Name: Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende a rastrear el transporte axonal retrógrado de BDNF en neuronas hipocampales de rata usando cámaras microfluídicas y puntos cuánticos. Esta técnica de imagen en vivo permite estudiar la dinámica de factores neurotróficos.

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Nos gustaría dar las gracias a Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit por su asistencia técnica. El estudio está apoyado por el NIH subvención (PN2 EY016525) y por la financiación de Síndrome de Down y la Fundación de Investigación de Tratamiento y la Fundación Larry L. Hillblom.

Los procedimientos quirúrgicos y animales se llevan a cabo estrictamente de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los experimentos que implican el uso de animales son aprobados por UCSD Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. plásmido de clonación, expresión y purificación de biotina-Mono BDNF (mBtBDNF) NOTA: Construir pre-proBDNFavi y cDNA BirA en el vector pcDNA3.1 y coexpresan en células HEK293FT 10. Purificar mBtBDNF utilizando perlas de Ni-NTA según el método publicado previamente de la producción de factor de crecimiento nervioso monobiotinylated madura y biológicamente activa (mBtNGF) 10. 2 Preparación de microfluidos Cámaras Dispositivo de cultivo de neuronas de microfluidos hace que sea posible para aislar de manera fluida los axones de los cuerpos celulares de las neuronas. Montar cámaras con cubreobjetos recubiertos recién justo antes de cada disección. Cámaras de microfluidos utilizadosen este protocolo se compran en el mercado (ver materiales y la mesa del equipo). Lavado a mano y reutilizados cámaras adquiridos comercialmente hasta 5-6 veces. <ol><li> Lavar a mano cámaras de microfluidos en 1% Alconox. Enjuague tres veces con agua Milli-Q durante 30 min cada uno. Cámaras de lavado a mano de nuevo en etanol al 70%. </li><li> Coloque cámaras a secar en Parafilm en la campana de flujo laminar. Irradiar y esterilizar ambos lados de las cámaras durante 20 min bajo UV. Tienda esterilizado en un recipiente estéril cámaras 15 cm plato de sellado con Parafilm a temperatura ambiente. </li><li> Coloque 24 x 40 mm N º 1 cubreobjetos de vidrio en un recipiente de vidrio. Remojar los cubreobjetos en ácido clorhídrico al 35% durante la noche en un rotador. Al día siguiente, enjuagar los cubreobjetos tres veces durante 30 minutos cada uno con agua. </li><li> Esterilizar los cubreobjetos uno a uno por inmersión cada cubreobjetos en etanol al 100% y en llamas sobre un mechero Bunsen. Guarde cubreobjetos secos en una placa de Petri estéril y mantenerlo a temperatura ambiente hasta recubrimiento. </li><li> Coloque out los cubreobjetos en una placa de cultivo de 15 cm. Escudo cada cubreobjetos con 0,7 ml de 0,01% de poli-L-lisina (PLL) y se incuba en la campana a temperatura ambiente. </li><li> Después de 1 hora, enjuague los cubreobjetos tres veces con agua estéril. Cubreobjetos secos con vacío y el lugar cada cubreobjetos en una placa de cultivo de 6 cm. </li><li> Para montar la cámara de microfluidos, coloque la cámara con el lado microsurco en la parte inferior en el cubreobjetos recubiertos PLL con precaución de no tocar los microsurcos. Presionado suavemente la cámara con una punta de pipeta para asegurar la cámara se cerró herméticamente. </li></ol> 3. Disección de cultivos neuronales y Placa en Cámaras <ol><li> Coloque dos hipocampos E17-E18 de rata (un cerebro) disecados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 2 ml de tampón de disección (HBSS, sin calcio, magnesio no, con 1% penicilina / estreptomicina y HEPES 10 mM. Enjuagar los tejidos 3 veces con 5 ml disección tampón cada vez. eliminar el tampón de disección tanto como sea posible y añadir 900 l de di frescatampón ssection. </li><li> Para digerir el tejido, se añaden 100 l de 10x tripsina (2,5%) en el tampón de disección para hacer concentración de trabajo 1x. Coloque el tubo cónico en un baño a 37 ° C. Después de 10 min de la digestión, añadir 100 l de 10 mg / ml de DNasa I a una concentración final de alrededor de 1 mg / ml. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego, se tritura suavemente los tejidos pipeteando arriba y abajo 5-10x. Justo después de la trituración, se extingue la tripsina con 2 ml chapado medio (Neurobasal con 10% de FBS, 2 mM de GlutaMax, 2% B27). </li><li> Deja la muestra en la campana durante 5 minutos para permitir que todos los residuos de los tejidos para establecerse en la parte inferior. Retire cuidadosamente 2 ml de sobrenadante en un tubo limpio y estéril 15 ml cónico y centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar las células. Resuspender el precipitado en 50 l chapado medios </li><li> Contar las células con un hemocitómetro. Load 15-20 l de suspensión de células (~ 40.000 células) en un compartimiento de la cámara de microfluidos. Coloque la cámaraen la incubadora durante 10 minutos para permitir que las células se unan a la cubreobjetos. Después de 10 minutos, agregue los medios más chapado a llenar los dos compartimentos de la cámara. </li><li> En el segundo día de la disección, reemplazar completamente los medios de comunicación de placas con medio de mantenimiento (Neurobasal con 2 mM de GlutaMax, 2% B27) tanto en el cuerpo de la célula y el compartimento del axón. Los axones de las neuronas del hipocampo empiezan a cruzar los microsurcos en el día 3 y alcanzar el compartimiento axón entre los días 5-7. Durante este período de tiempo, reemplace la mitad de los medios de cultivo con medio de mantenimiento fresco cada 24 ~ 48 hr. </li></ol> 4. Axonal Transporte de QD-BDNF <ol><li> Antes de imagen en directo de QD-BDNF transporte axonal, agotar BDNF tanto desde el cuerpo celular y el axón compartimentos de la cámara de microfluidos por enjuague a fondo ambos compartimentos con BDNF-libres, suero libre de los medios de comunicación Neurobasal cada 30 min durante 2 horas. </li><li> Durante el agotamiento de BDNF, preparar los conjugados QD-BDNF. Mezclar 50 nM de mono-biotina BDDímero NF con 50 nM conjugados de estreptavidina-QD655 en medios Neurobasal e incubar en hielo durante 60 min. </li><li> Retire el medio en el compartimiento de axón y añadir 300 l QD-BDNF con una concentración final de 0,25 nM durante 4 horas a 37 ° C. Para minimizar el difusora de QD-BDNF en el compartimento de cuerpo celular, es muy importante mantener siempre un nivel más alto de los medios en el compartimiento de cuerpo de la célula que en el compartimiento de axón. Lavar sin unir QD-BDNF después de la incubación antes de imágenes en directo. </li><li> Llevar a cabo formación de imágenes en vivo de transporte QD-BDNF usando un microscopio invertido equipado con un aceite lente objetivo 100X. Calentar el alcance y la cámara ambiental que se le atribuye a una temperatura constante (37 ° C) y CO 2 (5%). Utilice un conjunto de cubos de Texas excitación rojo / emisión de visualizar la señal QD655. </li><li> Adquirir y capturar imágenes con lapso de tiempo dentro de los axones media a la velocidad de 1 fotograma / seg para un total de 2 min usando una cámara CCD. Use microsurcos sin axones that no tienen QD y por lo tanto no hay señal como un control para la infiltración. </li><li> Analizar transporte BDNF usando cualquier software de análisis de imagen o NIH ImageJ. </li></ol>

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<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este estudio, se presenta el desarrollo de una nueva técnica para producir biológicamente activa, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que se puede utilizar para rastrear el transporte axonal de BDNF. Por la conjugación de la proteína a la estreptavidina punto cuántico, y el uso de una cámara de microfluidos, el método permite una para detectar el transporte axonal de BDNF en las neuronas primarias con sensibilidad única molécula, en tiempo real y con las resoluciones espaciales y temporales. Las herramientas utilizadas e...

Las neuronas son células altamente cuyos procesos de largo ya menudo muy elaborado, son fundamentales para el establecimiento y mantenimiento de la estructura y función de los circuitos neuronales polarizados. El axón juega un papel vital en el que transporten cargas desde y hacia las sinapsis. Las proteínas y orgánulos sintetizados en el soma celular necesitan ser transportados a través de los axones para llegar a la terminal presináptica para apoyar la función neuronal. Correspondientemente, señales recibidas en los axones distales necesitan ser transducidas y se transportan a la soma. Estos procesos son esenciales para la supervivencia neuronal, diferenciación y mantenimiento. En que el transporte axonal en algunas neuronas debe llevarse a cabo a través de distancias más de 1000 veces el diámetro del cuerpo celular, la posibilidad se prevé fácilmente que incluso pequeños déficits podrían afectar notablemente la función neuronal y el circuito. Brain-factor neurotrófico derivado (BDNF), un miembro de la familia de las neurotrofinas de factores de crecimiento, está presente en maregiones del cerebro ny, incluyendo el hipocampo, corteza cerebral, y el cerebro anterior basal. BDNF juega un papel crucial en la formación de la cognición y la memoria mediante el apoyo a la supervivencia, diferenciación y función de las neuronas que participan en circuitos cognitivos. BDNF se une a su receptor, el TrkB tirosina quinasa, en el axón terminal donde activa vías de señalización mediada por TrkB, incluyendo la proteína quinasa activada por mitógeno / regulada por señal extracelular de la proteína quinasa (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) y la fosfolipasa C-gamma (PLCγ). Las proteínas que participan en estas vías de señalización están empaquetados en estructuras vesiculares endocítica para formar el BDNF / TrkB señalización endosoma 1-6 que luego son retrógradamente transportado al soma neuronal. La cámara de cultivo de microfluidos es una plataforma muy útil para estudiar la biología axonal en condiciones normales, así como en el ajuste de la lesión y la enfermedad 7,8. Por axones de aislamientoa partir de los cuerpos celulares, el dispositivo ha permitido uno para estudiar el transporte específicamente en los axones 8-10. Las plataformas de microfluidos PDMS base con 450 micras barreras microsurco utilizados en este estudio fueron adquiridos comercialmente (ver Tabla de Materiales). Para examinar el transporte BDNF, hemos desarrollado una nueva tecnología para producir BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). Aprovechamos el péptido aceptor de biotina, AP (también conocido como AviTag). Es una secuencia de 15 aminoácidos que contiene un residuo de lisina que puede ligarse específicamente a una biotina por la enzima ligasa de biotina coli Escherichia, BirA. Hemos fusionado el AviTag a la C-terminal de la pre-ratón proBDNF ADNc mediante PCR (Figura 1A). La construcción se clonó en el vector de expresión de mamífero, pcDNA3.1-myc su vector. También clonado el ADN bacteriana BirA en el pcDNA3.1-myc su vector. Los dos plásmidos se co-transfectaron transitoriamente en células HEK293FT para expresar ambas proteínas. BirA catalizó la ligadura de Bioten concreto a la lisina residen dentro del AviTag en el C-terminal de BDNF en una proporción de 1: 1 para producir monómero monobiotinylated BDNF. Biotinilado, BDNF maduro con una masa molecular de ~ 18 kDa fue recuperado y purificado a partir de los medios de comunicación utilizando resina de Ni-(Figura 1C). La biotinilación de BDNF era completa, como se juzga por la incapacidad de detectar sin modificar BDNF por inmunotransferencia (Figura 1D). Puntos cuánticos conjugados con estreptavidina, QD 655, se utilizan para etiquetar mBtBDNF hacer QD-BDNF. La presencia de la AviTag no interfiera con la actividad del BDNF como la mBtBDNF fue capaz de activar TrkB fosforilado (Figura 1E) y estimular el crecimiento de neuritas (Figura 1F) en la medida de BDNF humano recombinante (rhBDNF). Inmunotinción demostró que QD-BDNF colocalized con TrkB en los axones del hipocampo, lo que indica que QD-BDNF es bioactivo (Figura 1G). Para estudiar el transporte BDNF, QD-BDNF fue añadido al compartimento de axón distalculturas de microfluidos que contienen rata E18 neuronas del hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de los axones fue capturado por el tiempo real de imágenes en vivo de la etiqueta fluorescente de color rojo (con soporte para vídeos S1, S2). Mediante el análisis de la quimógrafo generado, QD-BDNF se observó para ser transportado retrógradamente a una velocidad de movimiento de alrededor de 1,06 m / seg (Figura 3A). GFP o marcado con mCherry BDNF se han utilizado para seguir el movimiento axonal de BDNF. Los principales inconvenientes son que no son lo suficientemente brillantes para los estudios de una sola molécula. Además, la presencia de tanto anterógrada y retrógrada movimientos de BDNF hace que sea difícil evaluar si o no el BDNF retrógradamente transportado estaba en un complejo neurotrofina / receptor. En este video, nos demuestran las técnicas que se utilizan para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias. El ultrabrightness y excelente fotoestabilidad de los puntos cuánticos MAKes posible realizar el seguimiento a largo plazo del transporte BDNF. Estas técnicas pueden ser explotados para mejorar estudios de la función axonal en AD, HD, y otros trastornos neurodegenerativos.

<table><tbody><tr><td>Platino pfx ADN polimerasa &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT células</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medios de alta glucosa</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Resinas Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa cóctel</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; S8820</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de plata&nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>BDNF recombinante humano</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámaras microfluídicas</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm Nº 1 cubreobjetos de vidrio&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina&nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-estreptavidina conjugados</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>Q10121MP</tr><tr><td>anticuerpo anti-Avi tag GenScript</td><td></td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>perlas de estreptavidina-agarosa&nbsp;</td><td>Tecnología</td> <td>de la vida&nbsp; SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-estreptavidina&nbsp;</td><td>Anticuerpo</td> anti-pTrkB <td>N100</td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td></td><td>, un generoso regalo del Dr. M. Chao del</td> anticuerpo anti-TrkB de la Universidad <td></td><td></td>de Nueva York</tr>, <tr><td></td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en tiempo real de axonal transporte de quantum dot-etiquetado bdnf en las neuronas primarias

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF juega un papel importante en varias facetas de la supervivencia neuronal, la diferenciación, y la función. Déficits estructurales y funcionales en los axones se consideran cada vez más como una característica temprana de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad de Huntington (HD). Hasta el momento no está claro es el mecanismo (s) por el cual se induce lesión axonal. Se presenta el desarrollo de una nueva técnica para producir biológicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que se puede utilizar para rastrear el transporte axonal de BDNF. BDNF marcado con puntos cuánticos (QD-BDNF) fue producido por la conjugación de punto cuántico 655 a mBtBDNF. Un dispositivo de microfluidos se utilizó para aislar los axones de los cuerpos celulares de las neuronas. La adición de QD-BDNF al compartimiento axonal permite imágenes en vivo de transporte BDNF en los axones. Hemos demostrado que QD-BDNF movido esencialmente exclusivamente retrógradamente, con muy pocas pausas, a una velocidad de movimiento de alrededor de 1,06 m / seg. Este sistema se puede utilizar para investigar memecanis- de la función axonal alterada en la EA o HD, así como otros trastornos degenerativos.

Producción y purificación de biológicamente activos BDNF Mono-biotina El vector de expresión de BDNF fusionado con una secuencia de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fue creado de acuerdo con un protocolo previamente publicado 10. La masa molecular de la proteína de fusión de longitud completa se predijo a ser ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) fue producido Monobiotinylated BDNF maduro con una masa m...

El transporte axonal de BDNF, un factor neurotrófico, es crítico para la supervivencia y la función de varias poblaciones neuronales. Algunos trastornos degenerativos están marcadas por disrupción de la estructura y la función axonal. Hemos demostrado las técnicas utilizadas para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias.

Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

El objetivo general de este procedimiento es rastrear el transporte axonal retrógrado del factor neurotrófico derivado del cerebro o BDNF mediante imágenes en vivo. Esto se logra ensamblando primero las cámaras microfluídicas en cubreobjetos recubiertos de polilisina. En el segundo paso, las neuronas del hipocampo de rata E 18 disociadas se diseccionan y se colocan en el compartimento del cuerpo celular de la cámara microfluídica.A continuación, las neuronas se cultivan para permitir la extensión de los axones a través de los microranuras hasta el compartimento axonal de la cámara. En el paso final, se agrega un punto cuántico etiquetado como BDNF al compartimiento del axón. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se puede utilizar para evaluar el movimiento de BDNF dentro de los axones de la neurona del hipocampo.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el etiquetado B-D-F-E-G-I-P o BDFM es que el etiquetado de BDF con puntos cuánticos permite obtener imágenes de luz de un solo dímero de BDF dentro de los axones, lo que demuestra que el procedimiento será, será. Dibuje un punto de poste de mis tres a la izquierda, comience lavando a mano

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Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Este protocolo describe la disección en vivo...

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Fuente: Winkle, C. C., et al. Utilización de metodologías combinadas para definir el papel de la administración de membrana plasmática durante la ramificación de axones y la morfogénesis neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra una técnica de imágenes en vivo que utiliza microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para observar la ramificación axonal en tiempo real en las neuronas corticales. Los videos de lapso de tiempo capturan los efectos del tratamiento con...

Imágenes in vitro en tiempo real de la ramificación axonal en neuronas corticales de ratón

Aquí, describimos el método que empleamos para crear imágenes de filopodia dendrítica altamente móviles en una preparación en vivo del cerebro larvario Drosophila, y el protocolo que desarrollamos para cuantificar conjuntos de datos de imágenes 3D de lapso de tiempo para evaluaciones cuantitativas de la dendrita dinámica en el desarrollo de neuronas.

Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

BDNF recombinante que contiene una secuencia Avi (BDNFAvi) se produce en células HEK293 de una manera rentable y se purifica mediante cromatografía de afinidad. BDNFavi es entonces directamente monobiontilado con la enzima BirA en un tubo. BDNFavi y BDNFavi monobionicionados conservan su actividad biológica en comparación con BDNF disponible comercialmente.

Un protocolo mejorado para purificar y directamente monobiocalinato recombinante BDNF en un tubo para estudios de tráfico celular en neuronas

Describimos métodos de fotoactivación de fluorescencia para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios periféricos de ratones transgénicos que expresan una proteína neurofilament fotoactivable.

Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

El artículo describe la optimización de los parámetros de adquisición de microscopía de fluorescencia para visualizar el transporte axonal de cargas endógenas marcadas con una resolución de una sola neurona en un nematodo vivo.

Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

Aprende a rastrear el transporte axonal retrógrado de BDNF en neuronas hipocampales de rata usando cámaras microfluídicas y puntos cuánticos. Esta técnica de imagen en vivo permite estudiar la dinámica de factores neurotróficos.

Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

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