RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los niveles de expresión de todos los genes y muestras de la médula espinal embrionaria de pollo electroporada. Esto se logra primero en ovo, estudiando detenidamente el lado derecho de los tubos neurales embrionarios tempranos y volviendo a incubar los embriones hasta la etapa deseada. El segundo paso del procedimiento es diseccionar con éxito las mitades del tubo neural transfectadas en un entorno libre de ARN y proceder a la lisis lo más rápido posible.

El tercer paso es aislar el ARN y someter las muestras a la preparación de la biblioteca y a la secuenciación de alto rendimiento. El paso final es procesar los conjuntos de datos para eliminar los artefactos de secuenciación. Asigna razas al genoma y asigna niveles de expresión a cada gen.

En última instancia, los resultados pueden mostrar genes expresados diferencialmente a través de la comparación de los niveles de expresión en condiciones de control y experimentales. La demostración visual de este método es fundamental como disección de tubos neurológicos. Los pasos son difíciles de aprender porque requerimos familiaridad con la manipulación de embriones.

Para esta demostración, los embriones han sido transformados con la construcción que expresa GFP en el tubo neural. Prepárese para pasar dos horas trabajando en hasta 10 embriones para recolectar de uno a dos microgramos de ARN total por embrión. En condiciones de ARN, sin ARN, se recolectan los embriones con unas tijeras finas de disección y una cuchara de recolección SVE para transferir cada embrión a frío.

Tratamiento con DPC. PBS utilizó una solución para todos los pasos de aislamiento del tubo neural, proceda mediante el uso de pinzas finas para eliminar toda la región del flanco de un embrión entre las yemas de las extremidades. Mueva esta sección a una solución fría fresca con el tejido con el lado dorsal hacia arriba.

Utilice dos agujas de vidrio finas para perforar tres puntos en cada lado lateral dorsal del embrión entre el tubo neural y el mesodermo parial. Ahora introduzca las dos agujas de vidrio en la perforación central y sepárelas a lo largo del eje AP. Haga esto a través de cada perforación según sea necesario para finalmente separar el mesodermo paral, eliminar y desechar este tejido.

A continuación, gira el embrión hacia un lado e introduce las puntas de dos pinzas entre el tubo neural y el cordón ganglionar. Deslícelos a lo largo del eje PA para dividir las estructuras. Termine de quitar los trozos más grandes de tejido de meder del tubo neural asegurándolo suavemente con pinzas mientras quita el exceso de mesodermo.

Luego, transfiera suavemente el tubo neural a una solución fría fresca. Con una pipeta de vidrio con una bomba manual, recoja todos los tubos neurales necesarios y manténgalos en hielo antes de continuar. Ahora, divide cada uno de los tubos neurales en dos mitades.

Inserte pinzas de punta afilada en el lumen y rompa la placa del techo. A continuación, utiliza las pinzas para cortar la placa del suelo y dividir el tejido por la mitad. Usando un microscopio de disección fluorescente, separe las mitades electroporadas de las no electroporadas.

Transfiera las mitades del tubo neural clasificadas a un tubo de 1,5 mililitros con solución fresca. Mueve estos tubos para que todo el tejido llegue al fondo. A continuación, gire los tubos a 100 GS durante unos segundos.

Luego, con mucho cuidado y bajo una luz brillante, aspire el snat. Si se extrae tejido, expulse lentamente y repita el giro. Una vez que las mitades del tubo neural se hayan limpiado de la solución, agregue 70 microlitros por tubo neural, la mitad del tampón de lisis al tubo.

Agite el tubo e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos cada cinco minutos, agite el tubo vigorosamente y proceda a recolectar el ARN para purificar el ARN Para la secuenciación, tenga al menos ocho mitades de tubo neural por muestra. Otras colecciones de tubos neurales de lyce almacenados a menos 80 grados Celsius se pueden agrupar en la colección. Comience descongelándolos en hielo durante 15 a 30 minutos y luego complete la descongelación a temperatura ambiente.

Una vez descongeladas, agite vigorosamente todas las muestras y déjelas reposar durante cinco minutos. A continuación, vuelva a vorexar las muestras y centrifugarlas a 15.000 GS durante un minuto. Para deshacerse del material insoluble, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y proceda a la extracción.

Usando un kit de aislamiento de ARN, complete el proceso eludiendo el ARN a la mayor concentración posible. Este protocolo requiere una cuenta en el sitio web de Galaxy para garantizar la cuota de espacio necesaria. En primer lugar, FTP carga los archivos FASTQ en el sitio a menos que las puntuaciones de calidad ya estén codificadas en Shred plus 33.

En primer lugar, prepare los conjuntos de datos cargados utilizando la herramienta de aseo FASTQ en el menú Control de calidad y manipulación de NGS. De lo contrario, en atributos, cambie el tipo de archivo a remitente FASTQ. A continuación, en el menú Control de calidad y manipulación de NGS, utilice la herramienta FAST QC para analizar la calidad general de los conjuntos de datos.

Seleccione el recortador de calidad FASTQ en el mismo menú para descartar los tres extremos principales que son de baja calidad. Se debe procesar una puntuación de calidad de 20 o superior. Ahora ve a la herramienta de clip en el mismo menú.

Configure esta herramienta para descartar lecturas con menos de 45 pares de bases. Introduzca la secuencia del adaptador. Deshabilite la opción para descartar lecturas con bases desconocidas y elija la salida para incluir secuencias recortadas y no recortadas.

Continúe con la herramienta de secuencias de recorte. Úselo para recortar las primeras bases de la lectura para eliminar el sesgo de cinco secuencias principales que detecta FAST qc. El siguiente paso es descargar y desempaquetar el último ensamblaje del genoma del pollo desde el sitio del genoma Illumina I.

A continuación, cargue el archivo de formato más rápido del genoma completo y el archivo de formato GTF de anotación del gen en el Galaxy History. Ahora mapee las lecturas de cada muestra al genoma accediendo al menú de análisis N-G-S-R-N-A y seleccionando la herramienta top hat two. Seleccione el archivo fasta cargado de la Historia de la Galaxia como genoma de referencia.

A continuación, elija la herramienta de gemelos en el mismo menú para crear un transcriptoma predicho. Para cada ejemplo, elija el archivo GTF que se utilizará como guía de anotación de referencia. Seleccione Realizar corrección de sesgo mediante el archivo FASTA para los datos de secuencia y habilite la opción Usar corrección de lectura múltiple.

A continuación, combine todos los transcriptomas ensamblados con la herramienta de combinación de manguitos. Con esta herramienta, elija el archivo GTF para la anotación de referencia y el archivo FASTA para los datos de secuencia. Ahora compare los archivos BAM generados por top hat dos para cada muestra usando la herramienta TIFF del brazalete que aún se encuentra en el menú de análisis de ARN.

En el campo de transcripciones, seleccione el transcriptoma de combinación generado por la combinación de brazaletes y habilite las opciones. Utilice la corrección de lectura múltiple y realice la corrección de sesgo utilizando el archivo FASTA para los datos de secuencia. El siguiente paso es ordenar las tablas diferenciales Usando la columna Valor Q, seleccione la herramienta de ordenación en el menú de filtro y ordenación.

Las secuencias con diferencia significativa entre las condiciones experimentales tendrán los valores Q más bajos en la columna 13. Ahora echa un vistazo a los gráficos de cobertura. Primero, convierta los archivos BAM en archivos de gráfico de lecho usando la herramienta de conversión en el menú de herramientas de lecho en las opciones, deshabilite los informes de regiones sin cobertura y elija tratar las entradas empalmadas como intervalos distintos.

Escale también la cobertura por un factor que normalice todas las coberturas del experimento. A continuación, convierta el archivo de gráfico de cama resultante al formato de peluca grande utilizando la herramienta en el menú de conversión de formatos y cargue el archivo de peluca grande como una pista personalizada en el servidor UCSE. En la página del navegador de genomas de la USCS, utilice el ensamblaje GAL cuatro y las búsquedas de genes para la cobertura visual de los conjuntos de datos utilizando los métodos descritos: los tubos neuronales que expresan vectores PS vacíos se recolectaron para su ARN.

Esto se hizo por duplicado y el ARN resultante fue de muy alta calidad con un valor RIN óptimo de 10 como se esperaba. La comparación global de los transcriptomas de los controles de vectores vacíos duplicados no mostró diferencias claras y el coeficiente de correlación de Pearson fue de 99. Además, hubo un claro aumento en el número de lecturas asignadas a la secuencia del gen scratch two en una muestra experimental que expresaba los dominios del dedo de zinc scratch two.

Por lo tanto, los métodos eran lo suficientemente sensibles como para detectar el enriquecimiento predicho. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de aislar el tubo neurológico embrionario y tener una buena comprensión de cómo procesar y comparar el conjunto de datos de IC para encontrar genes expresados diferencialmente siguiendo los pasos de análisis de silicio de la sección cuatro del protocolo.