Name: gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a analizar 11 genes de reparación del ADN simultáneamente mediante tecnología de transposasa para secuenciación NGS. Este protocolo eficiente permite detectar variaciones genéticas en menos de dos semanas.

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Agradecemos a la Liga contra el Cáncer de Côte d'Or y al Centro Georges-François Leclerc por su apoyo financiero. Agradecemos a Philip Bastable por la edición del manuscrito.

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<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
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<li>de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li>
<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
<li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances%3A+a+kin-cohort+study+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li>
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<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El uso generalizado de dispositivos y tecnologías NGS ha proporcionado nuevas oportunidades en el estudio del cáncer y los trastornos genéticos. Además de la secuenciación del genoma entero o secuenciación de ARN, el análisis de una gran cantidad de secuencias de gDNA seleccionados en numerosos pacientes simultáneamente ofrece grandes perspectivas en el diagnóstico. Aquí, hemos desarrollado un diseño específico (disponible bajo demanda) utilizando la tecnología Nextera para estudiar 11 genes completos en 24 pacientes si...

En 2010, cerca de 1,5 millones de personas (fundamentalmente mujeres) desarrollaron cáncer de mama en todo el mundo. Se estima que del 5 al 10% de estos casos eran hereditarios. Hace casi 20 años, BRCA1 y BRCA2 fueron identificados como implicados en la mama hereditario y el cáncer de ovario 1. Desde hace unos 15 años, las regiones de codificación de BRCA1 y BRCA2 han sido secuenciados para determinar la predisposición genética al cáncer de mama y ovario. Las alteraciones en los genes BRCA1 y BRCA2 se detectan en el 10 a 20% de las familias seleccionadas 2 sugieren que el análisis de estas regiones no es suficiente para la detección eficaz. Recientemente, el análisis de las secuencias no codificantes (promotor, intrones, 3-&#39;UTR) de BRCA1 y BRCA2 destacó que las nuevas mutaciones / variantes podrían estar relacionados con un mayor riesgo de cáncer de mama 3-6. Proteínas BRCA1 y BRCA2 están implicados en la reparación de recombinación homóloga (HHR), que se completa con numerosos socios 7. Mientras que las alteraciones en los genes BRCA1 o BRCA2 inducen defectos en la reparación del ADN, los otros socios también pueden afectar el riesgo de cáncer de seno. Esta hipótesis parece haber sido validada desde BRIP1 8 y 9 PALB2 tener un impacto demostrado sobre el cáncer de cuello de útero y de mama, respectivamente. Además, otros dos genes de susceptibilidad al cáncer de mama &quot;riesgo moderado&quot;, ATM y CHEK2, también pueden ser estudiados de forma rutinaria 10. A raíz de estos estudios, decidimos desarrollar un protocolo para analizar 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 y TP53) en 24 pacientes simultáneamente usando un muy fácil y relativamente protocolo rápido basado en la tecnología de la transposasa, con el enriquecimiento y la secuenciación en un dispositivo de rendimiento medio. Graciasa esta técnica, hemos secuenciado genes completos desde el inicio del promotor hasta el final de 3&#39;-UTR, a excepción de RAP80, para los que no estaba cubierto de una región intrónica de 2500 pb (chr5: 176,381,588-176,390,180). Esto representa un total de aproximadamente 1.000.300 pb estudiado con 2.734 sondas. Por lo general, BRCA1 y BRCA2 exonic secuencias se analizan por secuenciación de Sanger, que necesita 1,5 meses por menos de 20 pacientes. Con el presente protocolo (Figura 1), en el mismo tiempo, se pudieron analizar 11 genes completas para más de 75 pacientes.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001 Dispositivo de</td><td>secuenciación/rendimiento medio</td></tr><tr><td>Nextera Kit de enriquecimiento</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>Tecnología basada en la transposasa</td></tr><tr><td>Cartucho de 300 ciclos</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Perlas de purificación magnéticas</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Life Technologies 4306737</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIDI Placas de 96 pocillos</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Este sello solo es necesario para la amplificación por PCR. Se pueden utilizar otros sellos estándar durante todo el experimento</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Provisto con el dispositivo de secuenciación software Experiment Manager Dirección de Internet: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Herramienta del sitio web del fabricante</td></tr></tbody></table>

gdna enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de análisis ngs de la secuencia entera de brca1, brca2, y 9 genes involucrados en la reparación del adn daños

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

El uso generalizado de la Next Generation Sequencing ha abierto nuevas vías para la investigación y el diagnóstico de cáncer. NGS traerá enormes cantidades de nuevos datos sobre el cáncer, y especialmente la genética del cáncer. Los conocimientos actuales y futuros descubrimientos harán necesario estudiar un gran número de genes que podrían estar implicados en la predisposición genética al cáncer. En este sentido, hemos desarrollado un diseño Nextera para estudiar 11 genes completos implicadas en la reparación el daño del ADN. Este protocolo fue desarrollado para estudiar con seguridad 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, y TP53) del promotor de 3&#39;-UTR en 24 pacientes simultáneamente. Este protocolo, basado en la tecnología de transposasa y enriquecimiento gDNA, da una gran ventaja en términos de tiempo para el diagnóstico genético gracias a la muestra de multiplexación. Este protocolo se puede utilizar de manera segura con gDNA sangre.

Resultados del control de calidad de la muestra La capacidad de este método para determinar secuencias de genes diana se basa en la calidad de la ADNg (Figura 2A) y la calidad de la etapa de tagmentation. Si el tagmentation no es suficiente (Figura 2B, panel superior), la secuenciación no será satisfactoria. Como se mencionó anteriormente, después de la purificación tagmentation, el gDNA debe tagmented en fragmentos de 150 pb a 1000 pb con la mayoría de los fra...

enriquecimiento de ADNg para la secuenciación de NGS es una herramienta fácil y potente para el estudio de mutaciones constitucionales. En este artículo se presenta el procedimiento para analizar de forma sencilla la secuencia completa de 11 genes implicados en la reparación de daños en el ADN.

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

El objetivo del siguiente experimento es analizar la secuencia de 11 genes simultáneamente con un protocolo muy fácil y relativamente rápido basado en tecnología basada en la transposasa. Esto se logra mediante la acción de una transposasa para obtener 300 fragmentos de ADN de pares de bases ligados directamente con adaptadores. La primera captura mediante sondas específicas, enriquece las muestras en las regiones de interés.Este paso se repite una vez más para obtener solo las secuencias objetivo. A continuación, se realiza la amplificación por PCR con el fin de aumentar la cantidad de materiales a secuenciar, se obtienen resultados que muestran variaciones genéticas en genes en base al alineamiento de secuencias y análisis bioinformáticos. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la secuenciación Sanger, es su gran capacidad que permite analizar 24 pasiones para 11 genes completos en menos de dos semanas.La demostración del procedimiento estará a cargo de Sandy, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, prepare todos los reactivos del kit de enriquecimiento de ADN. Cuando esté listo, agregue aproximadamente 50 nanogramos de ADN genómico en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, comience la mentación agregando 25 microlitros de tampón TD y luego cinco microlitros de tampón TDE.En cada pocillo, ajuste una pipeta a 50 microlitros y pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Centrifugar brevemente y luego coloque la placa en un termociclador cuando esté lista. Agite la solución ST y agregue 15 microlitros a cada pocillo que contenga la muestra.Ajuste la pipeta a 65 microlitros y pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces, incube durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de la centrifusión. A continuación, agregue 52 microlitros de perlas magnéticas de purificación previamente mezcladas a cada mezcla de pocillos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar. Después de lavar las perlas con etanol, retire la placa del soporte magnético y agregue 22,5 microlitros de tampón RSB.Después de mezclar, coloque la placa en el soporte magnético e incube durante dos minutos. Asegúrese de que el sobrenadante aparezca completamente transparente. Transfiera suavemente 20 microlitros de la nariz a una nueva placa de 96 pocillos.Para comenzar la primera ronda de amplificación por PCR, agregue 20 microlitros de LP PMM y cinco microlitros de índice uno y cinco microlitros de índice uno y cinco microlitros de índice dos a cada uno. Mezcle bien y cubra la placa con una película adhesiva Micros EAL. Después de centrifugar, coloque la placa en el termociclador y ejecute el programa uno.Después de purificar y determinar el rendimiento de la primera ronda de PCR, comience la primera hibridación extrayendo hasta 12 muestras. En la nueva placa de 96 pocillos, asegurándose de que el volumen final de cada piscina no supere completamente los 40 microlitros, mezcle la solución NCT y agregue 50 microlitros a cada pocillo. Después de agregar 10 microlitros de CSO, mezcle y selle la placa.Después de centrifugar, coloque la placa en un termociclador y ejecute el programa. Dos. Para el primer lavado de hibridación, retire la placa del termociclador y centrifuga. Retire brevemente la cubierta adhesiva con mucho cuidado.Transfiera 100 microlitros de mezcla de reacción de la placa a una nueva placa MIDI de 96 pocillos y agregue 250 microlitros de solución Vortex SMB de pocillos. Mezcle y selle la placa antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar y desechar la supena, agregue 200 microlitros de solución WS dos bien mezcladas en pocillos que contengan perlas y mezcle bien transtransfiera todo el volumen a una nueva placa de 96 pocillos.Selle la placa y colóquela en un termociclador. Ponga en marcha el termociclador a 42 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez completado, coloque inmediatamente la placa en el soporte magnético durante dos minutos.Asegúrese de que el sobrenadante aparezca completamente transparente. Retire el precinto y deseche inmediatamente todo el sobrenadante. Retire la placa del soporte magnético.Agregue 200 microlitros de solución Ws tres bien mezcladas en pocillos que contengan perlas y mezcle bien. Después de lavar y retirar el supinado, selle la placa y centrifugue brevemente para eliminar el natante supino residual. Coloque la placa en el soporte magnético durante dos minutos.Deseche el supinato residual. A continuación, retire la placa del soporte magnético. Agrega 23 microlitros de la mezcla previamente preparada.Después de mezclar, selle la placa y déjela durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar. Después de transferir 21 microlitros de sate a una nueva placa de 96 pocillos, agregue cuatro microlitros de ET, dos soluciones a cada una. Mezclar bien y sellar la placa antes de la centrifusión.Para comenzar la segunda hibridación, retire la película adhesiva y agregue 50 microlitros de NCT, 10 microlitros de CSO y 15 microlitros de agua de grado PCR a los 25 microlitros de biblioteca. Después de centrifugar, coloque la placa en un termociclador y ejecute el programa. Dos. En una nueva placa de 96 pocillos se mezclaron 20 microlitros de evolución del paso anterior.Con 25 microlitros de T-C-P-M-M y cinco microlitros de PPC, selle la placa después de mezclar y centrifugar. A continuación, coloque la placa en un termociclador y ejecute el programa tres al día siguiente, centrifugue la placa y lave las perlas con etanol. Retire la placa del soporte magnético y agregue 30 microlitros de tampón RSB.Mezclar e incubar el plato durante dos minutos. A temperatura ambiente, coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético e incube durante cinco minutos o hasta que el sobrenadante S parezca completamente transparente. Transfiera suavemente 28 microlitros de la nariz a una nueva placa de 96 pocillos.El paso final es determinar la calidad de la biblioteca mediante un analizador de fragmentos o QPCR. Durante la ejecución, la densidad del cúmulo debe estar entre 801.000 K por milímetro cuadrado. Las diferentes imágenes corresponden a baja densidad, alta densidad y densidad perfecta.Los resultados obtenidos con esta tecnología son muy fáciles de interpretar como mutaciones puntuales o indel utilizando la bioinformática. Se indica el cambio de base y se identifica directamente la secuencia eliminada o insertada. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de tres días si se realiza correctamente.

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En este artículo se describen las buenas prácticas agrarias basadas en la...

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Identificación de los<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Transposón inserciones en tumores sólidos utilizando vinculador mediada por PCR

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Este protocolo describe el flujo de trabajo de un gen CRISPR/Cas9 basado en sistema para la reparación de las mutaciones de punto en células de mamíferos. Aquí, utilizamos un enfoque combinatorio gene edición con una detallado seguimiento estrategia experimental para medir la formación de indel en el sitio de destino, en esencia, analizar in situ la mutagénesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Este manuscrito describe una técnica para la detección de mutaciones de baja frecuencia en ctDNA, ER-SS. Este método se distingue por su uso único de corrección de errores de bidireccional, un filtro de fondo especial y eficiente adquisición molecular.

Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación

Las personas con mutaciones BRCA1 tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer, lo que garantiza una evaluación precisa de la función de las variantes brca1. En este documento, describimos un protocolo para la evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base de citosina mediadas por CRISPR que permiten la conversión de C:G a T:A dirigida en células vivas.

Evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base mediados por CRISPR

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

Aquí se presenta la endonucleasa sgRNA / CAS9 y el protocolo de secuenciación de próxima generación que se puede utilizar para identificar las mutaciones asociadas con la reparación de rotura de doble cadena cerca del promotor CD4.

Uso de la secuenciación de próxima generación para identificar mutaciones asociadas con la reparación de una rotura de doble cadena inducida por CAS9 cerca del promotor CD4

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Aprende a analizar 11 genes de reparación del ADN simultáneamente mediante tecnología de transposasa para secuenciación NGS. Este protocolo eficiente permite detectar variaciones genéticas en menos de dos semanas.

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños (Video) | JoVE Journal

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