Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)
29 de noviembre de 2014
Resonancia de plasmón superficial (SPR) es un método de etiqueta libre para la detección de interacciones biomoleculares en tiempo real. En esto, un protocolo para una proteína de membrana: la interacción experimento receptor se describe, mientras se discuten las ventajas y desventajas de la técnica.
El objetivo general del siguiente experimento es demostrar la interacción de un receptor de proteínas utilizando plasma de superficie y resonancia. Esto se logra mediante la inyección de los iones de níquel sobre la matriz de ácido nitro triacético o NT a. A continuación, una de las proteínas denominadas ligando se inmoviliza en el chip sensor después de una inyección en blanco.
La segunda proteína, denominada analito, se inyecta sobre el ligando inmovilizado. Con el fin de detectar una interacción entre las dos proteínas, los resultados muestran que las dos proteínas interactúan transitoriamente con el analito asociado y se disocia del ligando. La afinidad de la interacción se puede calcular en función de las tasas de disociación y disociación medidas de las dos proteínas.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el pull down o la inmunoprecipitación, es que puede identificar interacciones transitorias o de baja afinidad que suelen tener grandes consecuencias biológicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica, como si la proteína de interés se une a otra proteína u otra molécula pequeña, se puede determinar la naturaleza de la interacción y se puede medir la afinidad. Para preparar la muestra, elimine todos los agregados de la proteína purificada como se describe en el protocolo de texto.
Prepare el tampón de ejecución y filtre todos los tampones y muestras de proteínas utilizando filtros de coma cero de 22 micras. Asegúrese de antemano de que los filtros sean compatibles con las proteínas antes de conectar la botella tampón de funcionamiento a la entrada de la bomba. Mantenga a un lado 10 mililitros del tampón de funcionamiento en un tubo separado.
A continuación, diluya las muestras con el búfer en ejecución para evitar discrepancias del búfer. Como regla general, para una desmovilización estable del ligando, utilice concentraciones bajas de ligandos con inyecciones más largas a bajo flujo en lugar de altas concentraciones de ligandos. Con inyecciones más cortas a alto flujo. Diluya el material de ligando concentrado en un tampón continuo hasta una concentración final de aproximadamente 20 microgramos por mililitro. Por último, diluya el analito en el tampón de funcionamiento hasta la concentración deseada.
Para un sistema de afinidad desconocida, pruebe un rango de concentraciones de analito desde 10 micromolares hasta 10 ano molares en diluciones diez veces. En esta demostración, se reutiliza un chip acoplado a NTA adecuado para capturar proteínas con una etiqueta de olihistidina. Después de sacar la viruta almacenada del tampón, enjuague bien con agua destilada doble, seque suavemente y colóquela en su funda original.
Para acoplar el chip al instrumento SPR, abra la puerta del chip del sensor y coloque el chip en su funda. Cierre la puerta y presione el chip de acoplamiento. Ajuste la temperatura de la celda del chip a 25 grados centígrados.
Ajuste el compartimento de las muestras a siete grados centígrados para mantener la proteína estable durante todo el experimento. Después de preparar las soluciones para la carga y la extracción como se describe en el protocolo de texto, cebe el instrumento SPR con un búfer en ejecución. Para el siguiente paso, ajuste el flujo a 50 microlitros por minuto.
Defina las rutas de flujo y la resta de referencia para obtener los resultados aquí descritos. Establezca las rutas a la celda de flujo número uno y la celda de flujo número dos y la celda de flujo número uno, restadas de la celda de flujo número dos, después de seleccionar el bastidor de muestras adecuado, guarde el archivo de resultados antes de comenzar el experimento para que los datos se guarden durante la ejecución. Cada experimento se compone de ciclos.
Mantenga un registro claro de las inyecciones realizadas en cada ciclo y separe los ligandos que cargan la inyección en blanco del tampón y la inyección de analito en diferentes ciclos. El primer ciclo es la preparación de la viruta y la carga de níquel. Asegúrese de que el flujo y las rutas estén configurados y luego inyecte 350 milimolares de EDTA durante un minuto para lavar las moléculas restantes.
A continuación, ajuste el flujo a 10 microlitros por minuto. A continuación, inyecte 0,5 milimolares de cloruro de níquel durante dos minutos. Ahora la resina de viruta está recubierta por iones de níquel.
El segundo ciclo es la inmovilización del ligando. Establezca el flujo en 15 microlitros por minuto y establezca la ruta del flujo en celda de flujo. Número dos, inyecte el ligando A hasta alcanzar la unidad de respuesta o valores de R ru que sean de 10 a 20 veces el peso molecular del ligando.
Por ejemplo, cargue un ligando de 50 kilodaltons a entre 501.000 rus. Mantener un registro del valor de RU alcanzado. A continuación, ajuste el caudal a 15 microlitros por minuto y la ruta del flujo a la celda de flujo número uno, inyecte el ligando de control B hasta el mismo valor de RU que el del ligando y controle la sustracción, sensori Graham en línea para ayudar a controlar la longitud de la inyección.
A continuación, establezca el flujo en 50 microlitros por minuto y la ruta del flujo a la celda de flujo número uno y la celda de flujo. Número dos, proceda a lavar el sistema durante cinco a 20 minutos hasta que la línea de base se estabilice. El tercer ciclo es la inyección en blanco.
Esta inyección servirá para la sustracción de la pieza en bruto. Por lo tanto, incluya todos los componentes que se inyectarán con el analito excepto el analito en sí. La duración de la inyección puede variar en función del tiempo que se tarde en alcanzar el equilibrio.
Establezca el flujo en 15 microlitros por minuto y establezca la ruta del flujo en la celda de flujo número uno y la celda de flujo número dos, y la celda de flujo número uno, restados de la celda de flujo. Número dos, inserte el comando de peso durante 30 segundos para lograr una línea de base estable. A continuación, inyecte el búfer en ejecución durante 13 segundos.
Espere de 120 a 600 segundos para registrar la fase de disociación. La longitud de este paso varía según el kd. Cuanto más lenta sea la disociación, más largo debe ser este paso.
El cuarto ciclo es la inyección de analito. Copie y pegue las condiciones exactas utilizadas en el ciclo tres para que estas dos inyecciones se puedan restar posteriormente. Cambie la ubicación de la ranura en el bastidor de la que contiene la solución de control a una que contiene la solución de analito.
Elija una concentración que esté ligeramente por encima de la constante de disociación de equilibrio esperada. Si no se dispone de conocimientos previos, elija un micromolar como buen punto de partida. Después de realizar la inyección de tampón y la inyección de analito por segunda vez, realice el ciclo siete de disparo de las virutas.
Ajuste el flujo a 50 microlitros por minuto, luego inyecte 350 milimolares de EDTA durante un minuto. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de tres minutos, ya que esto puede dañar el chip.
A continuación, inyecte sulfato dcal de sodio al 0,25% durante un minuto. Repita este paso dos veces. No utilice una sola inyección de tres minutos, ya que esto puede dañar el chip después de la carga de níquel, el transportador de interés se inmoviliza en la celda de flujo número dos hasta 3, 500 R rus.
Luego, usando el mismo flujo y duración de inyección, el ligando de control se inyecta en la celda de flujo número uno, alcanzando inicialmente solo hasta 3000 R para asegurarse de que se inmovilicen cantidades similares de proteína en ambas celdas de flujo. El ligando de control se carga aún más con una inyección más corta mientras monitorea la carga hasta 3.500 RDU. La forma de escalera representa el aumento gradual de la masa en la celda de flujo número uno en cada inyección que se muestra aquí es la celda de flujo número uno, restada de la celda de flujo.
En segundo lugar, es importante variar la duración de la inyección de ligandos para lograr una carga igual. Por el contrario, la duración de la inyección de analito debe mantenerse constante para todas las concentraciones utilizadas para obtener datos cuantitativos. Se inyecta un rango de concentraciones de analito.
Aquí se muestran inyecciones de diferentes concentraciones de analito con una longitud de inyección constante. Las diferentes concentraciones de analito se inyectan en orden aleatorio y los sensores dobles en blanco se alinean con el eje x antes del análisis para derivar la afinidad y la constante de velocidad. Se aplica un ajuste de modelo.
La constante de disociación de equilibrio calculada para la interacción mod BCA es aproximadamente tres veces 10 elevado a menos seis molares con un KA moderadamente rápido y un KD rápido una vez dominado. Esta técnica se puede realizar a las pocas horas de ver este video. Debes tener una buena comprensión de cómo diseñar y realizar un experimento de SPR utilizando la proteína de tu interés.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para detectar interacciones entre receptores proteicos utilizando resonancia de plasmones de superficie (SPR), un método sin marcado. El experimento demuestra la interacción entre un ligando y un analito en tiempo real.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Interacciones biomoleculares
- Resonancia de plasmones de superficie
- Química de proteínas
Antecedentes
- La resonancia de plasmones superficiales (SPR) es una técnica para la detección en tiempo real.
- Permite observar interacciones biomoleculares sin etiquetas.
- El método puede proporcionar información sobre las afinidades de unión.
- Comprender las interacciones proteicas es fundamental para diversas aplicaciones biológicas.
Objetivo del estudio
- Demostrar una interacción entre proteínas receptoras mediante SPR.
- Ilustrar el proceso de interacción entre ligando y analito.
- Calcular la afinidad basándose en las tasas de interacción.
Métodos Utilizados
- Inyección de iones de níquel sobre una matriz NT.
- Inmovilización del ligando en un chip sensor.
- Inyección del analito sobre el ligando inmovilizado.
- Medición de las tasas de asociación y disociación.
Resultados principales
- El analito se asocia y disocia del ligando.
- Se observaron interacciones transitorias entre las dos proteínas.
- Los cálculos de afinidad se basaron en tasas medidas.
- Los resultados demuestran la eficacia de la SPR para estudiar interacciones proteicas.
Conclusiones
- La SPR es una herramienta valiosa para el análisis en tiempo real de interacciones biomoleculares.
- La técnica proporciona información sobre la dinámica de unión de proteínas.
- Comprender estas interacciones puede orientar investigaciones biológicas posteriores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La resonancia de plasmones de superficie (SPR) permite la cuantificación en tiempo real y sin marcado de las interacciones entre proteínas de membrana y receptores, proporcionando datos cinéticos y de afinidad fundamentales para la descubrimiento temprano de fármacos. Su sensibilidad a interacciones transitorias y de baja afinidad apoya la desvinculación mecanicista y la validación de objetivos, afectando directamente la clasificación de carteras y la confianza predictiva. La compatibilidad de SPR con proteínas de membrana y sus bajos requisitos de material la convierten en un activo estratégico para las líneas de desarrollo e investigación farmacéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de las interacciones proteína-proteína y proteína-ligando fundamentales para la validación de dianas.
- Apoya la desestimación mecanicista al distinguir eventos de unión transitorios de los estables.
- Proporciona parámetros cinéticos (ka, kd) y afinidad (KD) para orientar la selección y priorización de dianas.
- Facilita la comprobación rápida de hipótesis sobre la relevancia funcional de las proteínas de membrana.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona salidas de sensogramas validadas y reproducibles para el desarrollo de ensayos posteriores.
- Facilita la estandarización de protocolos de inmovilización de ligandos y de inyección de analitos.
- Permite la comparación cuantitativa de múltiples concentraciones de analitos para evaluar su idoneidad en cribados.
- Reduce el consumo de material, permitiendo un uso eficiente de proteínas de membrana purificadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona datos cinéticos y de afinidad con objetivos de proteínas de membrana relevantes para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al apoyar estudios de biomarcadores y participación del objetivo.
- Reduce los riesgos en las decisiones de avance al aclarar los mecanismos de unión y las intensidades de interacción.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
SPR se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano y la identificación de compuestos iniciales, proporcionando datos críticos de cinética y afinidad para objetivos de proteínas de membrana antes de la selección del modelo preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba basada en hipótesis de interacciones proteína:receptor y el mapeo de vías.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles de sensogramas para la estandarización de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece tasas de asociación/disociación en tiempo real y constantes de equilibrio para comparaciones estadísticas robustas.
- Investigación Traducional: Permite correlacionar datos de unión in vitro con la interacción del blanco in vivo cuando se respalda con estudios adicionales.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para diversos estudios de interacciones proteicas en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo, mejora la reproducibilidad y minimiza los requisitos de material.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos cinéticos accionables.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de objetivos de proteínas de membrana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en purificación de proteínas, inmovilización y manejo del instrumento de SPR.
- Exige acceso a instrumentación SPR y chips sensor compatibles para proteínas de membrana.
- Necesita una preparación rigurosa de tampones y una estandarización entre equipos para obtener resultados reproducibles.
- Puede requerirse adaptación para diferentes etiquetas proteicas, detergentes o entornos lipídicos.
- La alta sensibilidad exige un análisis cuidadoso de los datos y una validación ortogonal para evitar artefactos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
Protein Sample and Buffer Preparation
2:38
Sensor Chip and SPR Instrument Setup
3:58
Experiment Cycles
7:32
Results: On Line Monitoring of Ligand Immobilization and Determination of Kinetic Rate Constants by Injections of Multiple Analyte Concentrations
9:07
Conclusion
