recibir ya sea el donante o aceptor es innecesaria. La intensidad puede ser afectada con una población heterogénea, pero aún debe ser más que suficiente para ser detectado. Cuando la planificación de los experimentos, la elección de fluoróforos debe ser dictado por el valor de R 0 de la pareja, así como el rango de distancia esperada que está siendo medido. El valor de R 0 se define por la siguiente ecuación: <img alt="Ecuación 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250"> Eq. 3 donde, R 0 es el radio de Förster en Angstroms, κ 2 es el factor de orientación entre los dos colorantes (se asume que son 2/3), φ D es el rendimiento cuántico del donante, J es el solapamiento espectral integral entre el donante de espectro de emisión y el espectro de absorbancia del aceptor en M - 1cm -1 nm 4, y n es el índice de refracción del medio 1. Nuestro laboratorio ha añadido una modificación a la técnica convencional LRET mediante la introducción de un sitio de reconocimiento de proteasa entre los sitios donador y aceptor de etiquetas en la proteína que se probaron. Esta modificación permite la investigación en sistemas no-purificada tales como células de mamífero enteros 7. Esta técnica es particularmente útil cuando se utiliza cisteínas como sitios para el etiquetado, ya que en el proceso de etiquetado con tintes-maleimida conjugado que se unen a los grupos sulfhidrilo de cisteína, otras proteínas en las células que tienen cisteínas también se marcan. Sin embargo, mediante la inclusión de sitios de escisión de la proteasa de la proteína de interés y la medición de tiempos de vida antes y después de la escisión, el experimentador puede restar cuantitativamente la señal de fondo después de la escisión de la proteasa a partir de la señal sin procesar. Esta resta aísla la señal específica derivada de la proteína de interés (FigUre 2). Uso de la modificación descrita anteriormente, LRET se puede utilizar para medir los cambios de distancia entre el donante de quelato de terbio y la sonda aceptora en una proteína, y así vigilar los cambios conformacionales en estado fisiológico cerca de la proteína sin el requisito para la purificación. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1.El absorción y espectros de emisión de terbio quelado en negro, así como un aceptor de representante, Alexa 488, en rojo. Observe los múltiples picos de emisión y el, estrecho rango de emisión para cada pico agudo de quelato de terbio. Este patrón permite terbio para ser utilizado con una variedad de fluoróforos aceptores y facilita la medición de la emisión sensibilizada dentro de esos rangos, donde terbio muestra ninguna emisión. Pico de emisión del terbio a 486 nm se superpone bastante bien con el de un pico bsorption de Alexa 488, lo que permite la transferencia de energía de resonancia que se produzca entre los dos fluoróforos. Una longitud de onda de 515 nm es una excelente elección para detectar la emisión sensibilizada para este par, ya que es en el valle entre los picos de emisión terbio, y bastante cerca de pico de emisión de Alexa 488 de 520 nm. Tenga en cuenta que estar cerca del pico de aceptor, aunque deseable, no se requiere-565 nm es todavía capaz de detectar emisión de Alexa 488 sin también detectando la emisión de terbio. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Fluoróforo aceptor </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> Longitud de onda de emisión (nm) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; "&gt; 508 </tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Fluoresceína </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 <td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></trheight></tbody></table> Tabla 1. Una lista de fluoróforos aceptores usados ​​comúnmente para LRET usando quelato de terbio como donante 11. Se midieron los valores de R 0 cuando el donante y el aceptor se unen al dominio de unión del agonista soluble de los receptores AMPA. Es ideal para medir el valor de R 0 de nuevo para que se estudió cada nuevo sistema. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 Una visión general del método LRET presentado. (A) El receptor AMPA es una proteína de membrana que sufre cambios conformacionales a ligando vinculante. El ligando bi-en forma de concha de almeja-dominio hallazgo es un círculo aquí en rojo. (B) Existe el dominio de unión al ligando del AMPA cuando no se une a las proteínas en una conformación abierta (izquierda). Cuando se une a ligando de glutamato, la proteína se cierra alrededor de su ligando (derecha). Mediante la colocación de los fluoróforos en los sitios probatorios en el LBD, la naturaleza de este cambio conformacional puede ser visto como la distancia entre los fluoróforos cambios, que luego afectar de vida de fluorescencia. (C) Cuando, pueden ocurrir etiquetado tanto de la proteína de interés, así como proteínas de membrana fondo etiquetado células enteras (izquierda). Después de la escisión de la proteasa, la señal de LRET de la proteína de interés desaparecerá debido a la liberación de un fragmento soluble, dejando intacta la señal de fondo (derecha). Esta señal de fondo puede entonces ser sustraída de la señal sin procesar.

<table><tbody><tr><td>LanthaScreen Thiol Tb Reactivo Chelate</td><td>Life Technologies</td><td>PV3579</td><td></td></tr><tr><td>Aceptor fluoróforo-fluoresceína-5-maleimida</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>F-150</td><td>La elección del aceptor depende del experimento específico</td></tr><tr><td>Aceptor fluoróforo-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-10254</td><td>La elección del aceptor depende del experimento específico</td></tr><tr><td>Aceptor fluoróforo-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-20346</td><td>La elección del aceptor depende del experimento específico</td></tr><tr><td>Aceptor fluoróforo-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-10256</td><td>La elección del aceptor depende del experimento específico</td></tr><tr><td>Aceptor fluoróforo-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-20344</td><td>La elección del aceptor depende del experimento específico</td></tr><tr>El espectrofluorómetro internacional<td>QuantaMaster 3-SS</td><td>Photon Technology debe</td><td></td><td>tener excitación pulsada con la capacidad de medir vidas útiles en el rango de milisegundos</td></tr><tr><td>FluoreScan 2.0</td><td>Photon Technology International</td><td></td><td>Data Acquisition Software utilizado en el manuscrito. Software suministrado con el instrumento de fluorescencia</td></tr><tr><td>Origin 8.6</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Origin es el software de análisis de datos utilizado en el protocolo. Puede utilizar otro software de análisis de datos similar</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Starna Cells, Inc</td><td>3-Q-10</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitación &nbsp;</td><td>Productos Bel-Art</td><td>F37119-0007</td><td>Se utiliza en cubeta para mantener las células en suspensión. Puede usar cualquier barra de agitación que se ajuste a la cubeta</td></tr></tbody></table>

la luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Transferencia de Energía de Resonancia de luminiscencia, o LRET, es una técnica poderosa utilizada para medir distancias entre dos sitios en las proteínas dentro de la gama de distancias de 10-100 Å. Mediante la medición de las distancias en diversas condiciones ligadas, los cambios conformacionales de la proteína se pueden evaluar fácilmente. Con LRET, un lantánido, terbio más a menudo quelado, se utiliza como el fluoróforo donante, proporcionando ventajas tales como una mayor vida útil de donantes única emisión, la flexibilidad de utilizar múltiples fluoróforos aceptores, y la oportunidad de detectar emisión del aceptor sensibilizado como una manera fácil para medir la transferencia de energía sin el riesgo de también la detección de la señal de donantes solamente. Aquí se describe un método para utilizar LRET en proteínas de membrana expresadas y ensayados en la superficie de las células de mamífero intactas. Se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre el par fluoróforo LRET. Después de obtener la señal LRET original, la escisión en ese sitio elimina la señal LRET específica de la proteína deinterés que nos permite restar cuantitativamente la señal de fondo que queda después de la escisión. Este método permite más fisiológicamente relevantes para mediciones pueden realizar sin la necesidad de purificación de proteína.

Una medición de LRET éxito con un donante lantánido debe tener un donante sólo toda la vida en el rango de tiempo de milisegundos. El tiempo de vida de la emisión sensibilizada LRET para la proteína marcada tanto con el donante y el aceptor será notablemente más corto, con un tiempo de vida en el rango de microsegundos después de sustracción de fondo Figura 3. Proteasa resultados de escisión en un aumento de la vida útil que debe ser estable en el tiempo ( es decir, ya no cambia), demostrando q...

Se describe aquí un método mejorado de transferencia de energía de resonancia de luminiscencia (LRET) donde se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre los sitios de fluoróforo donante y receptor. Esta modificación nos permite obtener señales LRET específicas derivadas de proteínas de la membrana de interés, lo que permite el estudio de las proteínas de membrana sin la purificación de proteínas.

La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir los cambios confirmatorios en las proteínas de membrana en su estado fisiológico. Esto se logra mediante el marcaje específico del sitio de las proteínas de membrana para medir su vida útil de LRE y, por lo tanto, la distancia entre los dos sitios. Como segundo paso, se añade un ligando que induce un cambio de confirmación que se puede medir.A continuación, se añade la proteasa adecuada para escindir uno de los cuatro pisos y obtener la señal de fondo. En última instancia, el cambio en el tiempo de vida de la fluorescencia de la transferencia de energía de los residentes resultante se puede medir para medir los cambios de confirmación que ocurren en la estructura de la proteína. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la extracristalografía X, es que con este método podemos medir los cambios dinámicos de las proteínas en su estado fisiológico.Aunque este método puede proporcionar información sobre los receptores de lide inotrópicos o los canales iónicos de detección de ensayos, también se puede aplicar a otros tipos de proteínas como los receptores NICO. Vamos a mostrar la técnica de la luminisa y la transferencia de tensión y energía, particularmente en el contexto del estudio de los cambios confirmatorios de las proteínas de membrana en células de mamíferos. Mis estudiantes, Dino y Swara Swami, demostrarán el procedimiento antes de comenzar el experimento.Es importante elegir sitios de marcaje que sean capaces de reflejar los posibles cambios conformacionales dentro de la proteína. Si es posible, utilice una estructura cristalina de la proteína o de una proteína homóloga para ayudar a hacer esta determinación. Elija residuos de manera que las cadenas laterales de los residuos seleccionados queden expuestas a la superficie y sean accesibles para los cuatro fluorados para que la proteína pueda ser etiquetada.Incluya un sitio de escisión de la proteasa que pueda separar específicamente una de las cistinas de la proteína si la secuencia de la proteína lo permite. Introducir un sitio mutando conservadoramente la proteína para que tenga una trombina o factor 10, una secuencia cercana a la cistina introducida y accesible a la escisión de la proteasa. Elija un sitio tal que al escindir, una de las cistinas introducidas se disocie del resto de la proteína.En ciertos casos, esto puede requerir dos sitios de escisión que flanquean una cistina mutada. Seleccione los cuatro pisos en función del rango de distancia esperado que se está midiendo, de modo que el rango esté entre 0,5 y uno por el cero R del par de pisos cuatro. Esto permite una sustracción más fácil del fondo, que normalmente tiene una vida útil mucho más larga para un rango de alrededor de 35 angstroms y el par de piso cuatro apropiado sería tur quelato como donante y Alexa 5 94 como aceptor con un R cero de 53 angstroms.Una vez que se haya seleccionado la proteína de interés, separe las células HEK simplemente pipeteando el tampón contra el fondo de la placa. A continuación, gire las células y vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de tampón extracelular. A continuación, incube las células en el donante y acepte su suelo.Cuatro en cantidades equimolares hasta una concentración final de 100 a 300 nanomolares en un rotador durante una hora a temperatura ambiente. Después del etiquetado, lave las células tres o cuatro veces con tampón extracelular para eliminar el flúor no unido y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de tampón extracelular fresco. Para medir el lre de las células, transfiera la suspensión celular a una veta de cuarzo con un volumen mínimo de un mililitro y ajuste la longitud de onda de excitación del espectrómetro fotoluminiscente al rango de absorbancia del donante fluoro cuatro.Ajuste la longitud de onda de emisión de forma adecuada. A continuación, configure la longitud de la detección de emisiones para que sea al menos tres veces la vida útil esperada del LRE para garantizar que no se pierda un componente de larga duración y realice al menos tres escaneos de 99 barridos para garantizar resultados consistentes. Guarde los resultados como un archivo de texto y, a continuación, mida los cambios de confirmación de una proteína en respuesta a la adición de un ligando.Agregue el ligando y realice al menos tres escaneos de 99 barridos cada uno en la misma muestra bajo esta nueva condición. A continuación, añada hasta cinco unidades de la proteasa adecuada. Escaneo continuo hasta que la escisión se completa y no se observan más cambios en la vida útil durante tres escaneos sucesivos, aproximadamente dos o tres horas para analizar los datos de LRE.Comience estableciendo los valores promedio como un gráfico lineal con la intensidad de fluorescencia en el eje Y y el tiempo útil en microsegundos en el eje x para crear una curva que represente el tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor. Cambie el eje Y de la gráfica a una escala logarítmica. A continuación, en el menú de trazado, abra el cuadro de diálogo de control de capa y transfiera los datos que contienen la media de fondo a la lista de contenidos de capa.A continuación, en el menú matemático, use la función matemática simple para multiplicar o dividir los datos de fondo según sea necesario hasta que el extremo de la cola del fondo se superponga con el extremo de la cola de los datos sin procesar, dejando presente la señal de fondo antes y después de la escisión de proteínas. A continuación, utilice de nuevo la función matemática simple para restar la señal de fondo alineada de la señal LRE bruta inicial y ajustar los datos a un decaimiento exponencial. Establezca el límite de inicio para que el ajuste comience después del final del pulso láser.Luego, en el cuadro de diálogo seleccionar función de ajuste, seleccione decaimiento exponencial para ajustar el tiempo de vida a la ecuación para un solo decaimiento exponencial. Donde Y representa la intensidad de fluorescencia, Y cero representa la intensidad de fondo debida al ruido del sistema. A uno es la intensidad de la señal, T es el tiempo de fluorescencia, X es el tiempo y X cero es el desplazamiento temporal.Finalmente, arregle X de cero a cero. Inicie la función de ajuste y ajuste los datos utilizando los tiempos de vida obtenidos de los datos. Utilice la ecuación forestal para calcular la distancia entre los cuatro pisos.Una medición exitosa de LRE con un donante de lahane debe tener una vida útil de solo donante en el rango de tiempo de milisegundos. Al medir los cambios de confirmación, la señal LRE específica debe mostrar un cambio en el ciclo de vida fuera del error de la medición, que luego se puede calcular mediante la propagación de los errores asociados con el ajuste de los tiempos de vida. La vida útil de la emisión de LRE sensibilizada para la proteína marcada tanto con el donante como con el aceptante será notablemente más corta, con una vida útil en el rango de milisegundos.Después del fondo, la sustracción y la escisión de la proteasa da como resultado un aumento de la vida útil que debería estabilizarse con el tiempo, lo que indica que la escisión de la proteasa se ha completado. Si la señal LRE procede de un solo conjunto de emplazamientos, el tiempo de vida de la emisión resultante después de la sustracción del fondo debe dar un único tiempo de vida exponencial. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro o cinco horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante controlar los parámetros, las longitudes de onda y la velocidad de los esteroides después de su desarrollo. Esta técnica ha allanado el camino para estudiar los cambios conformacionales en las proteínas de membrana en su estado neurofisiológico.

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Bioengineering

Bioingeniería

Vamos a describir un método que mide la cinética del transporte de iones de proteínas de membrana junto con el sitio específico de análisis de los cambios conformacionales con fluorescencia en células individuales. Esta técnica se adapta a los canales iónicos, transportadores y bombas iónicas y pueden ser utilizados para determinar las limitaciones distancia entre subunidades de la proteína.

Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Se describen los métodos de formación de imágenes que utilizamos para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes transfectadas residentes en el retículo endoplásmico (RE) por medio de la imagen confocal de células vivas. También analizamos ultraestructuralmente el efecto de su expresión en la arquitectura de este compartimento subcelular.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Las interacciones proteína-proteína son críticas para los sistemas biológicos, y estudios de la cinética de Unión proporcionan penetraciones en la dinámica y función de complejos de la proteína. Se describe un método que cuantifica los parámetros cinéticos de una proteína compleja mediante la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia y la técnica de flujo detenido.

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar...

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Presentamos un protocolo experimental y un flujo de trabajo de análisis de datos para realizar espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color de células vivas (FCCS) combinada con transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) para estudiar la dinámica de los receptores de membrana en células vivas utilizando técnicas modernas de etiquetado de fluorescencia.

Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color para estudiar la interacción proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.

Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única

Este protocolo describe un ensayo basado en BRET para medir las interacciones de la quinasa CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas. El protocolo describe los pasos para la preparación de las celdas, la lectura de las emisiones BRET y el análisis de datos. También se presenta un ejemplo de resultado con la identificación de los controles adecuados y la resolución de problemas para la optimización del ensayo.

Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

Aprende a medir cambios conformacionales en proteínas de membrana mediante LRET con sitio de corte proteásico en células de mamífero. Este método permite observar dinámicas proteicas en tiempo real sin necesidad de purificación previa.

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La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

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