gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

enriquecimiento de ADNg para la secuenciación de NGS es una herramienta fácil y potente para el estudio de mutaciones constitucionales. En este artículo se presenta el procedimiento para analizar de forma sencilla la secuencia completa de 11 genes implicados en la reparación de daños en el ADN.

El objetivo del siguiente experimento es analizar la secuencia de 11 genes simultáneamente con un protocolo muy fácil y relativamente rápido basado en tecnología basada en la transposasa. Esto se logra mediante la acción de una transposasa para obtener 300 fragmentos de ADN de pares de bases ligados directamente con adaptadores. La primera captura mediante sondas específicas, enriquece las muestras en las regiones de interés.

Este paso se repite una vez más para obtener solo las secuencias objetivo. A continuación, se realiza la amplificación por PCR con el fin de aumentar la cantidad de materiales a secuenciar, se obtienen resultados que muestran variaciones genéticas en genes en base al alineamiento de secuencias y análisis bioinformáticos. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la secuenciación Sanger, es su gran capacidad que permite analizar 24 pasiones para 11 genes completos en menos de dos semanas.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Sandy, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, prepare todos los reactivos del kit de enriquecimiento de ADN. Cuando esté listo, agregue aproximadamente 50 nanogramos de ADN genómico en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, comience la mentación agregando 25 microlitros de tampón TD y luego cinco microlitros de tampón TDE.

En cada pocillo, ajuste una pipeta a 50 microlitros y pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Centrifugar brevemente y luego coloque la placa en un termociclador cuando esté lista. Agite la solución ST y agregue 15 microlitros a cada pocillo que contenga la muestra.

Ajuste la pipeta a 65 microlitros y pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces, incube durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de la centrifusión. A continuación, agregue 52 microlitros de perlas magnéticas de purificación previamente mezcladas a cada mezcla de pocillos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar. Después de lavar las perlas con etanol, retire la placa del soporte magnético y agregue 22,5 microlitros de tampón RSB.

Después de mezclar, coloque la placa en el soporte magnético e incube durante dos minutos. Asegúrese de que el sobrenadante aparezca completamente transparente. Transfiera suavemente 20 microlitros de la nariz a una nueva placa de 96 pocillos.

Para comenzar la primera ronda de amplificación por PCR, agregue 20 microlitros de LP PMM y cinco microlitros de índice uno y cinco microlitros de índice uno y cinco microlitros de índice dos a cada uno. Mezcle bien y cubra la placa con una película adhesiva Micros EAL. Después de centrifugar, coloque la placa en el termociclador y ejecute el programa uno.

Después de purificar y determinar el rendimiento de la primera ronda de PCR, comience la primera hibridación extrayendo hasta 12 muestras. En la nueva placa de 96 pocillos, asegurándose de que el volumen final de cada piscina no supere completamente los 40 microlitros, mezcle la solución NCT y agregue 50 microlitros a cada pocillo. Después de agregar 10 microlitros de CSO, mezcle y selle la placa.

Después de centrifugar, coloque la placa en un termociclador y ejecute el programa. Dos. Para el primer lavado de hibridación, retire la placa del termociclador y centrifuga. Retire brevemente la cubierta adhesiva con mucho cuidado.

Transfiera 100 microlitros de mezcla de reacción de la placa a una nueva placa MIDI de 96 pocillos y agregue 250 microlitros de solución Vortex SMB de pocillos. Mezcle y selle la placa antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar y desechar la supena, agregue 200 microlitros de solución WS dos bien mezcladas en pocillos que contengan perlas y mezcle bien transtransfiera todo el volumen a una nueva placa de 96 pocillos.

Selle la placa y colóquela en un termociclador. Ponga en marcha el termociclador a 42 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez completado, coloque inmediatamente la placa en el soporte magnético durante dos minutos.

Asegúrese de que el sobrenadante aparezca completamente transparente. Retire el precinto y deseche inmediatamente todo el sobrenadante. Retire la placa del soporte magnético.

Agregue 200 microlitros de solución Ws tres bien mezcladas en pocillos que contengan perlas y mezcle bien. Después de lavar y retirar el supinado, selle la placa y centrifugue brevemente para eliminar el natante supino residual. Coloque la placa en el soporte magnético durante dos minutos.

Deseche el supinato residual. A continuación, retire la placa del soporte magnético. Agrega 23 microlitros de la mezcla previamente preparada.

Después de mezclar, selle la placa y déjela durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar. Después de transferir 21 microlitros de sate a una nueva placa de 96 pocillos, agregue cuatro microlitros de ET, dos soluciones a cada una. Mezclar bien y sellar la placa antes de la centrifusión.

Para comenzar la segunda hibridación, retire la película adhesiva y agregue 50 microlitros de NCT, 10 microlitros de CSO y 15 microlitros de agua de grado PCR a los 25 microlitros de biblioteca. Después de centrifugar, coloque la placa en un termociclador y ejecute el programa. Dos. En una nueva placa de 96 pocillos se mezclaron 20 microlitros de evolución del paso anterior.

Con 25 microlitros de T-C-P-M-M y cinco microlitros de PPC, selle la placa después de mezclar y centrifugar. A continuación, coloque la placa en un termociclador y ejecute el programa tres al día siguiente, centrifugue la placa y lave las perlas con etanol. Retire la placa del soporte magnético y agregue 30 microlitros de tampón RSB.

Mezclar e incubar el plato durante dos minutos. A temperatura ambiente, coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético e incube durante cinco minutos o hasta que el sobrenadante S parezca completamente transparente. Transfiera suavemente 28 microlitros de la nariz a una nueva placa de 96 pocillos.

El paso final es determinar la calidad de la biblioteca mediante un analizador de fragmentos o QPCR. Durante la ejecución, la densidad del cúmulo debe estar entre 801.000 K por milímetro cuadrado. Las diferentes imágenes corresponden a baja densidad, alta densidad y densidad perfecta.

Los resultados obtenidos con esta tecnología son muy fáciles de interpretar como mutaciones puntuales o indel utilizando la bioinformática. Se indica el cambio de base y se identifica directamente la secuencia eliminada o insertada. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de tres días si se realiza correctamente.