La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

El objetivo general de este procedimiento es transfectar de forma fiable macrófagos humanos THP one con alta viabilidad celular y sin activación celular. Esto se logra prediferenciando primero los monocitos THP uno durante 48 horas. El segundo paso del procedimiento es separar los macrófagos TP uno prematuros.

El tercer paso es transfectar las células con IRNA o ADN plasmídico, utilizando la tecnología de factor de núcleo de lonza. Los pasos finales son resembrar y diferenciar aún más las células. En última instancia, el éxito de la eliminación o sobreexpresión de genes puede demostrarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real, Western blot back, etc.

La principal ventaja de esta técnica en comparación con otros enfoques de transfección como la lipofección, es que podemos lograr una alta eficiencia de transfección junto con una alta viabilidad celular, y que no alteramos la función y el comportamiento de los micrófagos. Desafortunadamente, esta técnica no es adecuada para aplicaciones de alto rendimiento, ya que no se puede realizar un transfecto más intenso a la vez para este protocolo. Haber cultivado células THP one en RPMI 1640 con 10% de FCS y con 1% de estreptococo L glutamina 24 horas antes de la transfección, dividir las células y proporcionarles medios frescos.

Al día siguiente. Diferencie previamente las células sembrando de 10 a 15 millones de células en un matraz de tejido de 75 centímetros cuadrados con las siguientes adiciones al medio RPMI suplementado, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio, 10 nanogramos por mililitro, PMA y 50 micromolares beta mercaptoetanol después de 48 horas, aspire el medio y reemplácelo con seis mililitros de Accutane. Uno se calentó a 37 grados centígrados para separar las células.

Incubarlos durante 30 minutos durante la incubación. Preparar suficiente medio de transfección y medio de cultivo para el cuidado post-afección del núcleo de las células. Después de 30 minutos, verifique que las celdas estén separadas y mire a su alrededor.

Si todavía hay algunas células adheridas, bombee suavemente el matraz con una micropipeta o utilice una simple agitación para separarlas. No use un raspador. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 300 Gs y a temperatura ambiente, retire el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet de celda.

En un mililitro de RPMI, medio precalentado a 37 grados centígrados, cuente las células y haga alícuotas de micro tubos de desecho que contengan de dos a dos millones y medio de células para su transfección inmediata. Una ejecución rápida de este protocolo es esencial. Para evitar la pérdida de la muerte celular, asegúrese de tener todos los materiales preparados con anticipación Primero centrífuga, todas las alícuotas de transfección durante 10 minutos a 250 GS y a temperatura ambiente mientras están girando, cargue todos los nucleoefectores veterinarios con medio microgramo de ADN plasmídico o un microgramo de ARN SI Utilice una dilución altamente concentrada para que ocupen un volumen mínimo del veterinario.

Ahora aspire el sobrenadante de una sola de las alícuotas reales de la célula. Suspender las células a 100 microlitros en una solución de factor de nucleo. No permita que las células permanezcan expuestas a la solución durante más de 15 minutos.

Transfiere las células al veterinario Q y mézclalas con golpecitos suaves. A continuación, transfecte las células utilizando el programa Y 0 0 1 en un modelo de dos factores de núcleo B. Con una pipeta desechable, mueva las células electroporadas a un vial de reacción e inmediatamente agregue medio mililitro de medio de transfección previamente advertido a las celdas.

Ahora sigue repitiendo el proceso con cada alícuota de células una por una hasta que todas estén transfectadas. Después de completar la afección del núcleo, transfiera cada transfección de células a un pocillo de una placa de seis pocillos con 2,5 mililitros de medio de transfección caliente. Mezcle bien cada uno de ellos con una micropipeta.

Después de dejar incubar todas las placas cargadas durante cuatro horas, verifique el estado de las células bajo un microscopio. Después de cuatro horas, la mayoría de las células deben adherirse a la placa si es necesario. A lo más.

Otra hora de incubación proporcionará suficiente sahe trabajando un pozo a la vez. Aspire el medio de transfección de las células adheridas y reemplácelo con un volumen igual de medio de cultivo caliente. Tenga cuidado de evitar separar las celdas durante este paso.

Ahora, incuba las células durante el tiempo que sea necesario. Si es necesario, reemplace los medios cada 48 horas y planifique la aplicación de los tratamientos para que terminen cuando el ADN o ARN transfectado esté en su punto máximo de efecto. Al tratar las células con efectores, utilice un medio libre de suero sin PMA y sin beta mercaptoetanol.

Tenga cuidado de no dejar que las células se incuben durante más de 24 horas sin suero. Se utilizó el protocolo para transfectar, se evaluó THP de un macrófago con morfología celular IRNA. De acuerdo con la medición por citometría de flujo.

La tasa de apoptosis y necrosis en las células fue baja tanto en los cultivos transfectados como en los controles. Sin embargo, recuentos cuidadosos revelaron que tanto la apoptosis como la necrosis fueron ligeramente mayores para las muestras transfectadas. Esto podría deberse a que los macrófagos THP one transfectados eran más difíciles de separar de las placas que las células transfectadas UNT.

En general, las tasas de transfección fueron superiores al 90% según lo analizado por citometría de flujo. Usando fluorescente S-I-R-N-A la eficiencia de la transfección también se confirmó por microscopía de fluorescencia. La funcionalidad de la transfección se demostró mediante la eliminación genética de la expresión de IL 10 RB.

Una vez dominado, el transfecto se puede realizar en una a una hora y media si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el medio de cultivo tiene una influencia considerable en el rendimiento. Esto se describe en el protocolo de texto.