Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

El objetivo general de este procedimiento es aislar la capa de fotorreceptores del ratón. Para el cultivo, el primer paso es obtener una retina plana completa y sellarla en un bloque de gelatina. A continuación, se cortan con éxito las capas de la retina para aislar la capa de fotorreceptores.

El paso final es sembrar células fotorreceptoras purificadas en cultivo. En última instancia, la pureza de la capa fotorreceptora se confirma mediante microscopía e inmunofluorescencia, seguidas de pruebas de factor de viabilidad de cono derivadas de bastones. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microdisección láser, es que se aísla con seguridad la capa fotorreceptora.

Las implicaciones de esta tecnología se extienden hacia el tratamiento de la degeneración hereditaria de la retina. Dado que es muy conveniente estudiar la biología de los fotorreceptores, originalmente habíamos desarrollado este método para estudiar la interacción celular entre los fotorreceptores de bastones y fríos. El trasplante de la capa fotorreceptora en el ojo de la hembra primitiva condujo a la identificación de todos los factores de viabilidad derivados.

La demostración visual de estos métodos es fundamental, ya que la oportunidad de la retina de montaña plana es difícil de realizar porque es complicada. Antes de aislar la retina, prepare el vibrato. Comience con platos de solución de gelatina al 20% sacados del almacenamiento a cuatro grados centígrados.

Corta la gelatina con un bisturí, luego voltea la rodaja de gelatina y pégala en el disco de soporte negro del vibrador con una gota de superpegamento. A continuación, rompe una hoja de afeitar en dos mitades e inserta una mitad en el vibrador. A continuación, inserte el disco de soporte negro en el aparato vibrador y gire la perilla negra hacia la derecha.

Ahora, asegure el receptáculo de sujeción a la cabeza del vibrato y cubra el bloque de gelatina con medio independiente del CO2. Enciende el vibrato para probar la configuración. Corte tres rodajas de 100 micras hasta que el corte sea suave y se produzcan rodajas planas.

Después de extraer los ojos de un ratón y otras preparaciones, aísle la retina. Primero, use una aguja de calibre 18 para hacer un agujero a nivel de la extremidad del ojo. Luego, para quitar el cuerpo ciliar, inserte unas tijeras rectas a través del orificio y en el globo ocular, y corte con cuidado la esclerótica debajo del iris y luego a lo largo del perímetro del globo ocular.

A continuación, mantenga la parte posterior del ojo con la retina contigua a la esclerótica y retire la córnea y el cristalino. Con dos agarres finos, extraiga el vítreo, que está adherido a la retina sin dañarla para que la retina pueda quedar plana. Haz cuatro cortes radiales en él.

Ahora levanta el globo ocular y pélalo como una naranja. A continuación, con mucho cuidado con unas tijeras rectas finas. Separar la retina de la esclerótica y el epitelio pigmentado de la retina.

Debe permanecer unido a nivel del nervio óptico mediante agarres finos, desprender el vítreo restante empezando por la periferia y desplazándose hacia el centro de la retina. Con todo el vítreo eliminado por completo, la retina se aplanará. Ahora transfiera la retina a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro.

El proceso de sellar la retina plana en el bloque de gelatina es delicado y, fundamentalmente, el aspecto más desafiante de la sección del tejido. En primer lugar, retire de 20 a 30 mililitros de medio del tanque de vibram. En segundo lugar, transfiera la retina a un portaobjetos de vidrio utilizando una pipeta de plástico de diámetro ancho y aplique una gota de medio independiente del CO2 al portaobjetos.

En tercer lugar, transfiera la retina a una rodaja de gelatina con un fotorreceptor hacia abajo. En cuarto lugar, adhiera la retina al bloque de gelatina. Inyecte suavemente gelatina tibia al 4% en un lado del bloque entre la retina y el bloque de gelatina y expulse la gelatina al otro lado.

Por último, aspire la gelatina con una pipeta de vidrio y espere de siete a 10 minutos mientras la retina se sella en el bloque. Ahora agregue el medio independiente de CO2 nuevamente al tanque y sumerja el bloque y la cuchilla para seccionar comenzando desde la parte superior del bloque de gelatina. Corta secciones en serie de 100 micras hasta que la cuchilla llegue a la retina.

Luego, usando una velocidad muy lenta, como una o dos, corte secciones de 100 a 120 micras de la capa interna de la retina. Dependiendo de la aplicación, esta capa puede desecharse o almacenarse en nitrógeno líquido, manteniendo la velocidad baja en la interfaz entre la capa interna y externa. Tome secciones de 15 micras.

Examine estas secciones bajo un microscopio para detectar la presencia de vasos sanguíneos. Cuando no hay ninguno, se ha llegado a la retina externa a través de la capa externa. Corte lentamente secciones de 200 micras.

Transfiera estas rodajas a un plato de 35 milímetros con tres mililitros de medio frío, independiente del CO2, mantenido en hielo. Proceda a recolectar todas las secciones de la capa fotorreceptora de todas las retinas para seccionarlas en esta placa. Comience transfiriendo los fotorreceptores cortados en rodajas a una incubadora a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

Luego, con pinzas, separe suavemente cada capa fotorreceptora de la gelatina y transfiéralas a un nuevo plato lleno de tres mililitros de solución de ringer a temperatura ambiente. Una vez aislados todos los fotorreceptores de la gelatina, se combinan dos unidades de papaína con 25 microlitros de solución activadora en un tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros y se incuban durante 30 minutos. Para activar la papaína durante esta incubación, corte las rodajas de la capa fotorreceptora en trozos cuadrados de dos milímetros y no mucho más pequeños.

Transfiera estas piezas a un tubo de cinco mililitros con 1,5 mililitros de solución de ringer. A continuación, aspire los timbres y sustitúyalos para un segundo lavado. Espere a que todas las rodajas se asienten por gravedad, sedimentación, y luego retire toda la solución de timbre restante del tubo.

A continuación, agregue 475 microlitros de solución de timbre al tubo que contiene la papaína activada y mezcle. Transfiera esta mezcla al tubo que contiene las rodajas e incube durante 20 minutos. Después de 20 minutos, detenga la digestión de la papaína agregando un mililitro de 10%FCS en DMEM.

A continuación, añadir 25 unidades de D Ns.One para digerir el ADN de las células fotorreceptoras que han muerto, homogeneizar cuidadosamente la suspensión con pipeteo para paladar las células fotorreceptoras. Girar el tubo a 115 Gs durante seis minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en DMEM suplementado con una pipeta de un mililitro. Repita esto, gire y vuelva a suspensión. Una vez.

Ahora, desde el ojo cosechado, de una a 1,5 millones de células deberían estar listas para sembrar. Siembrarlas a 100.000 células por centímetro cuadrado y cultivarlas durante cinco días antes de las aplicaciones posteriores Utilizando los métodos descritos, se realizaron cultivos de células fotorreceptoras a partir de ratones de tipo salvaje en el octavo día postnatal. Sin FCS, las células se fijaron y se tiñeron para anti fila o un marcador anti pandeo anterior.

Menos células fueron positivas para anti fila, ya que SAG precede a la expresión de ROE. También se prepararon fotorreceptores de ratones de 35 días de edad para examinar la expresión de ARNm, de RO sag y del cono que transduce GA dos. Estos genes se expresan de manera más prominente en los fotorreceptores en comparación con todo el cerebro.

G NAT dos se expresa específicamente por conos. La expresión proteica de RO y g. NAT dos en los fotorreceptores se examinó comparando las células de la capa fotorreceptora con las células de la capa interna de la retina.

Esto se hizo con ratones de tipo salvaje y con ratones mutantes RD. Los ratones mutantes no mostraron expresión de ninguna de las proteínas a los 35 días. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener una capa de fotorreceptores purificada adecuada.

Esta técnica se puede realizar en unas cinco o seis horas para cuatro a ocho retinas si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento. Además, se pueden realizar métodos como la sangre occidental para responder a preguntas adicionales como la expresión de proteínas durante la degeneración de los fotorreceptores después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de la retina estudiaran la transcripción, el proteoma y el metabolismo de modelos animales relevantes.