Name: Síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a sintetizar ARNm modificado in vitro para inducir la expresión proteica en células humanas mediante transcripción in vitro y transfección lipídica. Este protocolo evita la integración genómica y facilita aplicaciones en terapia génica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este proyecto fue financiado por el Fondo Social Europeo, en Baden-Württemberg, Alemania.

1. Aumento de plásmidos que contienen ADN que codifica secuencias Obligatorio (CDS) <ol><li> Pre-caliente medio SOC, que se incluye en el kit de transformación, a temperatura ambiente y las placas de agar LB que contenían 100 mg / ml de ampicilina a 37 ° C. Equilibrar el baño de agua a 42 ° C. </li><li> Descongelar un vial de E. químicamente componente coli en hielo. </li><li> Añadir 1-5 l del plásmido (10 pg a 100 ng) que contiene los CDS en el vial de E. componente químicamente coli y mezclar suavemente. No mezcle las células por pipeteo. Después de la adición de los plásmidos, mezclar tocando el tubo suavemente. </li><li> Incubar la mezcla en hielo durante 30 min. </li><li> Heat-shock del E. coli durante 30 segundos a 42 ° C en un baño de agua sin agitación. </li><li> Colocar el vial en hielo durante 2 min. </li><li> Añadir 250 l de medio SOC precalentado a la E. coli y agitar las bacterias horizontalmente a 300 rpm durante 1 hora a 37 ° C en una incubadora de bacterias. </li><li><html> Extender 100 l y 150 l de mezcla de transformación sobre placas de agar LB pre-calentado, invertir las placas e incubar durante la noche a 37 ° C. </li><li> Después de colonias se hacen visibles, inocular una única colonia de cada placa en un tubo de cultivo de 15 ml que contiene 5 ml de medio LB con 100 mg / ml de ampicilina. Incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 300 rpm hasta que la cultura es en el registro tarde o fase estacionaria. </li><li> Para el almacenamiento a largo plazo de transformado E. coli, pipeta de 75 l de 100% de glicerol en el criovial. Añadir 225 l de cultivo bacteriano (madre congelada contendrá 25% de glicerol), mezclar bien y guardar el criovial a -80 ° C. </li><li> Aislar los plásmidos que contienen los CDS requeridos usando un kit de purificación de plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Determinar la concentración de plásmido usando un espectrofotómetro. </li><li> Preparar alícuotas de 20 l y almacenarlas a -20 ° C durante un tiempo prolongado. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. La amplificación del plásmido inserciones y adición de poli T-cola por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) <ol><li> NOTA: Para obtener el molde de ADN para la transcripción in vitro (IVT), los CDS de interés, aquí eGFP, se amplifica mediante PCR. Simultáneamente, se añade una poli-T de la cola de 120 thymidines (T) a la inserción mediante el uso de un cebador inverso con una T 120 de extensión. De este modo, los ARNm generados obtener un poli A-cola con una longitud definida después de la IVT. </li><li> Preparar la mezcla de PCR como se detalla en la Tabla 1. </li><li> Mezclar la mezcla de reacción a fondo. NOTA: producto de PCR se puede utilizar en reacciones 4-5 IVT. Para aumentar la cantidad de plantilla de ADN para la IVT, el volumen total de la mezcla de PCR puede ser aumentada. Varios tubos de PCR que contienen cada uno 100 l mezcla de PCR se pueden utilizar para obtener un rendimiento suficiente de producto de PCR. </li><li> Colocar los tubos de PCR en un termociclador y ejecute la PCR utilizando el protocolo de ciclos de PCR (Tabla 2). </li><li> Limpiar el PCR reacción usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluir el ADN usando 20 agua libre de nucleasa l. </li><li> Medir la concentración del ADN usando un espectrofotómetro. NOTA: La concentración de ADN detectado es de aproximadamente 300 mg / ml. Por lo tanto, la cantidad total de la esperada debe ser ~ 6 mg. La cantidad de ADN para otras proteínas puede diferir dependiendo de la longitud de CDS, la cantidad de plásmido utilizado para la PCR, la temperatura de hibridación de los cebadores, y el número de ciclo. </li><li> Congelar el ADN a -20 ° C durante un período prolongado o utilizarlo directamente para IVT. </li></ol> Paso 3. Control: Calidad del producto de PCR <ol><li> Compruebe la calidad del producto de PCR mediante electroforesis en gel de ADN. </li><li> Mezclar la cantidad deseada de agarosa con TBE 1x en un matraz. Para un gel de agarosa al 1%, añadir 0,5 g de agarosa a 50 ml de TBE 1x. </li><li> Se disuelve de microondas hasta que la agarosa. No deje que hierva. Asegúrese de que la agarosa es completamente en solución. </li><li> Añadir 5 l nucleico mancha de gel de ácido a 50 ml de gel de agarosa. </li><li> Vierte el gel en un gel de agarosa al cuadro, establezca el peine, y esperar aproximadamente 1 hora hasta que el gel se solidificó. </li><li> Retire el peine y colocar el cuadro de gel en una bandeja de gel. </li><li> Mezcle 2 l (200 ng) de 80-10,000 pb de ADN Global y 200 ng de producto de PCR, cada uno con 2 l de tampón de carga 6x en un volumen total de 12 l. </li><li> Cargar cuidadosamente muestras de ADN en los pocillos del gel de agarosa. </li><li> Uso de 1x TBE como tampón, ejecute el gel de agarosa a 100 V durante 1 hr. </li><li> Visualice las bandas de ADN en un sistema de imagen (Figura 2). </li></ol> 4. Transcripción in vitro (IVT) <ol><li> NOTA: Después de la PCR, los insertos de plásmidos se amplifican y se añade un poli T-cola. Durante la IVT, la información genética se transcribe a partir de ADN a ARN. El transcrito de ARNm generado se utiliza para producir proteínas en las células. </li><li> Limpie la zona de trabajo y pipetas con una RNasa dsolución econtamination. El uso de PCR puntas de pipeta de doble filtro limpio y estéril y con frecuencia cambian los guantes para minimizar la contaminación de reacción se mezcla con RNasas. </li><li> Preparar la mezcla analógica NTP / tapa como se describe en la Tabla 3. </li><li> Mezclar la mezcla analógica NTP / tapa a fondo por agitación y centrifugar brevemente. </li><li> Montar la mezcla de reacción IVT como se describe en la Tabla 4. </li><li> Mezclar la mezcla de reacción IVT fondo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifugar el tubo de PCR brevemente para recoger la mezcla en la parte inferior del tubo. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 3 horas en un termomezclador. NOTA: El tiempo óptimo de incubación depende de la longitud de los insertos y la eficiencia transcripcional de plantilla dada. Para insertos cortos (&lt;500 nt), un tiempo de incubación más largo puede ser ventajoso. Un experimento de curso temporal se puede hacer para determinar el tiempo de incubación óptimo para el rendimiento máximo. Por lo tanto, establecer reacciones IVT, para example, para 1, 2, 3, 4, 6 hr, y la incubación durante la noche y determinar la cantidad de ARNm. La cinética de la transcripción in vitro para la generación de eGFP ARNm se muestran en la Figura 3. </li><li> Para retirar la plantilla de ADN, añadir 1 l de DNasa (2 U / l) a la mezcla de reacción IVT, mezclar bien e incubar 15 min a 37 ° C. </li><li> Se purifica la mezcla de reacción usando un kit de purificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir el ARNm modificado a partir de la membrana de la columna de centrifugado dos veces con 40 agua libre de nucleasa l. NOTA: La concentración de ARN detectado es de aproximadamente 1.500 g / ml. Por lo tanto, la cantidad total de la esperada debe ser ~ 120 g. La cantidad de mRNA sintetizado para otras proteínas puede diferir dependiendo de la longitud de CDS y la cantidad de producto de PCR utilizado para IVT. </li></ol> 5. Tratamiento de ARNm purificado con Antártico fosfatasa <ol><li> NOTA: El ARNm generado se trató con fosfatasa para eliminar 5 &#39;trifosfatos, que pueden ser reconocidos por RIG-I y conducen a la activación inmune. Además, el tratamiento con fosfatasa previene la re-circularización en una reacción de auto-ligación. </li><li> Añadir 9 l de 10x tampón de reacción de la fosfatasa antártica a 79 l de solución de ARNm purificado. Posteriormente, añadir 2 l de fosfatasa Antártico (5 U / l) y mezclar suavemente la muestra. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Se purifica la mezcla de reacción usando un kit de purificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir el ARNm modificado a partir de la membrana de la columna de centrifugación dos veces con 50 agua libre de nucleasa l. </li><li> Medir la concentración de los ARNm modificados utilizando un espectrofotómetro. Compruebe que la relación de absorbancia a 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) es ≥ 1,8 y la relación de A 260 / A 230 es de 2,0, lo que indica la pureza. NOTA: El rendimiento total esperado debería ser de aproximadamente 90 mg, que es sufficient durante aproximadamente 36 transfecciones de mRNA. </li><li> Ajustar la concentración de ARNm a 100 ng / l mediante la adición de agua libre de nucleasa. </li><li> Alícuota del ARNm modificado en un solo uso alícuotas necesarias para transfecciones y almacenar a -80 ° C. Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación. Adecuadamente preparado y almacenado ARNm es estable durante muchos años. Durante trabajar, mantener siempre el ARNm modificado en hielo. </li></ol> Paso 6. Control: Calidad de mRNA sintetizado Modificado <ol><li> Compruebe la calidad de ARNm modificado por electroforesis en gel de ARN. </li><li> Mezclar la cantidad deseada de agarosa con TBE 1x en un matraz. Para un gel de agarosa al 1%, añadir 0,5 g de agarosa a 50 ml de TBE 1x. </li><li> Se disuelve de microondas hasta que la agarosa. No deje que hierva. Asegúrese de que la agarosa es completamente en solución. </li><li> Añadir 5 l nucleico mancha de gel de ácido a 50 ml de gel de agarosa. </li><li> Vierte el gel en una caja de gel de agarosa, establezca el peine, y esperar aproximadamente 1 hora hasta que el gel es solidified. </li><li> Retire el peine y colocar el cuadro de gel en una bandeja de gel. </li><li> Mezclar 3 l (3 g) de 0,5-10 kb ARN Escalera y 200 ng de mRNA sintetizado modificado cada uno con 7 l de tampón de carga en un volumen total de 10 l. La composición del tampón de carga se describe en la Tabla 5. </li><li> Desnaturalizar la escalera y las muestras de ARNm a 70 ° C durante 10 min. </li><li> Coloque con cuidado la escalera y las muestras de ARNm en el gel de agarosa al 1%. </li><li> Realice la electroforesis a 100 V durante 1 hora usando 1x TBE como tampón de ejecución. </li><li> Visualice la escalera y bandas de ARNm en un transiluminador UV y una fotografía usando un sistema de documentación de geles (Figura 4). </li></ol> 7. Preparación de las células para la transfección <ol><li> Plate 2 x 10 5 células (células HEK293) por pocillo de placa de 12 pocillos. </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un incubador de células. NOTA: En el día de la transfección, las células deben tener reacHed 80-90% de confluencia. </li></ol> 8. Realización de mRNA transfección de células <ol><li> Descongelar el ARNm modificado. </li><li> Generar los lipoplexes para la transfección. </li><li> Añadir 25 l (2,5 mg) de ARNm modificado y 2 l de reactivo de transfección lípido catiónico a 473 l Opti-MEM (Medio Esencial Mínimo) reduje medio de suero para generar la mezcla de transfección para la transfección de un pocillo de una placa de 12 pocillos. Aumentar la escala de los volúmenes de acuerdo con el número de pozos a ser transfectadas. Como control negativo, se prepara una mezcla de transfección sin ARNm. </li><li> Mezcle los componentes suavemente con la pipeta. Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 20 min para generar lipoplexes para la transfección. NOTA: La mezcla de transfección no contiene antibióticos. Por lo tanto, tenga cuidado para asegurar la esterilidad durante la manipulación de las células. </li><li> Lavar las células con 500 l DPBS / pocillo. </li><li> Añadir 500 l mezcla de transfección a un pocillo de una PLA de 12 pocilloste. </li><li> Se incuban las células durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Aspirar la mezcla de transfección y añadir 1 ml de medio de cultivo celular completa a las células. </li><li> Se incuban las células durante 24 horas en la incubadora de células. </li><li> Realizar microscópico de fluorescencia analiza utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 5). NOTA: Para examinar la expresión de otras proteínas en las células, que se producen por transfección con otra mRNA de eGFP ARNm que codifica, las células pueden ser cultivadas en cubreobjetos. A continuación, la transfección puede llevarse a cabo y las células se puede teñir con anticuerpos apropiados y se analizó por microscopía de fluorescencia. </li></ol> 9. Análisis de citometría de flujo de EGFP expresión en células <ol><li> Retire medio de cultivo celular de los pocillos y lavar cada pocillo con DPBS 1 ml (sin calcio y magnesio). Añadir 500 l de tripsina / EDTA por pocillo para separar las células de la superficie de placas de cultivo celular. Posteriormente, añadir 500TNS l por pocillo para inactivar la tripsina. </li><li> Centrifugar las células desprendidas durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante dejando sólo el pellet. Resuspender el sedimento celular en 150 l solución de fijación de células y transferir la suspensión de células en un tubo de citometría de flujo. </li><li> Analizar el porcentaje de células que expresan eGFP y la intensidad de fluorescencia usando Geo media (media geométrica de intensidad de fluorescencia) (Figura 6). </li></ol> 10. La medición de la expresión de la proteína a través del tiempo <ol><li> Realizar mRNA transfección de células en 3 pocillos de una placa de 12 pocillos como se describe en el paso 8. Además, incubar 3 pocillos de células HEK293 con la mezcla de transfección sin la adición de mRNA. </li><li> Medir la expresión de eGFP 1, 2, y 3 días después de la transfección para evaluar la duración de la expresión de la proteína (Figura 7). </li></ol>

<ol><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+%26%2334%3Bgene+therapy%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &#34;gene therapy&#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li>
<li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+Optimized+Wilms%26%2334%3B+Tumor+1+%28WT1%29+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Design of an Optimized Wilms&#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).</li>
<li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized%2C+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li>
<li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li>
<li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA%3A+implication+for+therapeutic+RNA+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+drug+discovery+%26+development%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).</li>
<li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8(2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La terapia de ARNm tiene un enorme potencial en el campo de la medicina regenerativa, el tratamiento de las enfermedades y la vacunación. En este vídeo, se demuestra la producción de un ARNm modificado estabilizada para la inducción de la expresión de proteínas en las células. El uso de este protocolo, otros ARNm deseadas se pueden generar. La síntesis in vitro de ARNm modificado permite la transfección de células con mRNAs deseados para inducir la expresión de proteínas diana. De este modo, la proteína deseada...

En las células, la transcripción de ARN mensajero (ARNm) y la siguiente traducción del ARNm en proteínas deseadas garantizar el correcto funcionamiento de las células. Trastornos genéticos hereditarios o adquiridos pueden conducir a la síntesis insuficiente y disfuncional de las proteínas y causar enfermedades graves. Por lo tanto, un nuevo enfoque terapéutico para inducir la producción de proteínas que faltan o defectuosos es la entrega exógena de sintético modificado ARNm en las células, que codifica la proteína deseada. De esta manera, las células se activan para sintetizar proteínas funcionales, que normalmente no pueden producir o, naturalmente, no necesitar. Usando este enfoque, trastornos genéticos pueden ser corregidos mediante la introducción de ARNm que codifica para la proteína defectuosa o faltante 1. La terapia de mRNA también se puede utilizar para la vacunación de sintetizar los antígenos de proteínas, que se expresan por las células tumorales o patógenos. De esta manera, el sistema inmune del huésped puede ser activado para eliminar eficazmente las células tumorales o prevenir infecciones 2,3. Además, en los últimos años, el ARNm se utilizó con éxito para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Para este propósito, los fibroblastos fueron transfectadas con ARNm para inducir la expresión de factores de reprogramación 4-6 y convertirlos en CMPI con un enorme potencial en medicina regenerativa. Anteriormente, el uso de ARNm convencional se asoció con una baja estabilidad y fuerte inmunogenicidad. Por lo tanto, las aplicaciones clínicas de los ARNm convencionales eran limitadas. Sin embargo, la sustitución de citidina y uridina por 5-metilcitidina y pseudouridine dentro de la molécula de ARNm por Kariko y sus colegas rindió moléculas de ARNm estables en fluidos biológicos y redujo drásticamente la activación inmune 7-10, que ahora permite la aplicabilidad clínica de mRNAs modificados. Uso de mRNAs modificados producidos sintéticamente, transcripciones de genes deseados se pueden entregar temporalmente en vivo 11o in vitro para inducir la expresión de la proteína. El ARNm introducido se traduce en condiciones fisiológicas por la maquinaria de traducción celular. Debido a la falta de integración en el genoma de la célula huésped en comparación con los vectores de terapia génica viral, el riesgo de oncogénesis se evita 12,13. Por lo tanto, la terapia usando ARNm sintético modificado va a mejorar la aceptación clínica en el futuro. Aquí se describe un protocolo detallado para la producción de ARNm modificado (Figura 1), la transfección de células con ARNm y la evaluación de la expresión de la proteína en las células transfectadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cultivo celular</fuerte></td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamina &nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS sin calcio y magnesio&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0,04% Tripsina / 0,03% EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Solución Neutralizante de Tripsina, Inhibidor de Tripsina al 0.05% en células BSA</td></tr><tr><td>HEK-293</td> al 0.1% <td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumibles</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos, 12 pocillos&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular (75 cm2)&nbsp;</td><td>Tubos de</td><td></td> microcentrífuga estériles de 1,5 ml sin DNasa y RNasa de Corning 430641 <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml tubos cónicos&nbsp;</td><td>puntas de</td><td></td> pipeta de doble filtro de epT.I.P.S. bio-one 188271 <td></td></tr><tr><td>PCR limpias y estériles&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 y micro; l: 022491202; 100 y micro; l: 022491237; 1.000 y micro; l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 ml para cultivo bacteriano&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasmid amplificación y purificación</strong</td></tr><tr><td>>pcDNA 3.3_eGFP Plásmido&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 componente químico Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Agua estéril (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medio (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Disolver 25 g L-1 en agua estéril.</td></tr><tr><td>Agar LB (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Disolver 40 g L-1 en agua estéril.</td></tr><tr><td>Ampicilina Solución Preparada Sigma</td><td>Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><producción >mRNA fuerte</fuerte></td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-metilcitidina-5&agudo;-trifosfato&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-metil-CTP</td></tr><tr><td>pseudouridina-5&agudo;-trifosfato&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&agudo;-O-Me-m7G(5&acute;)PPP (5&agudo;)Análogo de la estructura de la tapa de ARN G&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock Inhibidor de la RNasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&micro; l (de MEGAscript T7 Kit)</td></tr><tr><td>Fosfatasa antártica&nbsp;</td><td>Nuevo Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Solución RNaseZap &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfection</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reactivo de Transfección&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reactivo catiónico de transfección de lípidos</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medios de suero reducidos&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Medio Esencial Mínimo Mejorado (MEM) que permite una reducción de la suplementación con Suero Fetal Bovino (FBS)&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>electroforesis en gel</fuerte></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de gel de ácido nucleico gelificado</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x en agua&nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow cytometry analyses</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrado&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Primer para amplificación de insertos y cola de poli (T) PCR</imprimación > fuerte</td></tr> <tr><td>hacia adelante (grado HPLC) 10 &micro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&agudo;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&agudo;</td></tr><tr><td>Imprimación inversa (grado HPLC) 10 y micro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&agudo;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&agudo;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cell incubadora</td><td>Binder</td><td></td><td>CO2 (5%) y O2 (20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de células CASY&nbsp;</td><td>Sch&auml; Sistema</td><td></td><td></td>rfe</tr><tr><td>Banco de trabajo estéril&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de bacterias&nbsp;</td><td>Espectrofotómetro Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop con baño</td><td></td><td></td><td></td>de agua</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Termociclador analítico Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR&nbsp;</td><td>Microcentrífuga Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato de gel para electroforesis&nbsp;</td>Sistema <td>de documentación Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel&nbsp;</td><td>Sistema Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia&nbsp;</td><td></td> Microscopio de contraste de fase Nikon<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis in vitro de arnm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

El suministro exógeno de codificación de ARN mensajero sintético (ARNm) para la inducción de la síntesis de proteínas en las células deseadas tiene un enorme potencial en los campos de la medicina regenerativa, la biología celular básica, el tratamiento de las enfermedades, y la reprogramación de las células. Aquí, se describe un paso a paso para la generación de protocolo de ARNm modificado con un reducido potencial de activación inmune y una mayor estabilidad, control de calidad de ARNm producido, la transfección de células con el ARNm y la verificación de la expresión de la proteína inducida por citometría de flujo. Hasta 3 días después de una sola transfección con eGFP ARNm, las células HEK293 transfectadas producen eGFP. En este artículo de vídeo, la síntesis de mRNA eGFP se describe como un ejemplo. Sin embargo, el procedimiento se puede aplicar para la producción de otros ARNm deseadas. Usando el ARNm sintético modificado, las células pueden ser inducidas a expresar transitoriamente las proteínas deseadas, que normalmente no expresarían.

El uso de un plásmido pcDNA 3.3 que contiene los CDS de eGFP, se estableció la síntesis de mRNA eGFP modificado (Figura 1). Después de la amplificación por PCR de inserción y poli T-tizón, una banda clara con una longitud de aproximadamente 1100 pb se detectó (Figura 2). Aumentando el tiempo de IVT aumentada el rendimiento de ARNm (Figura 3). Después de la IVT, se detectó una banda de ARNm claro con una longitud de aproximadamente 1.100 pb, que corresponde a la longitud...

En este artículo de vídeo, se describe la síntesis in vitro del ARNm modificado para la inducción de la expresión de proteínas en las células.

Síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

El objetivo general de este procedimiento es la síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión de proteínas en las células. Esto se logra amplificando primero el inserto de plásmido o la secuencia de ADN codificante y agregando una cola de poli T de 120 timidina mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El segundo paso es la transcripción in vitro del ADN generado a ARNm con colas de poliadenina.A continuación, se elimina el ADN molde mediante el tratamiento D'S de la mezcla de reacción de transcripción in vitro. El paso final es el tratamiento con fosfatasa antártica del ARNm producido para eliminar los cinco fosfatos principales. En última instancia, las células son transfectadas por el ARNm generado, los complejos lipídicos.La microscopía fluorescente y el análisis de citometría de flujo se utilizan para mostrar la síntesis de GFP mejorada en las células. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el transfect viral, es la falta de integración en el genoma de la célula huésped, lo que evita el riesgo de oncogénesis. Este método puede ayudar a producir proteínas faltantes o defectuosas en las células, y se puede utilizar para la vacunación, el tratamiento de trastornos genéticos.Y en el campo de la medicina regenerativa, la demostración del procedimiento estará a cargo de Steinle, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Antes del inicio de este procedimiento, los plásmidos que contenían las secuencias de ADN codificante requeridas o CDS se amplificaron en E. coli y se aislaron como se describe en el texto del protocolo. En este ejemplo, el CDS de interés es la proteína fluorescente verde mejorada o EGFP para amplificar y agregar simultáneamente un detalle poligonal al CDS de EGFP.Prepare una mezcla de PCR como se detalla en el texto del protocolo. Coloque el tubo de PCR en un termociclador y ejecute el protocolo de ciclo de PCR que se describe en el texto del protocolo. Una vez finalizada la reacción de PCR, limpie la reacción de PCR utilizando un kit de purificación de PCR disponible en el mercado y diluya el ADN con 20 microlitros de agua libre de nucleasa.Para comprobar la calidad del producto de PCR, realice una electroforesis en gel de ADN y visualice las bandas de ADN en un sistema de imágenes. Se debe detectar una banda de ADN clara con una longitud de aproximadamente 1.100 pares de bases durante la transcripción in vitro o IVT. El ADN generado anteriormente se transcribirá a ARNm.Prepare la mezcla analógica de la tapa NTP como se muestra aquí. Mezcle bien la mezcla analógica de la tapa NTP mediante vórtice. Luego gírelo hacia abajo Arme brevemente la mezcla de reacción IVT como se describe en esta tabla.Mezcle bien la mezcla de reacción IVT pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifuga brevemente el tubo de PCR para recoger la mezcla en el fondo del tubo. Incubar la mezcla de reacción IVT a 37 grados centígrados durante tres horas en un termomezclador.Después de tres horas, retire el ADN molde agregando un microlitro de ADN a la mezcla de reacción IVT. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Purifique la mezcla de reacción utilizando un kit de purificación de ARN y diluya el MR NA modificado de la membrana de la columna de centrifugación dos veces con 40 microlitros de agua libre de nucleasas, el ARNm modificado generado por IVT debe tratarse con fosfatasa para eliminar cinco trifosfatos principales, lo que puede conducir a la activación inmune.Para comenzar este procedimiento, agregue nueve microlitros de 10 tampones de reacción de fosfatasa antártica a 79 microlitros de una solución de ARNm purificada. Posteriormente, añadir dos microlitros de fosfatasa antártica y mezclar suavemente la muestra. Incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de 30 minutos, purifique la mezcla de reacción con un kit de purificación de ARN y diluya el ARNm modificado de la membrana de la columna de centrifugación dos veces con 50 microlitros de agua libre de nucleasas. Después de medir la concentración del ARNm modificado, ajuste la concentración a 100 nanogramos por microlitro agregando agua libre de nucleasa. Compruebe la calidad del ARNm modificado sintetizado mediante electroforesis en gel de ARN y visualice las prohibiciones de escalera y ARNm en un iluminador trans UV.Se debe detectar una banda clara de ARNm con una longitud de aproximadamente 1.100 pares de bases. Prepare las células HEC 2 9 3 para la transfección con el ARNm modificado sintetizado mediante siembra dos veces. Centre las cinco celdas por pocillo de una placa de 12 pocillos e incube las celdas durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de celdas Al día siguiente, la celda debería haber alcanzado un 80 a 90% de confluencia.Genere el lipoplexo para la transfección. Prepare suficiente mezcla de transfección para que todos los pocillos se transfecten, cada pocillo de una placa de 12 pocillos requiere 2,5 microgramos de ARNm modificado, dos microlitros de reactivo de transfección de lípidos y 473 microlitros de opt uno. Reducir el medio sérico.Mezcle los componentes suavemente pipeteando como control negativo. Prepare una mezcla de transfección sin Mr.NA, incube las mezclas de transfección a temperatura ambiente durante 20 minutos para generar lipoplex. Para la transfección.Lave las células con 500 microlitros de DPBS por día. Agregue 500 microlitros de mezcla de transfección a cada pocillo de la placa de 12 pocillos, incube las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono después de cuatro horas, aspire la mezcla de transfección y agregue un mililitro de cultivo celular completo. Medio a las celdas de cada pocillo.Incubar las células durante 24 horas en la incubadora de células. Posteriormente, realice un análisis microscópico de fluorescencia de las células utilizando un microscopio de fluorescencia para preparar las células para la citometría de flujo. Retire el medio de cultivo celular de los pocillos y lave cada pocillo con uno de los DPBS sin calcio ni magnesio.Añadir 500 microlitros de TRIPSINA EDTA por pocillo para separar las células de la superficie de las placas de cultivo celular. Posteriormente, agregue 500 microlitros de solución neutralizante de tripsina por pocillo para inactivar la centrífuga de prueba de las celdas separadas durante cinco minutos a 300 veces G de temperatura ambiente. Después de retirar el Reese supinado, suspenda el paladar celular en 150 microlitros de solución de fijación celular y transfiera la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo.Analice el porcentaje de células que expresan EGFP y la intensidad de fluorescencia utilizando la media geométrica de la intensidad de fluorescencia. La expresión de proteínas a lo largo del tiempo también se evalúa mediante análisis de citometría de flujo de las células que expresan EGFP a uno, dos y tres días después de la transfección, como se describe en el texto del protocolo, la funcionalidad del ARNm de EGFP generado se probó mediante la transfección de células HEC 2 9 3. La producción de EGFP en las células se detectó 24 horas después de la transfección mediante microscopía de fluorescencia.Aquí, se muestra una imagen de contraste facial de las células junto a una imagen de fluorescencia de las células. La expresión de EGFP en las células también se detectó mediante citometría de flujo 24 horas después de la transfección. La línea rosa representa las células sin ARNm, transfección, y la línea azul representa las células EGFP positivas.Después de la transfección del ARNm de EGFP, el 93,91% de todas las células medidas fueron positivas y la media geométrica de la intensidad de fluorescencia fue de 720,16. La duración de la expresión de la proteína en las células HC 2 93 se evaluó midiendo la expresión de EGFP uno, dos y tres días después del ARNm. La expresión de la proteína de transfección fue más alta en las células 24 horas después de la transfección.La cantidad se redujo 1,6 veces cada día siguiente, pero incluso después de tres días, las células contenían EGFP una vez dominadas. Esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir ARNm modificado estabilizado para la inducción de la expresión de proteínas deseada en las células.

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En la era genómica post-humana, la disponibilidad de proteínas recombinantes en conformaciones nativas es crucial para la investigación estructural, funcional y terapéutico y el desarrollo. Aquí se describe una prueba a gran escala y sistema de expresión de proteínas en células embrionarias humanas de riñón 293T que se pueden utilizar para producir una variedad de proteínas recombinantes.

Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

La expresión de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos se está convirtiendo en un método atractivo para producir complejos de proteínas para biología estructural. Aquí presentamos un sistema de expresión simple pero altamente eficiente utilizando células de mamíferos cultivadas en suspensión para purificar complejos de proteínas para estudios estructurales.

Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

Aquí describimos un método clínicamente relevante, alta eficiencia y libre de alimentador para reprogramar fibroblastos primarios humanos en células pluripotentes inducidas, usando modificado mRNAs que codifican factores de reprogramación y microRNA maduro-367/302 imita. También se incluyen métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación, ampliar las colonias clonales iPSC y confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60.

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

Protocolos detallados para ambos acilación in vitro y en células selectivo 2'-hidroxilo por experimentos de extensión (forma) de cartilla para determinar la estructura secundaria de las secuencias de interés en presencia de una pequeña molécula de RNA-dirigido a pre-mRNA son presentados en este artículo.

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

Se desarrolla una nanopartícula de péptido-poloxamina autoensamblada (PP-sNp) utilizando un dispositivo de mezcla microfluídica para encapsular y entregar ARN mensajero transcrito in vitro . El ARNm/PP-sNp descrito podría transfectar eficientemente células cultivadas in vitro.

Transfección eficiente del ARNm transcrito in vitro en células cultivadas utilizando nanopartículas de péptido-poloxamina

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

Aprende a sintetizar ARNm modificado in vitro para inducir la expresión proteica en células humanas mediante transcripción in vitro y transfección lipídica. Este protocolo evita la integración genómica y facilita aplicaciones en terapia génica.

Síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas

Explorar más videos