Name: Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende a detectar interacciones entre receptores de proteínas en tiempo real utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR), un método sin etiquetas que permite calcular afinidades y estudiar dinámicas de unión.

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La investigación en el laboratorio de Lewinson está respaldada por subvenciones de la Academia de Ciencias de Israel, el Instituto Rappaport para la investigación biomédica, la Fundación de Investigación Meriuex y la beca de reintegración profesional Marie Curie (OL). EV cuenta con el apoyo de la beca Fine y de la Facultad de Medicina Technion. NLL cuenta con el apoyo de subvenciones de la Academia de Ciencias de Israel.

1. proteína de la muestra y la Preparación Buffer <ol><li> Preparación de la muestra: purificar las proteínas de interés y asegurarse de que se eliminan todos los agregados, mediante la inyección de la proteína antes del experimento en una columna de filtración en gel o por ultracentrifugación (por lo general 10 minutos a 100.000 xg es suficiente). NOTA: Aunque los preparados de proteínas deseables, altamente puros no son una necesidad. SPR ha sido utilizado con éxito con menos-que-perfecta purificaciones y hasta con 8,9 total del extracto. </li><li> Preparación Buffer: <ol><li> Preparar el tampón del experimento (denominado &quot;tampón&quot;, o RB). Para el protocolo descrito aquí, utilizar Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenga en cuenta que la elección de la composición del tampón se puede modificar fácilmente de acuerdo con el sistema estudiado. </li><li> Filtra todos los tampones y muestras de proteínas utilizando 0,22 micras filtros. Asegúrese de antemano que los filtros están en proteínascompatible. En general, las plataformas SPR recientemente comercializados contienen un filtro en línea de-Gasser; Si este no es el caso, de-gas los tampones antes de su uso. </li><li> Dializar noche o diluir las muestras contra la RB para evitar desajustes de amortiguamiento. Diálisis (o cualquier otro método de intercambio de tampón) es especialmente recomendable cuando se utilizan productos químicos de alta viscosidad (por ejemplo, sacarosa, glicerol, DMSO). Antes de conectar la botella RB a la entrada de la bomba mantener a un lado 10 ml de la RB en un tubo separado. </li></ol></li><li> Diluir el ligando madre concentrada en RB a una concentración final de ~ 20 mg / ml. Como regla general, para la inmovilización del ligando estable, utilizar concentraciones de ligando bajas con inyecciones más largos a bajo flujo, en oposición a altas concentraciones, de alto flujo y las inyecciones más cortas. </li><li> Diluir el analito en el RB a la concentración deseada. Típicamente, probar la gama de concentraciones para un sistema de afinidad desconocido de 10 M a 10 nM en diluciones de diez veces. Comience siemprecon las concentraciones más bajas primero. </li></ol> 2. Sensor de Chip <ol><li> Selección Chip: Utilice un ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adecuado para la captura de proteínas con una etiqueta oligo-histidina. </li><li> Uso Chip: <ol><li> Cuando se utiliza un nuevo chip, tomar el chip fuera de la vaina, enjuague suavemente con agua doblemente destilada (DDW), secar líquidos restantes cuidadosamente usando limpiadores delicados, y asegúrese de no tocar la superficie de la capa de oro. Coloque el chip en la vaina en la orientación correcta (la inserción es suave cuando el chip se coloca correctamente). </li><li> Cuando vuelva a utilizar un chip, sacar el chip almacenado desde la memoria intermedia, enjuague bien con DDW y seca suavemente como se ha dicho, y colocar en su vaina originales. NOTA: La acumulación de material de chatarra no específica en el chip puede afectar a su &#39;viabilidad&#39;. Esto puede ser controlado mediante la comparación de las EF antes de la inmovilización del ligando y post extracción. Aunque muchas mediciones pueden serhecho usando el mismo chip NiNTA, el tema de su longevidad no es una &#39;clara&#39; y varía mucho entre los diferentes chips. </li></ol></li><li> Docking Chip: Abra la puerta chip sensor y coloque el chip en su vaina. Cuando se utiliza un nuevo chip, el número de serie de entrada del chip para mantener registro de uso. Cierre la puerta y pulse &#39;chip de muelle &quot;. </li></ol> 3. Los ajustes de temperatura <ol><li> Ajuste la temperatura de la célula de chips a 25 ° C (o la temperatura experimento preferido). </li><li> Opcional: establecer el compartimiento de muestras a 7 ° C para mantener las proteínas estable durante todo el experimento. </li></ol> 4. Las soluciones para carga y el arrastre Preparar las siguientes soluciones para la carga y el arrastre: 0,5 mM NiCl 2 en RB, EDTA 350 mM en RB (añadir detergente a la solución de EDTA a una concentración final como en RB), 0,25% SDS en H 2 O, y HCl 100 mM en H 2 O. Cuando se utiliza bañera de micro-centrífugaes y no SPR tubos designados, no se olvide de cortar las tapas de los tubos. 5. Primer Instrumento SPR con RB 6. Iniciar un nuevo Run <ol><li> Ajuste el caudal que se utilizará durante el experimento. Para obtener los resultados descritos aquí establecer el flujo de 50 l / min. NOTA: Este parámetro se puede modificar durante el experimento. </li><li> Definir las vías de flujo y la resta de referencia. Para obtener los resultados descritos aquí establecidas las rutas de Fc = 1 y Fc = 2, Fc sustracción = 2-1. NOTA: El programa mostrará en tiempo real la sustracción de dos células de medición. Tenga en cuenta que este parámetro no puede ser alterado durante el experimento. </li><li> Seleccione la gradilla de muestras adecuado (que puede influir en el consumo de volumen de la muestra). </li><li> Guarde el archivo de resultados. </li></ol> 7. Ciclos Experiment Cada experimento se compone de ciclos, mantener un registro claro de las inyecciones realizadas en eaciclo ch, y separar la carga de los ligandos, la inyección en blanco de la memoria intermedia, y la inyección analito en diferentes ciclos. <ol><li> Ciclo 1: preparación Chip y níquel carga <ol><li> Asegúrese de que el flujo y caminos se establecen de acuerdo con el paso 6.1 y 6.2. </li><li> Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min para lavar platos sobrantes. </li><li> Definir el flujo de 10 l / min. </li><li> Inyectar 0,5 mM NiCl2 durante 2 min. NOTA: Ahora el chip de resina se recubre por iones de níquel. </li></ol></li><li> Ciclo 2: Ligandos inmovilización <ol><li> Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 2. </li><li> Inyectar ligando A hasta alcanzar valores de RU que son 10-20 veces de su peso molecular. Por ejemplo, cargar un ligando de 50 kDa a 500-1000 EF. Mantenga un registro del valor RU logrado. </li><li> Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1. </li><li> Inyectar ligando B (control) hasta el mismo valor que el de RU ligando A. Seguimiento de la Sensograma resta (Fc = 2-1) en línea para ayudar a controlar lalongitud de la inyección. </li><li> Flujo Set a 50 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, lavar el sistema de 5-20 minutos hasta que la línea de base (Fc = 2-1) se estabiliza. </li></ol></li><li> Ciclo 3: inyección en blanco. Esta inyección servirá para la resta en blanco, por lo tanto, incluir todos los componentes que se inyectan con el analito, excepto el propio analito. NOTA: La longitud de inyección puede variar en función del tiempo que tarda en alcanzar el equilibrio (mesetas de la señal). <ol><li> Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, Fc = 1.2 resta. </li><li> Introduzca el comando &#39;espera&#39; (en lo sucesivo como &quot;esperar&quot;) durante 30 segundos (para tener una línea de base estable). </li><li> Inyectar 15 seg RB. NOTA: La duración de la inyección puede variar entre los diferentes sistemas, en función de sus constantes cinéticas pre-equilibrio (sobre todo el k A). </li><li> Espere 120-600 segundos para registrar la fase de disociación. NOTA: La duración de esta etapa varía de acuerdo con el <em&gt; k d: Cuanto menor sea la disociación cuanto más tiempo este paso tiene que ser. Para los complejos de disociación muy lenta (k d &lt;10 -4 s -1), espere 10 a 15 minutos y luego se procederá a la superficie de regeneración (ver más adelante). </li></ol></li><li> Ciclo 4: inyección de analitos <ol><li> Copia / pega las condiciones exactas utilizadas en la inyección de referencia (ciclo 3), por lo que estos dos inyecciones pueden ser más tarde restan. Cambio de la ubicación de la ranura en el bastidor de la que contiene la solución de control a uno que tiene la solución de analito. Elija una concentración que es ligeramente superior a la esperada K D. Si no hay ningún conocimiento previo está disponible, elija 1 mM como un buen punto de partida. </li></ol></li><li> Ciclo 5: Inyección Buffer <ol><li> Repita el ciclo de 3. </li></ol></li><li> Ciclo 6: inyección del analito <ol><li> Repita el ciclo de 4. </li></ol></li><li> Ciclo 7: Chip desnudarse <ol><li> Definir el flujo de 50 l / min. &lt;/ Li&gt; <li> Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip. </li><li> Inyectar 0,25% SDS durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip. </li><li> Si no se alcanza el nivel de referencia, inyectar HCl 100 mM durante 1 min como etapa de separación adicional. </li><li> Introduzca el comando &#39;run final&#39; que cambia al modo de espera. </li></ol></li><li> Almacenamiento chip <ol><li> Desacoplar el chip sensor y lo saca del instrumento. </li><li> Tome el sensor fuera de su funda, evite tocar la superficie, enjuagar con DDW, y colocar en un tubo de 50 ml que contiene RB. Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 8. Análisis de datos utilizando Designado Software de evaluación <ol><li> Realice los siguientes pasos para procesar los datos brutos obtenidos por SPR antes de derivación de los parámetros cinéticos. <ol><li> Utilizando el software de evaluación, abiertael archivo de resultados, seleccione los ciclos 3-6 Fc = 2.1 (referencia resta de datos). </li><li> Eje de cambio: <ol><li> Mostrar ciclos 3-6. </li><li> Poner a cero el valor del eje Y de la línea de base (el 30 seg tiempo de espera inicial en cada ciclo) a la de todos los cuatro curvas. </li></ol></li><li> Alinear el eje X de las cuatro curvas. Elija las acentuadas características (por ejemplo, los picos de salida de la inyección o el final) para alinear perfectamente los cuatro curvas a lo largo del eje X. Establezca la hora del comienzo de analito (o tampón de control) a cero. </li></ol></li><li> Referencia de resta <ol><li> Restar la respuesta de fondo restando la curva de ciclo 3 de la curva de ciclo de 4 y la curva de ciclo 5 de la curva de ciclo de la operación 6. Uso curva de sustracción que se puede encontrar en el eje Y se desplaza menú. NOTA: Es importante realizar este paso en que anula los componentes no específicos (relacionados con el analito) que pueden haber influido en el índice de refracción de la superficie. <ol><li> Guarde las curvas restados en tél hoja de proyecto bajo un nombre diferente. </li></ol></li><li> Consulte estas curvas como &quot;curvas&quot; doblemente restados: la primera es la sustracción 2-1 resta se realiza en ambas inyecciones, y la segunda es la resta de una curva de otro. NOTA: Tal doble referencias es el estándar de oro en los experimentos de SPR. </li><li> Superposición de las curvas sustraídas mediante la realización de cambio del eje como se ha explicado antes. </li></ol></li><li> Determinación de la cinética de las constantes y ajuste del modelo <ol><li> La realización de un experimento de cinética <ol><li> Inyectar una serie de 6-7 concentraciones de analitos tener un fiable de datos para la determinación de las constantes cinéticas. Elige concentraciones de analito a partir de 10 veces por encima de 10 veces por debajo del estimado K D, en diluciones 2-3 veces. Incluya la concentración &quot;cero&quot;, posteriormente utilizado para la sustracción de referencia de matrimonio (ver arriba). Llevar a cabo inyecciones por triplicado y en orden aleatorio. </li><li> Alineary restar todas las curvas con respecto al eje Y y el eje X antes de intentar el ajuste del modelo. </li></ol></li><li> Ajuste del modelo <ol><li> Seleccione un programa de análisis adecuado. NOTA: La mayoría de los programas de ajuste disponibles ofrecen varios modelos que se pueden aplicar para el montaje y la determinación de las constantes cinéticas. </li><li> Aplicar el modelo más simple (Langmuir) suponiendo una reversible 1: 1 la interacción entre el analito y el ligando para el montaje. A menos convincentes datos disponibles de otros métodos experimentales para la existencia de una interacción más compleja, utilice siempre el modelo de Langmuir simple. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li>
<li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance%3A+a+laboratory+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161(2012).</li>
<li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+RNA%E2%80%93protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li>
<li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
<li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li>
<li>Mol, N., Fischer, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMol%2C+N+%22Surface+Plasmon+Resonance+Vol.+627+Methods+in+Molecular+Biology%22">Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology</a>. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).</li>
<li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Der+Merwe%2C+PA+%22Surface+plasmon+resonance.+Protein%E2%80%93+ligand+interactions%3A+hydrodynamics+and+calorimetry%22">Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry</a>. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
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Todos los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

SPR es un método muy sensible para estudiar las interacciones moleculares, y es a menudo el único enfoque que proporciona monitoreo en tiempo real de (pero importantes) interacciones transitorias. Un ejemplo es la interacción transitoria presentada en este documento, que no podía ser detectado por cualquier otro método (pull-down ensayos, los ensayos de liposomas de sedimentación 6). Por otra parte, mientras que otros métodos están limitados a mediciones de equilibrio (ya sea cuantitativa o cualitativa), SPR ...

Interacciones proteína-proteína (PPI); la formación y disociación de complejos de proteínas, son acontecimientos clave en muchos procesos biológicos (por ejemplo, replicación, transcripción, traducción, señalización, comunicación célula-célula). Estudios semi-cuantitativos de PPI se realizan a menudo utilizando desplegable o experimentos de inmuno-precipitación. Sin embargo, estas técnicas (y similares) están limitados en la gama de afinidades que se puede medir (micromolar bajo y mayor afinidad) debido a las etapas de lavado que son inherentes a tales técnicas. Tales técnicas de &quot;punto final&quot; no pueden identificar interacciones transitorias o de baja afinidad que a menudo son de grandes consecuencias biológicas. Además, la resolución temporal de estos enfoques es extremadamente limitado, generalmente órdenes de magnitud más lento que las tarifas de la reacción. SPR superar estas críticas debido a su mayor sensibilidad y resolución temporal superior 1,2. SPR es un método libre de etiquetas, y como talinteracción molecular se puede medir (siempre y cuando los cambios de masa pueden detectarse). Además de PPI, se ha utilizado ampliamente para caracterizar la proteína-ligando, la proteína-fármaco (o una molécula pequeña), la proteína de ADN, y las interacciones proteína-ARN 3-5. Los resultados se registran y se representan en tiempo real, que permite la modificación rápida de las condiciones experimentales y diseño experimental flexible. El principio físico detrás instrumentos basados ​​en SPR es la utilización de un sistema óptico que mide un cambio del índice de refracción en la superficie del sensor a los cambios de masa 2. Uno de los socios que interactúan (ligando de aquí en adelante) está inmovilizado en un chip de matriz de polímero y la segunda molécula (analito en lo sucesivo) se hace fluir sobre la superficie. El analito se une al ligando altera la masa sobre la superficie del chip. Este cambio de masa está directamente relacionado y proporcional a los cambios en el índice de refracción de la superficie. Los resultados se representan en tiempo real ypresentarse como unidades de respuesta (RU) como una función del tiempo. Tal trama se denomina una Sensograma (por ejemplo, Figura 1). Desde SPR sigue el transcurso de tiempo completo de la interacción, pre-equilibrio constantes de velocidad cinética se derivan, además de equilibrio afinidades. Como se detalla a continuación, el comportamiento de pre-equilibrio de un sistema dado tiene mucha información, y proporciona una perspectiva muy diferente de equilibrio solo. Una vez que el sistema se calibra, los experimentos son muy rápidos y requieren sólo pequeñas cantidades de material de proteína (microgramos a nanogramos cantidades). Recogida de la información cinética completa de un sistema dado se puede lograr en día. La alta sensibilidad del SPR proporciona mediciones que no son posibles de utilizar cualquier otra técnica 6. Sin embargo, esta alta sensibilidad es un &quot;arma de doble filo&quot;, ya que puede ser una fuente importante de datos falsos positivos. Cualquier factor que afecta el índice de reflexión se registra y se representa en el Sensograma. Como tal, apcontroles apro- deben utilizarse para eliminar los falsos positivos, y el apoyo de enfoques complementarios, es muy recomendable. La Figura 1 ilustra la progresión de un experimento SPR usando un chip sensor recubierto-NTA. El Sensograma en el panel A muestra la inyección de los iones de níquel más de la matriz de NTA (datos sin sustraer), y los paneles BD mostrar los datos después de restar la señal derivada de la célula control negativo. Flechas rojas y azules muestran inicio de la inyección y final, respectivamente. La inmovilización del ligando en el chip altera gradualmente la masa hasta que se termine la inyección. La meseta estable observada después de la terminación de la inyección del ligando refleja la asociación estable del ligando a la superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una vez que se consigue una línea de base estable un tampón se inyecta sobre el ligando y la célula de referencia (Figura 1B, el ciclo 3) .Este inyección sirve como un &quot;blanco de control&quot;, y serásustraído durante el análisis. Tras la inyección, se registran cambios menores, lo que refleja un flujo de masa a través del chip. Luego, en un ciclo separado (Figura 1B, ciclo de 4), se inyecta el analito; el aumento gradual de RU representa la asociación de analito al ligando. Los sitios de unión ocupados se vuelven gradualmente hasta que se alcanza el equilibrio. Tan pronto como termina la inyección, la disminución de las EEFF refleja la disociación del complejo. De tales sensograms pre-equilibrio de equilibrio y constantes de velocidad se pueden derivar (ver más adelante). La Figura 1 representa una interacción transitoria entre el ligando y el analito. Cuando la interacción es más estable, el descenso en el nivel de RU es más lento, lo que refleja un menor k d. Aquí se describe un experimento SPR objetivo de caracterizar la interacción entre un transportador de membrana (detergente solubiliza) y su socio funcional, su sustrato cognado proteína de unión 6,7. El mod elegidosistema el es un casete de unión a ATP (ABC) transportador, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Este sistema fue seleccionada por sus resultados altamente reproducibles, alta relación señal-ruido, y clásico &#39;on / off&#39; tarifas. Además, los transportadores ABC homólogos están disponibles para servir como importantes controles negativos. El transportador, ModBC (ligando A) se extrae de la membrana utilizando detergente, purificada e inmovilizada en el chip. Su interacción socio soluble, Moda, es el analito. Como un ligando de control negativo, un RbsBC transportador ABC diferente se utiliza (&quot;ligando B&quot;).

<table><tbody><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td></td></tr><tr><td>Chip de sensor NTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>14100532</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 Software&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de níquel</td><td>Sigma</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>Tungstato de sodio dihidratado</td><td>Sigma</td><td>T2629</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio &nbsp;</td><td>Bio-Lab LTD.</td><td></td><td></td>19030591</tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etildiamino-tetraacético sal disódica dihidratada (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-Maltopyranoside (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Solución de dodecil sulfato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>GADOT</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Nylon (NY) Filtro de membrana</td><td>Sartorius</td><td>25007--47------N</td><td></td></tr><tr><td>ModBC Transportador ABC Laboratorio</td><td></td><td></td><td>Lewinson</td></tr><tr><td>RbsBC Transportador ABC Laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LewinsonProteína de unión al sustrato ModA Laboratorio</td><td></td><td></td> de <td>Lewinson</td></tr></tbody></table>

mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (spr)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Las interacciones proteína-proteína son fundamentales para la mayoría, si no todos, los procesos fisiológicos, y la comprensión de la naturaleza de tales interacciones es un paso central en la investigación biológica. La resonancia de plasmón de superficie (SPR) es una técnica de detección sensible para el estudio sin marcadores de interacciones biomoleculares en tiempo real. En un experimento SPR típico, un componente (generalmente una proteína, denominada "ligando") se inmoviliza en la superficie de un chip sensor, mientras que el otro (el "analito") está libre en solución y se inyecta sobre la superficie. La asociación y disociación del analito del ligando se miden y trazan en tiempo real en un gráfico llamado senograma, a partir del cual se derivan los datos de preequilibrio y equilibrio. Al estar libre de etiquetas, consumir bajas cantidades de material y proporcionar datos cinéticos de preequilibrio, a menudo hace que SPR sea el método de elección cuando se estudia la dinámica de las interacciones de las proteínas. Sin embargo, hay que tener en cuenta que, debido a la alta sensibilidad del método, los datos obtenidos deben analizarse cuidadosamente y respaldarse con otros métodos bioquímicos. 
SPR es particularmente adecuado para el estudio de proteínas de membrana, ya que consume pequeñas cantidades de material purificado y es compatible con lípidos y detergentes. Este protocolo describe un experimento SPR que caracteriza las propiedades cinéticas de la interacción entre una proteína de membrana (un transportador ABC) y una proteína soluble (la proteína de unión al sustrato afín del transportador).

En el sistema descrito en el presente documento, un chip de NiNTA se utiliza para inmovilizar el transportador de membrana Su-etiquetados 6,7. Al ser un homo-dímero, cada transportador está doblemente etiquetada, mejorando su unión al chip NiNTA. Después de la carga de níquel, ligando A (el transportador de interés) se inmoviliza sobre Fc = 2, hasta ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A etiqueta negro). Luego, utilizando el mismo flujo y la duración de la inyección, ligando B (el ligando...

Resonancia de plasmón superficial (SPR) es un método de etiqueta libre para la detección de interacciones biomoleculares en tiempo real. En esto, un protocolo para una proteína de membrana: la interacción experimento receptor se describe, mientras se discuten las ventajas y desventajas de la técnica.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar la interacción de un receptor de proteínas utilizando plasma de superficie y resonancia. Esto se logra mediante la inyección de los iones de níquel sobre la matriz de ácido nitro triacético o NT a. A continuación, una de las proteínas denominadas ligando se inmoviliza en el chip sensor después de una inyección en blanco.La segunda proteína, denominada analito, se inyecta sobre el ligando inmovilizado. Con el fin de detectar una interacción entre las dos proteínas, los resultados muestran que las dos proteínas interactúan transitoriamente con el analito asociado y se disocia del ligando. La afinidad de la interacción se puede calcular en función de las tasas de disociación y disociación medidas de las dos proteínas.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el pull down o la inmunoprecipitación, es que puede identificar interacciones transitorias o de baja afinidad que suelen tener grandes consecuencias biológicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica, como si la proteína de interés se une a otra proteína u otra molécula pequeña, se puede determinar la naturaleza de la interacción y se puede medir la afinidad. Para preparar la muestra, elimine todos los agregados de la proteína purificada como se describe en el protocolo de texto.Prepare el tampón de ejecución y filtre todos los tampones y muestras de proteínas utilizando filtros de coma cero de 22 micras. Asegúrese de antemano de que los filtros sean compatibles con las proteínas antes de conectar la botella tampón de funcionamiento a la entrada de la bomba. Mantenga a un lado 10 mililitros del tampón de funcionamiento en un tubo separado.A continuación, diluya las muestras con el búfer en ejecución para evitar discrepancias del búfer. Como regla general, para una desmovilización estable del ligando, utilice concentraciones bajas de ligandos con inyecciones más largas a bajo flujo en lugar de altas concentraciones de ligandos. Con inyecciones más cortas a alto flujo. Diluya el material de ligando concentrado en un tampón continuo hasta una concentración final de aproximadamente 20 microgramos por mililitro. Por último, diluya el analito en el tampón de funcionamiento hasta la concentración deseada.Para un sistema de afinidad desconocida, pruebe un rango de concentraciones de analito desde 10 micromolares hasta 10 ano molares en diluciones diez veces. En esta demostración, se reutiliza un chip acoplado a NTA adecuado para capturar proteínas con una etiqueta de olihistidina. Después de sacar la viruta almacenada del tampón, enjuague bien con agua destilada doble, seque suavemente y colóquela en su funda original.Para acoplar el chip al instrumento SPR, abra la puerta del chip del sensor y coloque el chip en su funda. Cierre la puerta y presione el chip de acoplamiento. Ajuste la temperatura de la celda del chip a 25 grados centígrados.Ajuste el compartimento de las muestras a siete grados centígrados para mantener la proteína estable durante todo el experimento. Después de preparar las soluciones para la carga y la extracción como se describe en el protocolo de texto, cebe el instrumento SPR con un búfer en ejecución. Para el siguiente paso, ajuste el flujo a 50 microlitros por minuto.Defina las rutas de flujo y la resta de referencia para obtener los resultados aquí descritos. Establezca las rutas a la celda de flujo número uno y la celda de flujo número dos y la celda de flujo número uno, restadas de la celda de flujo número dos, después de seleccionar el bastidor de muestras adecuado, guarde el archivo de resultados antes de comenzar el experimento para que los datos se guarden durante la ejecución. Cada experimento se compone de ciclos.Mantenga un registro claro de las inyecciones realizadas en cada ciclo y separe los ligandos que cargan la inyección en blanco del tampón y la inyección de analito en diferentes ciclos. El primer ciclo es la preparación de la viruta y la carga de níquel. Asegúrese de que el flujo y las rutas estén configurados y luego inyecte 350 milimolares de EDTA durante un minuto para lavar las moléculas restantes.A continuación, ajuste el flujo a 10 microlitros por minuto. A continuación, inyecte 0,5 milimolares de cloruro de níquel durante dos minutos. Ahora la resina de viruta está recubierta por iones de níquel.El segundo ciclo es la inmovilización del ligando. Establezca el flujo en 15 microlitros por minuto y establezca la ruta del flujo en celda de flujo. Número dos, inyecte el ligando A hasta alcanzar la unidad de respuesta o valores de R ru que sean de 10 a 20 veces el peso molecular del ligando.Por ejemplo, cargue un ligando de 50 kilodaltons a entre 501.000 rus. Mantener un registro del valor de RU alcanzado. A continuación, ajuste el caudal a 15 microlitros por minuto y la ruta del flujo a la celda de flujo número uno, inyecte el ligando de control B hasta el mismo valor de RU que el del ligando y controle la sustracción, sensori Graham en línea para ayudar a controlar la longitud de la inyección.A continuación, establezca el flujo en 50 microlitros por minuto y la ruta del flujo a la celda de flujo número uno y la celda de flujo. Número dos, proceda a lavar el sistema durante cinco a 20 minutos hasta que la línea de base se estabilice. El tercer ciclo es la inyección en blanco.Esta inyección servirá para la sustracción de la pieza en bruto. Por lo tanto, incluya todos los componentes que se inyectarán con el analito excepto el analito en sí. La duración de la inyección puede variar en función del tiempo que se tarde en alcanzar el equilibrio.Establezca el flujo en 15 microlitros por minuto y establezca la ruta del flujo en la celda de flujo número uno y la celda de flujo número dos, y la celda de flujo número uno, restados de la celda de flujo. Número dos, inserte el comando de peso durante 30 segundos para lograr una línea de base estable. A continuación, inyecte el búfer en ejecución durante 13 segundos.Espere de 120 a 600 segundos para registrar la fase de disociación. La longitud de este paso varía según el kd. Cuanto más lenta sea la disociación, más largo debe ser este paso.El cuarto ciclo es la inyección de analito. Copie y pegue las condiciones exactas utilizadas en el ciclo tres para que estas dos inyecciones se puedan restar posteriormente. Cambie la ubicación de la ranura en el bastidor de la que contiene la solución de control a una que contiene la solución de analito.Elija una concentración que esté ligeramente por encima de la constante de disociación de equilibrio esperada. Si no se dispone de conocimientos previos, elija un micromolar como buen punto de partida. Después de realizar la inyección de tampón y la inyección de analito por segunda vez, realice el ciclo siete de disparo de las virutas.Ajuste el flujo a 50 microlitros por minuto, luego inyecte 350 milimolares de EDTA durante un minuto. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de tres minutos, ya que esto puede dañar el chip.A continuación, inyecte sulfato dcal de sodio al 0,25% durante un minuto. Repita este paso dos veces. No utilice una sola inyección de tres minutos, ya que esto puede dañar el chip después de la carga de níquel, el transportador de interés se inmoviliza en la celda de flujo número dos hasta 3, 500 R rus.Luego, usando el mismo flujo y duración de inyección, el ligando de control se inyecta en la celda de flujo número uno, alcanzando inicialmente solo hasta 3000 R para asegurarse de que se inmovilicen cantidades similares de proteína en ambas celdas de flujo. El ligando de control se carga aún más con una inyección más corta mientras monitorea la carga hasta 3.500 RDU. La forma de escalera representa el aumento gradual de la masa en la celda de flujo número uno en cada inyección que se muestra aquí es la celda de flujo número uno, restada de la celda de flujo.En segundo lugar, es importante variar la duración de la inyección de ligandos para lograr una carga igual. Por el contrario, la duración de la inyección de analito debe mantenerse constante para todas las concentraciones utilizadas para obtener datos cuantitativos. Se inyecta un rango de concentraciones de analito.Aquí se muestran inyecciones de diferentes concentraciones de analito con una longitud de inyección constante. Las diferentes concentraciones de analito se inyectan en orden aleatorio y los sensores dobles en blanco se alinean con el eje x antes del análisis para derivar la afinidad y la constante de velocidad. Se aplica un ajuste de modelo.La constante de disociación de equilibrio calculada para la interacción mod BCA es aproximadamente tres veces 10 elevado a menos seis molares con un KA moderadamente rápido y un KD rápido una vez dominado. Esta técnica se puede realizar a las pocas horas de ver este video. Debes tener una buena comprensión de cómo diseñar y realizar un experimento de SPR utilizando la proteína de tu interés.

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