Un método altamente reproducible y fácil de Perform En Vivo Ocular enucleación en el ratón después de la abertura del ojo
6 de octubre de 2014
La eliminación de los ojos, también llamado enucleación, ofrece una estrategia útil para estudiar los aspectos de la visual, cross-modal, y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual de mamíferos ya que induce irreversible parcial (monocular) o completa (binocular) pérdida de la visión. Aquí se describe un enfoque altamente reproducible y fácil de realizar en la enucleación vivo.
El objetivo general de este procedimiento es extraer con éxito un ojo de un ratón anestesiado de una manera muy sencilla y reproducible. Esto se logra desplazando primero el globo ocular presionando suavemente el canto con una pinza curva. El segundo paso del procedimiento es guiar las pinzas detrás del ojo, para agarrar firmemente el nervio óptico.
El tercer paso es hacer movimientos circulares. Con la mano que sostiene las pinzas, el cuerpo del ratón se moverá en la misma dirección. El paso final es aumentar gradualmente la velocidad de los movimientos para asegurar la constricción del nervio óptico, lo que resulta en el desprendimiento del globo ocular.
En última instancia, el ojo se puede utilizar para estudiar la vía visual AFR longitudinalmente, por ejemplo, revelando diferentes procesos de plasticidad de privación sensorial en el cerebro del ratón. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, que a menudo utilizan la sutura y la disección roma, es que nuestro método de iación se basa simplemente en la constricción del nervio óptico, lo que resulta en un sangrado mínimo o nulo y es muy fácil de aprender. Comience con la anestesia del ratón mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y meine en solución salina.
Confirme la sedación comprobando los reflejos del ratón. Pellizque los dedos de los pies con fórceps y verifique si hay una respuesta refleja. Si no hay respuesta, use un aplicador con punta de algodón y etanol al 70% para limpiar los párpados y el área alrededor del ojo.
Si no hay respuesta de parpadeo, proceda con el ojo en nucleación. Coloque el mouse sobre una superficie estable, plana, lisa y seca. Esterilice las puntas de las pinzas dentadas curvadas en un esterilizador de perlas de vidrio.
El mejor tamaño de punta para usar es de 0,5 por 0,4 milímetros. A continuación, presione suavemente el canto con las pinzas hasta que el globo ocular se desplace de la cuenca y se pueda alcanzar el nervio óptico. Luego, guíe las pinzas detrás del ojo y presione y sostenga firmemente el nervio óptico con el nervio óptico agarrado. Comience a mover lentamente las pinzas en círculos en la dirección de menor resistencia.
Manteniendo el mouse contra la mesa de operaciones, el mouse debe estar asegurado. Su cuerpo también debe moverse. Se acelera gradualmente hasta que después de siete a 15 movimientos circulares, el nervio óptico se contrae y el globo ocular se desprende.
Si las rotaciones son demasiado rápidas o se tira de las pinzas con demasiada fuerza, el nervio se romperá prematuramente y seguirán las súplicas. Comience por revertir la anestesia. Administre al ratón una inyección intraperitoneal de clorhidrato de aamaz all en solución salina.
A continuación, administrar por vía intramuscular 0,05. Los mililitros de analgésicos preparados, como meloxicam y analgesia, deben administrarse cada 24 horas. Ahora, aplique ungüento para los ojos en el ojo restante para prevenir la deshidratación de la córnea.
Si se hubiera aplicado antes de la cirugía, se habría untado sobre la mesa. Mueva el ratón a una jaula de retención, controle la temperatura corporal del ratón con una placa calefactora o una manta mientras se recupera cuando el animal recupere el control del motor, transfiéralo de nuevo a su jaula de origen. Una extirpación exitosa del ojo se caracteriza por la ausencia de sangrado o cualquier daño físico aparente en el tejido orbitario o la cuenca del ojo.
El ojo enucleado debe tener las características de un globo intacto, como una córnea lisa y una coroides. El nervio óptico debe estar constreñido en la base de la retina. La longitud restante del nervio en el animal debe mostrar un corte limpio y el área circundante del cerebro no debe dañarse.
Se llevó a cabo un experimento utilizando estas técnicas seguido de la detección de ARNm Z 2 68 por hibridación radiactiva en C dos para descubrir la actividad neuronal inducida visualmente en la corteza cerebral. En contraste con los controles estimulados visualmente, los ratones con ojos y nucleados mostraron actividad basal en la corteza visual izquierda y derecha debido a la falta total de información visual. De este modo, se descubrieron las fronteras entre la corteza visual y la no visual.
La enucleación monocular reveló que las dos regiones impulsadas por el monocular eran hipoactivas en la corteza visual contralaterales al tinte eliminado. Estas regiones se localizan medial y lateralmente a la zona binocular central. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de un minuto si se realiza correctamente.
Por lo tanto, proporciona un método eficiente para examinar la actividad, la plasticidad u otros fenómenos en la vía visual ORL.
Resumen
Este artículo presenta un método sencillo para realizar enucleación in vivo en ratones, lo que permite a los investigadores estudiar la plasticidad visual y cruzada. La técnica minimiza el sangrado y es fácil de aprender, lo que la hace adecuada para diversas aplicaciones experimentales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Sistema visual
- Investigación sobre plasticidad
Antecedentes
- La enucleación induce pérdida de la visión, facilitando estudios sobre el procesamiento visual.
- El procedimiento permite examinar los efectos de la privación sensorial en el cerebro.
- Los métodos existentes suelen implicar técnicas complejas que pueden provocar complicaciones.
- Este método pretende ofrecer una alternativa más segura y eficiente.
Objetivo del estudio
- Describir una técnica reproducible para la extirpación del ojo en ratones.
- Permitir el estudio de las vías visuales y la plasticidad en el cerebro.
- Mejorar los métodos existentes de enucleación.
Métodos Utilizados
- Anestesia del ratón utilizando una mezcla de ketamina y solución salina.
- Desplazamiento del globo ocular utilizando fórceps curvados.
- Agarre y constricción del nervio óptico para desprender el globo ocular.
- Cuidados postoperatorios que incluyen alivio del dolor y monitoreo de la recuperación.
Resultados principales
- La técnica dio como resultado una hemorragia mínima y tejidos circundantes intactos.
- Los ratones enucleados mostraron una actividad neuronal alterada en la corteza visual.
- La enucleación monocular reveló una hipofunción en regiones visuales específicas.
- El procedimiento puede realizarse eficientemente en menos de un minuto.
Conclusiones
- El método de enucleación descrito es eficaz para estudiar la plasticidad visual.
- Proporciona un enfoque confiable para investigar los efectos de la privación sensorial.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para obtener mayores conocimientos sobre el procesamiento visual.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La enucleación ocular in vivo fiable en ratones permite la investigación de alto rendimiento de la plasticidad del sistema visual y de los mecanismos de privación sensorial, apoyando la validación temprana de objetivos en neurobiología. La reproductibilidad y la simplicidad operativa del método reducen la variabilidad del procedimiento, mejorando la confianza predictiva en los análisis posteriores. Esta capacidad es estratégicamente relevante para los equipos de biofármacos que buscan modelos preclínicos robustos para investigar la adaptación neural y la plasticidad cruzada de modalidades.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite modelos de desaferentación controlada para estudios mecanicistas de la plasticidad neural.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante el aislamiento de variables de entrada sensorial in vivo.
- Facilita la interrogación basada en hipótesis de la adaptación de la vía visual.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona una preparación estandarizada de modelos animales para la selección fenotípica reproducible.
- Asegura un daño tisular mínimo y una recuperación postoperatoria constante, lo que favorece la fiabilidad del ensayo.
- Permite la evaluación cuantitativa de los cambios en la actividad neuronal tras la privación sensorial.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad en el estudio de la neuroplasticidad y la pérdida sensorial.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de dianas neuronales.
- Reduce el riesgo biológico al permitir la generación robusta y escalable de modelos animales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de enucleación se integra en la fase de descubrimiento temprano hasta la etapa preclínica, proporcionando una base para la reducción de riesgos mecanicistas y la validación de dianas en la investigación neurobiológica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de la hipótesis nula mediante la eliminación precisa de las entradas sensoriales.
- Selección: Proporciona modelos animales reproducibles para ensayos cuantitativos posteriores.
- Análisis: Permite la medición de la actividad neuronal y la plasticidad cortical tras la enucleación.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento básico con modelos preclínicos de privación sensorial.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo escalable y de baja variabilidad, adaptable a diversos modelos de roedores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los estudios de adaptación neural y la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de animales, reduciendo la carga de entrenamiento y la variabilidad de los procedimientos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones eficientes de avance/no avance en carteras centradas en neuroplasticidad.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos y vías neuronales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere dominio de la anestesia en roedores y el manejo microquirúrgico.
- Necesita acceso a pinzas curvas esterilizadas e infraestructura para cuidados posoperatorios.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad en estudios multisitio.
- La adaptación a otras especies de roedores es factible con modificaciones menores.
- No es adecuado para el análisis de tejido retiniano debido al posible daño procedimental.
