Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

El objetivo general de este procedimiento es rastrear el transporte axonal retrógrado del factor neurotrófico derivado del cerebro o BDNF mediante imágenes en vivo. Esto se logra ensamblando primero las cámaras microfluídicas en cubreobjetos recubiertos de polilisina. En el segundo paso, las neuronas del hipocampo de rata E 18 disociadas se diseccionan y se colocan en el compartimento del cuerpo celular de la cámara microfluídica.

A continuación, las neuronas se cultivan para permitir la extensión de los axones a través de los microranuras hasta el compartimento axonal de la cámara. En el paso final, se agrega un punto cuántico etiquetado como BDNF al compartimiento del axón. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se puede utilizar para evaluar el movimiento de BDNF dentro de los axones de la neurona del hipocampo.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el etiquetado B-D-F-E-G-I-P o BDFM es que el etiquetado de BDF con puntos cuánticos permite obtener imágenes de luz de un solo dímero de BDF dentro de los axones, lo que demuestra que el procedimiento será, será. Dibuje un punto de poste de mis tres a la izquierda, comience lavando a mano las cámaras microfluídicas en 1%aox, seguido de tres enjuagues de 30 minutos en agua mili Q. Luego, después de lavar a mano las cámaras con etanol al 70%, colóquelas para que se sequen en param en una campana de flujo laminar, esterilice ambos lados de las cámaras bajo luz ultravioleta durante 20 minutos y luego almacene las cámaras radiadas en un plato estéril de 15 centímetros sellado con param a temperatura ambiente.

A continuación, remoja 24 por 40 milímetros. La cubierta de vidrio número uno se desliza en ácido clorhídrico al 10% durante la noche en un rotador, seguido de tres lavados de 30 minutos con agua después del último lavado. Esterilice cada cubreobjetos con un baño en etanol al 100%, seguido de un fuego sobre un mechero bunsen y guárdelos secos en una placa de Petri estéril a temperatura ambiente.

Para cubrir los cubreobjetos, colóquelos en un plato de cultivo de 15 centímetros y luego cubra cada uno con 0,7 mililitros de lisina poli L al 0,01%. Después de una incubación de una hora en la campana de cultivo de tejidos, enjuague los cubreobjetos tres veces nuevamente con agua estéril y luego séquelos con vacío y colóquelos en una placa de cultivo de seis centímetros. A continuación, coloque una de las cámaras esterilizadas con el lado de la microranura hacia abajo sobre un cubreobjetos recubierto de lisina poliL.

Tenga cuidado de no tocar las microranuras y utilice una punta de micropipeta para presionar suavemente la cámara y sellar herméticamente la cámara microfluídica ensamblada. Ahora coloque dos Hippo Campi de rata E 17 a E 18 en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene dos mililitros de tampón de disección y enjuague los tejidos tres veces con cinco mililitros de tampón de disección cada vez. A continuación, retire la mayor cantidad posible de jabón y añada 900 microlitros de tampón de disección fresco para digerir el tejido.

A continuación, agregue 100 microlitros de tripsina al 2,5% a los pañuelos y coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos de digestión, agregue 100 microlitros de ADN y use una pipeta de vidrio de PE pulido al fuego para tripular suavemente los tejidos hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces inmediatamente después de la mezcla. Apague el ensayo con dos mililitros de medio de siembra y deje que los residuos se depositen en el fondo del tubo durante cinco minutos en la campana de cultivo de tejidos.

A continuación, transfiera con cuidado dos mililitros de sobrenadante a un tubo cónico estéril limpio de 15 mililitros y centrifuga las células resus. Suspenda el pellet en 50 microlitros de medio de recubrimiento y luego, después de contar, cargue de 15 a 20 microlitros de la suspensión celular en un compartimento de la cámara microfluídica. Incube la cámara durante 10 minutos para permitir que las celdas se adhieran al cubreobjetos y, a continuación, añada más medios de recubrimiento para llenar ambos compartimentos de la cámara.

Después de un día de incubación, reemplace el medio de recubrimiento con medios de mantenimiento tanto en el cuerpo de la célula como en los compartimentos de los axones. En el tercer día, los axones de las neuronas del hipocampo comienzan a cruzar los microsurcos llegando al compartimento de los axones entre los días cinco y siete. Durante este tiempo, reemplace la mitad del medio de cultivo con medios de mantenimiento nuevos cada 24 a 48 horas antes de obtener imágenes en vivo del transporte axonal de BDNF marcado con cuánticos.

Enjuague a fondo ambos compartimentos de la cámara microfluídica con medios neurobasales libres de suero BDNF cada 30 minutos durante dos horas durante la depleción de BDNF, incube 50 dímeros de BDNF mono biotinilados nanomolares con 50 nano molares cuánticos. Realice 6 5 5 conjugados de pines en medios neurobasales sobre hielo durante 60 minutos. A continuación, sustituya los medios en el compartimento del axón por 300 microlitros de puntos cuánticos etiquetados como BDNF durante cuatro horas a 37 grados Celsius para minimizar la difusión de puntos cuánticos etiquetados como BDNF en el compartimento del cuerpo de la célula.

Es muy importante mantener siempre un nivel más alto de medios en el compartimento del cuerpo celular que en el compartimento de axones al final del microscopio de incubación, calentamiento e invertido, equipado con un objetivo de aceite 100 x y una cámara ambiental a una temperatura constante de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono mientras el equipo se calienta. Lave el punto cuántico no unido etiquetado como BDNF de la cámara microfluídica y luego use un conjunto de cubos de excitación y emisión rojos de Texas para visualizar la señal del punto cuántico 6 5 5. Por último, utilice una cámara CCD para capturar imágenes de lapso de tiempo dentro de los axones medios a una velocidad de un fotograma por segundo durante un total de dos minutos.

Utilice microranuras sin axones que no tengan QD como control para la infiltración y analice el transporte de BDNF utilizando el software de análisis de imágenes adecuado en imágenes de lapso de tiempo de transporte de señales BDNF etiquetadas con puntos cuánticos Las señales de puntos cuánticos se observan en la mayoría de las microranuras con axones, mientras que no se ve ninguna señal cuántica en las microranuras sin axones, lo que indica poca o ninguna difusión de la señal de puntos cuánticos desde el compartimento de axones al compartimento del cuerpo de la célula aquí. Un segmento de 80 micrómetros de largo de un axón de una neurona del hipocampo se registró con fluorescencia durante 100 segundos. Un total de seis.

Las señales cuánticas de BDNF se notaron claramente durante las imágenes, y se observaron tres moviéndose unidireccionalmente hacia el cuerpo de la célula. Se observó que una señal se movía suavemente hacia el cuerpo de la célula, cruzando todo el campo en aproximadamente 70 segundos. Se observó que otro se movía en dirección retrógrada durante los primeros 20 segundos, cambiaba a un movimiento antrógrado durante 10 a 20 segundos y luego cambiaba de dirección nuevamente hacia el cuerpo de la célula durante los últimos 20 segundos.

También se observó que el tercer evento se movía en una dirección retrógrada, pero luego se detenía durante aproximadamente 20 segundos durante la mitad del movimiento. En este primer gráfico de timbre representativo del transporte de puntos cuánticos etiquetados como BDNF, el punto cuántico etiquetado como BDNF se movió rápida y suavemente hacia el cuerpo de la célula cruzando el campo de 80 micrómetros en aproximadamente 60 segundos. Con pausas muy breves en este segundo cronógrafo, el BDNF cuántico viajó aproximadamente 50 micrómetros en 120 segundos en dirección retrógrada con al menos tres segmentos de pausas más largas.

Finalmente, los diagramas de dispersión miden la velocidad de movimiento, la velocidad promedio y el tiempo de pausa de cada punto cuántico etiquetado como BDNF. Las velocidades de movimiento del punto cuántico etiquetado como BDNF fueron relativamente rápidas, oscilando entre 0,47 y 1,97 micrómetros por segundo, con una media de 1,06 más o menos 0,05 micrómetros por segundo. Debido a la pausa del BDNF durante el transporte, la velocidad media fue mucho menor que la velocidad de movimiento, con una media de 0,48 más o menos 0,03 micrómetros por segundo, con una duración media de las pausas de 15,88 más o menos 1,30 segundos después del revelado.

Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la neurociencia explorar el tráfico de neurotrofinas y receptores en neuronas sanas y enfermas.