Síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas

El objetivo general de este procedimiento es la síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión de proteínas en las células. Esto se logra amplificando primero el inserto de plásmido o la secuencia de ADN codificante y agregando una cola de poli T de 120 timidina mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El segundo paso es la transcripción in vitro del ADN generado a ARNm con colas de poliadenina.

A continuación, se elimina el ADN molde mediante el tratamiento D'S de la mezcla de reacción de transcripción in vitro. El paso final es el tratamiento con fosfatasa antártica del ARNm producido para eliminar los cinco fosfatos principales. En última instancia, las células son transfectadas por el ARNm generado, los complejos lipídicos.

La microscopía fluorescente y el análisis de citometría de flujo se utilizan para mostrar la síntesis de GFP mejorada en las células. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el transfect viral, es la falta de integración en el genoma de la célula huésped, lo que evita el riesgo de oncogénesis. Este método puede ayudar a producir proteínas faltantes o defectuosas en las células, y se puede utilizar para la vacunación, el tratamiento de trastornos genéticos.

Y en el campo de la medicina regenerativa, la demostración del procedimiento estará a cargo de Steinle, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Antes del inicio de este procedimiento, los plásmidos que contenían las secuencias de ADN codificante requeridas o CDS se amplificaron en E. coli y se aislaron como se describe en el texto del protocolo. En este ejemplo, el CDS de interés es la proteína fluorescente verde mejorada o EGFP para amplificar y agregar simultáneamente un detalle poligonal al CDS de EGFP.

Prepare una mezcla de PCR como se detalla en el texto del protocolo. Coloque el tubo de PCR en un termociclador y ejecute el protocolo de ciclo de PCR que se describe en el texto del protocolo. Una vez finalizada la reacción de PCR, limpie la reacción de PCR utilizando un kit de purificación de PCR disponible en el mercado y diluya el ADN con 20 microlitros de agua libre de nucleasa.

Para comprobar la calidad del producto de PCR, realice una electroforesis en gel de ADN y visualice las bandas de ADN en un sistema de imágenes. Se debe detectar una banda de ADN clara con una longitud de aproximadamente 1.100 pares de bases durante la transcripción in vitro o IVT. El ADN generado anteriormente se transcribirá a ARNm.

Prepare la mezcla analógica de la tapa NTP como se muestra aquí. Mezcle bien la mezcla analógica de la tapa NTP mediante vórtice. Luego gírelo hacia abajo Arme brevemente la mezcla de reacción IVT como se describe en esta tabla.

Mezcle bien la mezcla de reacción IVT pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifuga brevemente el tubo de PCR para recoger la mezcla en el fondo del tubo. Incubar la mezcla de reacción IVT a 37 grados centígrados durante tres horas en un termomezclador.

Después de tres horas, retire el ADN molde agregando un microlitro de ADN a la mezcla de reacción IVT. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Purifique la mezcla de reacción utilizando un kit de purificación de ARN y diluya el MR NA modificado de la membrana de la columna de centrifugación dos veces con 40 microlitros de agua libre de nucleasas, el ARNm modificado generado por IVT debe tratarse con fosfatasa para eliminar cinco trifosfatos principales, lo que puede conducir a la activación inmune.

Para comenzar este procedimiento, agregue nueve microlitros de 10 tampones de reacción de fosfatasa antártica a 79 microlitros de una solución de ARNm purificada. Posteriormente, añadir dos microlitros de fosfatasa antártica y mezclar suavemente la muestra. Incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, purifique la mezcla de reacción con un kit de purificación de ARN y diluya el ARNm modificado de la membrana de la columna de centrifugación dos veces con 50 microlitros de agua libre de nucleasas. Después de medir la concentración del ARNm modificado, ajuste la concentración a 100 nanogramos por microlitro agregando agua libre de nucleasa. Compruebe la calidad del ARNm modificado sintetizado mediante electroforesis en gel de ARN y visualice las prohibiciones de escalera y ARNm en un iluminador trans UV.

Se debe detectar una banda clara de ARNm con una longitud de aproximadamente 1.100 pares de bases. Prepare las células HEC 2 9 3 para la transfección con el ARNm modificado sintetizado mediante siembra dos veces. Centre las cinco celdas por pocillo de una placa de 12 pocillos e incube las celdas durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de celdas Al día siguiente, la celda debería haber alcanzado un 80 a 90% de confluencia.

Genere el lipoplexo para la transfección. Prepare suficiente mezcla de transfección para que todos los pocillos se transfecten, cada pocillo de una placa de 12 pocillos requiere 2,5 microgramos de ARNm modificado, dos microlitros de reactivo de transfección de lípidos y 473 microlitros de opt uno. Reducir el medio sérico.

Mezcle los componentes suavemente pipeteando como control negativo. Prepare una mezcla de transfección sin Mr.NA, incube las mezclas de transfección a temperatura ambiente durante 20 minutos para generar lipoplex. Para la transfección.

Lave las células con 500 microlitros de DPBS por día. Agregue 500 microlitros de mezcla de transfección a cada pocillo de la placa de 12 pocillos, incube las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono después de cuatro horas, aspire la mezcla de transfección y agregue un mililitro de cultivo celular completo. Medio a las celdas de cada pocillo.

Incubar las células durante 24 horas en la incubadora de células. Posteriormente, realice un análisis microscópico de fluorescencia de las células utilizando un microscopio de fluorescencia para preparar las células para la citometría de flujo. Retire el medio de cultivo celular de los pocillos y lave cada pocillo con uno de los DPBS sin calcio ni magnesio.

Añadir 500 microlitros de TRIPSINA EDTA por pocillo para separar las células de la superficie de las placas de cultivo celular. Posteriormente, agregue 500 microlitros de solución neutralizante de tripsina por pocillo para inactivar la centrífuga de prueba de las celdas separadas durante cinco minutos a 300 veces G de temperatura ambiente. Después de retirar el Reese supinado, suspenda el paladar celular en 150 microlitros de solución de fijación celular y transfiera la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo.

Analice el porcentaje de células que expresan EGFP y la intensidad de fluorescencia utilizando la media geométrica de la intensidad de fluorescencia. La expresión de proteínas a lo largo del tiempo también se evalúa mediante análisis de citometría de flujo de las células que expresan EGFP a uno, dos y tres días después de la transfección, como se describe en el texto del protocolo, la funcionalidad del ARNm de EGFP generado se probó mediante la transfección de células HEC 2 9 3. La producción de EGFP en las células se detectó 24 horas después de la transfección mediante microscopía de fluorescencia.

Aquí, se muestra una imagen de contraste facial de las células junto a una imagen de fluorescencia de las células. La expresión de EGFP en las células también se detectó mediante citometría de flujo 24 horas después de la transfección. La línea rosa representa las células sin ARNm, transfección, y la línea azul representa las células EGFP positivas.

Después de la transfección del ARNm de EGFP, el 93,91% de todas las células medidas fueron positivas y la media geométrica de la intensidad de fluorescencia fue de 720,16. La duración de la expresión de la proteína en las células HC 2 93 se evaluó midiendo la expresión de EGFP uno, dos y tres días después del ARNm. La expresión de la proteína de transfección fue más alta en las células 24 horas después de la transfección.

La cantidad se redujo 1,6 veces cada día siguiente, pero incluso después de tres días, las células contenían EGFP una vez dominadas. Esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir ARNm modificado estabilizado para la inducción de la expresión de proteínas deseada en las células.