Name: Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a inducir degeneración retinal con MNU en pez cebra adulto y evaluar la regeneración mediante respuesta optocinética, histología e inmunohistoquímica. Este modelo permite estudiar procesos de muerte celular y neurogénesis.

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Agradecemos a Monika Kilchenmann, Federica Bisignani y Agathe Duda por su excelente asistencia técnica.

Todos los experimentos se adhirieron a la Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Visión de Investigación de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO). 1. Animales <ol><li> Mantener el pez cebra de tipo salvaje (Danio rerio) de la cepa AB (Oregon) con edades comprendidas entre 6 a 12 meses en condiciones normales en el agua con una temperatura de 26,5 ° C y un 14/10 horas de luz / oscuridad ciclo 15. </li><li> Siga las instrucciones de cuidado de los animales de las instituciones involucradas para los experimentos con animales después de la aprobación por la Oficina Veterinaria Cantonal. </li></ol> 2. Tratamiento MNU <ol><li> Preparar agua que contiene 150 mg / L de sustancia seca de N-metil-N-nitrosourea (MNU). PRECAUCIÓN! MNU es tóxico; puede provocar cáncer, alteraciones genéticas hereditarias o daño al niño no nacido. </li><li> Incubar pez cebra en el agua que contiene el MNU durante 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuagar rápidamente con el pez cebraagua dulce y puso el pescado a un nuevo tanque de peces sin MNU. Mantener el pescado en condiciones estándar tanto como se desee para los experimentos. </li></ol> 3. Visual Acuity Medición <ol><li> Inicie el sistema optomotor, elija &#39;prueba&#39; en el menú y configurar las opciones para &quot;Simple escalera&quot;, &quot;Agudeza (Freq)&quot; y &quot;Aleatorio / independiente&quot; 16. </li><li> Instale una botella de infusión llena con 500 ml de agua aproximadamente 1 m por encima del sistema optomotor. </li><li> Coloque un pez cebra en la cámara de exploración y conectarlo a la botella de infusión. Coloque la cámara de examen en el sistema optomotor. </li><li> Inicie la medición y observar el movimiento del ojo en tiempo real en la pantalla del ordenador. De esta manera, una respuesta positiva (&quot;sí&quot;) se define como movimientos sacádicos consecutivos en la dirección correcta, mientras que una respuesta negativa (&quot;no&quot;) representa los movimientos oculares aleatorios similares a los observados con la estaciónrejillas arias. Si los ojos de la exposición pez cebra tres o más respuestas optocinético posteriores (OKR), pulse &quot;sí&quot;; si no es así, pulse &#39;no&#39;. </li><li> Extraer la agudeza visual, que ha sido calculada por el software mediante la determinación del umbral de la frecuencia espacial del estímulo optocinético, en &quot;Resultados&quot; en el menú. </li></ol> 4. Histología <ol><li> La eutanasia el pez cebra por una sobredosis de acetato de metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (200-300 mg / L) y enucleación de los ojos. </li><li> Fije el conjunto de ojos en el 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante 12 horas y luego deshidratar las muestras en una serie gradual de alcohol. </li><li> Insertar las muestras en parafina, se cortaron secciones de 5 micras a través de la cabeza del nervio óptico (ONH) y montarlos en un portaobjetos de vidrio. </li><li> Teñir las secciones de parafina deparaffized con hemalum durante 4 minutos y sumergir los portaobjetos dos veces en agua destilada seguido de aci clorhídrico 0,2%d y 0,8% de amoníaco. Teñir las secciones con eosina durante 3 minutos después del desarrollo de la tinción hemalum en agua corriente durante al menos 10 min (H &amp; E). </li><li> Insertar las diapositivas deshidratados en medio de montaje y observar las diapositivas bajo el microscopio óptico. </li></ol> 5. inmunohistoquímica <ol><li> Desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) <ol><li> Incubar las secciones desparafinadas con 20 mg / ml de proteinasa K a temperatura ambiente durante 15 min. Lávese las secciones tres veces con Tris salino (TBS) tamponada durante 5 minutos cada uno. </li><li> Incubar las secciones con 50 l mezcla de reacción TUNEL (solución de etiquetado 10% y solución de enzima 90%) en una cámara humidificada a 37 ° C durante 60 min. Lavar tres veces con TBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Monte los portaobjetos con medio que contiene DAPI montaje y observar las diapositivas bajo el microscopio de fluorescencia. </li></ol></li><li> La proliferación celular antígeno nuclear (PCNA) tinción <ol><li> Hervir los cortes desparafinados en tampón de recuperación de antígeno (Tris-EDTA + 0,05% de Tween 20, pH 9,0) durante 3 min y se lava tres veces con TBS durante 5 min cada uno. Bloquear con 100 l solución de bloqueo (TBS + 10% de suero normal de cabra + 1% de albúmina de suero bovino, pH 7,6) a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Teñir con anti-PCNA anticuerpos primarios en una dilución 1: 200 en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. Lavar tres veces con TBS + Tween 20 durante 5 minutos cada uno. </li><li> Terminar la detección con los anticuerpos secundarios apropiados, en una dilución de 1: 500 a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Monte los portaobjetos con medio que contiene DAPI montaje y observar las diapositivas bajo el microscopio de fluorescencia. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Anteriormente, nuestro grupo ha transferido el modelo MNU de degeneración de los fotorreceptores de los roedores en el sistema de pez cebra 9. Los acontecimientos que siguieron fueron descritos y seguidos durante un máximo de 30 días. En este período de tiempo completa degeneración de la retina y la regeneración morfológica se produjeron después del tratamiento inicial. En primer lugar, la histología revela un recuento celular reducido de varilla de 3 días con un mínimo en día 8. Correspondientemente, la tinc...

Visión es el sentido más importante para el ser humano y su deterioro tiene un impacto socio-económico alto. En el mundo desarrollado, las enfermedades degenerativas de la retina son la principal causa de pérdida de visión y ceguera entre los adultos mayores 1. La causa de la mayoría de las enfermedades degenerativas de la retina está sólo parcialmente entendida y soluciones terapéuticas para recuperar la visión perdida son muy limitadas. La retinitis pigmentosa es un ejemplo típico de una enfermedad degenerativa de la retina con la pérdida de fotorreceptores primaria 2-3. N-metil-N-nitrosourea (MNU) induce la degeneración de la retina y por lo tanto es ampliamente utilizado en roedores para modelar enfermedades con la muerte de las células fotorreceptoras primaria 4. Es un agente alquilante y conduce a tumores benignos y malignos, los cuales suelen aparecer varios meses después de la exposición 5-7. Además, provoca la muerte de las células fotorreceptoras específica dentro de un período de observación a corto plazo. De este modo, la pérdida de la capa retiniana structure y el adelgazamiento de la retina significativa se observó de manera dependiente de la concentración. Células gliales de la retina se activan, pero no se encontraron cambios en el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Retículo endoplasmático (ER) la apoptosis relacionada con el estrés parece ser la vía principal de la acción MNU en la retina 8. Recientemente hemos introducido MNU como un modelo químico para inducir la degeneración de los fotorreceptores en el pez cebra 9. Entre otras razones, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en importante en la investigación visual debido a las similitudes de su sistema visual a la de otros vertebrados 10. La retina externa contiene los fotorreceptores, que se pueden agrupar en cuatro tipos de conos diferentes con sensibilidades de los picos en el ultravioleta, a corto, medio y largo longitud de onda del espectro visible y una barra tipo fotorreceptor. En la capa nuclear interna (INL), los cuerpos celulares de las bipolares, amacrinas y interneuronas horizontales se encuentran, como well como el soma celular de las células gliales de Müller. En la capa plexiforme externa (OPL) se forman los contactos sinápticos entre fotorreceptores y la retina interna, mientras que la capa de células más cerca de la lente es la capa de células ganglionares (GC), que forman los componentes de los axones largos que comprenden el nervio óptico y el tracto óptico . Contactos sinápticos entre las células ganglionares y las células en la capa nuclear interna se forman en la capa plexiforme interna (IPL) 11. El RPE se encuentra fuera de la retina neurosensorial y rodea los segmentos externos de los fotorreceptores con microvellosidades apicales de largo 12. Por otra parte, el pez cebra es altamente regenerativo y capaz de regenerar el cerebro lesioned, retina, médula espinal, el corazón y otros tejidos 13. Cuando se produce daño en la retina, las células en la INL, que se cree que son las células de Müller, se activan y tienen el potencial de diferenciarse en diversos tipos de células de la retina. Además, también generan progenitores de varilla, que se encuentran en el ONL. Otro modource que suministra la retina del pez cebra adulto con nuevas células es la zona marginal ciliar. Esta fuente es necesaria para lograr una densidad constante de fotorreceptores de los bastones en el ojo de pez cebra en continuo crecimiento 14. El modelo MNU se puede utilizar como un enfoque sencillo y reproducible degeneración / regeneración de tejido de la retina. Debido a ciertas similitudes de los procesos biológicos en el pez cebra y en los seres humanos esto podría abrir las puertas para identificar vías de muerte celular implicados y para detectar potenciales medicamentos neuroprotectores. Basado en un estudio previo de nuestro grupo, que ahora ilustran los métodos de este modelo de pez cebra inducido por MNU de de retina y la consiguiente regeneración incluyendo cambios funcionales con acuerdo vídeos laboratorio 9.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Amoníaco</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td></td><td>294993 0,80%</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje DAPI</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, EE. UU.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>E10521</td><td>Tricaína</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zug, Suiza&nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Dako, Glostrup, Dinamarca</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>320331</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>Kit de detección de muerte celular in situ</td><td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Suiza</td><td>11684795910</td><td>TUNEL Kit</td></tr><tr><td>Solución de hemalum de Mayer</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Metilnitrosourea (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>N4766</td><td></td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>Tóxico CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canadá</td><td>n.a.Paraformaldehído</td><td></td></tr> <tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-PCNA&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE. UU.</td><td>SC-33756</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio Superfrost Plus</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Alemania</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Pez cebra (Danio rerio) AB (Oregón)</td><td>cepa Universidad de Friburgo, Departamento de Biología</td><td>n.a.Instalación</td> <td>propia de peces</td></tr></tbody></table>

metilnitrosourea (mnu) inducida por la retina degeneración y regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Enfermedades retinianas degenerativas, por ejemplo, la retinitis pigmentosa, con daño resultante cuenta fotorreceptor para la mayoría de pérdida de la visión en el mundo industrial. Los modelos animales son de importancia fundamental para estudiar este tipo de enfermedades. En este sentido la toxina-fotorreceptor específico N-metil-N-nitrosourea (MNU) ha sido ampliamente utilizado en roedores para inducir farmacológicamente degeneración de la retina. Anteriormente, hemos establecido un modelo de degeneración de la retina inducida por MNU en el pez cebra, otro modelo de sistema popular en la investigación visual. A diferencia fascinante para los mamíferos es la neurogénesis persistente en la retina del pez cebra adulto y su regeneración después del daño. Para cuantificar esta observación hemos empleado mediciones de agudeza visual en el pez cebra adulto. De este modo, se utilizó el reflejo optocinético para seguir los cambios funcionales en los peces no anestesiado. Esto se complementó con la histología, así como staini inmunohistoquímicang para la apoptosis (TUNEL) y proliferación (PCNA) para correlacionar los cambios morfológicos en desarrollo. En resumen, la apoptosis de los fotorreceptores se produce tres días después de tratamiento MNU, que es seguido por una reducción marcada de las células en la capa nuclear externa (ONL). A partir de entonces, se observa proliferación de células en la capa nuclear interna (INL) y ONL. Aquí, nos revelan que no sólo es un histológica completa sino también una regeneración funcional se produce durante un transcurso de tiempo de 30 días. Ahora nos ilustran los métodos para cuantificar y hacer un seguimiento de retina del pez cebra y la regeneración utilizando MNU en un video-formato.

Agudeza visual: El montaje experimental [frecuencia espacial: 0.042 círculos / grado (c / d); Contraste: 100%; velocidad de deriva: 20 grados / segundo (d / src); volver luminancia luz: 152 cd / m 2] de este estudio permitió evaluar OKR de adultos de pez cebra. La duración media de la medición VA fue de unos 5 a 10 minutos para cada pez cebra, que toleró bien el procedimiento. La agudeza visual antes de la exposición MNU fue 0.577 ± 0.014 ciclos / grado (c / d). Figura 1</...

Aquí demostramos cuantificación de de retina y la regeneración y su impacto en la función visual usando N-metil-N-nitrosourea en el pez cebra adulto. Pérdida de la agudeza visual y la disminución de los números de fotorreceptores fueron seguidos por la proliferación en la capa nuclear interna. Regeneración morfológica y funcional completa ocurrió 30 días después del tratamiento inicial.

Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir la degeneración de la retina y la consiguiente regeneración en el pez cebra adulto utilizando n metilo y nitro ueaa. Esto se logra incubando primero el pez cebra de tipo salvaje en agua que contiene N metil N nitrosa urea, o MNU. La siguiente función visual se cuantifica midiendo la respuesta optocinética o OKR y calculando la agudeza visual en diferentes puntos temporales.Después del tratamiento, el pez cebra se sacrifica y los ojos se nuclean para exámenes histológicos utilizando tinción h y e para observar cambios morfológicos en el tejido de la retina. Finalmente, los cambios celulares se visualizan en la retina con tinción específica para la muerte y proliferación celular. En última instancia, la medición de la agudeza visual y la cuantificación de los cambios morfológicos y celulares se utilizan para visualizar la D de la retina y la regeneración.La principal ventaja de este modelo farmacológico es que es sencillo y rápido de usar e induce una degeneración y regeneración regional fiable en peces cebra adultos. Para llevar a cabo el tratamiento con NM metil n nitroso urea o MNU, comience preparando agua que contenga 150 mili

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Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

Debido a que muchos modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos en lugar de el embrión / larvas, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo regenerativa línea lateral que se puede aplicar a modelos de enfermedad de pez cebra adultos. El ensayo implicó resolución en el neuromast 1) y 2) los niveles de células cabello individual.

Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

Para ayudar a evaluar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración hepática biliar del pez cebra, establecimos un modelo de lesión hepática en el que los hepatocitos que expresan nitroreductasa se ablacionan genéticamente tras el tratamiento con metronidazol.  En este protocolo, describimos cómo manipular, monitorizar y analizar hábilmente la ablación de hepatocitos y la regeneración hepática impulsada por la biliar.

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

La exposición a teratógenos puede causar defectos de nacimiento. El pez cebra son útiles para determinar el potencial teratogénico de productos químicos. Se demuestra la utilidad de pez cebra mediante la exposición de los embriones a diferentes niveles de nitrito y también en diferentes momentos de exposición. Se demuestra que el nitrito puede ser tóxico y causar graves defectos de desarrollo.

El pez cebra como modelo para evaluar el potencial teratogénico de nitrito

El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser...

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Un modelo atractivo para el estudio de la diferenciación de células madre en un animal vivo es el gusano planaria. La regeneración se estudia por medio de experimentos sencillos que la amputación se realiza fácilmente en un laboratorio básico y son susceptibles de (farmacológicos y...

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Aprende a inducir degeneración retinal con MNU en pez cebra adulto y evaluar la regeneración mediante respuesta optocinética, histología e inmunohistoquímica. Este modelo permite estudiar procesos de muerte celular y neurogénesis.

Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales (Video) | JoVE Journal

Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales

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