Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

El objetivo general de este procedimiento es analizar el comportamiento migratorio de las células dentro del entorno tridimensional. Primero, incruste las células de interés en una red de colágeno tridimensional. A continuación, registre el movimiento de las células mediante microscopía de video de lapso de tiempo, delinee los parámetros de migración mediante el seguimiento de células asistido por computadora y analice los datos de seguimiento de células mediante el uso de una aplicación de software de hoja de cálculo.

En última instancia, este método se puede utilizar para investigar qué factores y vías de transducción de señales regulan la migración de células cancerosas o células normales como leucocitos, linfocitos y células madre en el contexto del cáncer. Por lo tanto, el conocimiento de la migración celular, los factores moduladores y las vías de transección de señales asociadas podría ser útil para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para perjudicar la migración de células tumorales y la diseminación metastásica. Para las cámaras de migración, cepille rápidamente dos capas de cera de parafina derretida, mezcla de vaselina hasta el centro de un portaobjetos de vidrio, agregue una cubierta, deslice y selle con dos capas de cera de parafina, mezcla de vaselina.

A continuación, coloque las cámaras de migración en posición vertical en una rejilla para tubos de reacción de 1,5 mililitros. Añade 20 microlitros de la suspensión celular para la suspensión de colágeno. Combine bien 50 microlitros de 10 XMEM y 27 microlitros de mezcla de solución de bicarbonato de sodio al 7,5%.

Luego agregue 375 microlitros de suspensión de colágeno líquido y mezcle bien para obtener un color púrpura claro que indica un pH de 7.5. Ahora agregue 100 microlitros de la suspensión final de colágeno a 50 microlitros de la suspensión celular y mezcle bien mientras nota el inicio de la fibra de colágeno. Polimerización. A pH 7,5, transfiera la mezcla a las cámaras de migración.

Golpee suavemente la cámara de migración para distribuir uniformemente la mezcla de células de suspensión de colágeno en la parte inferior de la cámara de la cadena de migración. Coloque las cámaras de migración en posición vertical en la rejilla e incube durante 30 minutos. Cuando la red de colágeno polimerizado esté ligeramente turbia, pero aún de un color púrpura claro, llene las cámaras de migración con el medio apropiado y selle la cámara de migración con cera de parafina.

Mezcla de vaselina. Ajuste el calentador de la etapa del microscopio a 37 grados Celsius usando un aumento de 10x en la cámara de migración. Enfoque aproximadamente 50 celdas o más en el campo de visión.

Grabe la migración de células en modo de lapso de tiempo utilizando una aplicación de software de videovigilancia multicámara. Guarde las películas de migración de celdas en un formato de archivo adecuado. Vincule los archivos de película de migración celular a una base de datos que contenga información de apoyo, como el tipo de célula y las condiciones experimentales.

A continuación, analice las películas de migración de células utilizando una aplicación de software de seguimiento de células adecuada para un análisis imparcial. Seleccione aleatoriamente las celdas para el análisis sin el conocimiento de si las celdas están activas migratoriamente en total, determine alrededor de 60 coordenadas XY por celda en un experimento típico de migración celular. En caso de división celular, elija al azar una célula hija para seguir en el seguimiento.

Analice los datos de seguimiento de celdas mediante el uso de una aplicación de software adecuada, como un programa de hoja de cálculo, para calcular la distancia total que ha migrado una celda. Multiplique la suma de los valores numéricos de píxel por un factor de corrección para la conversión a micras. Defina las celdas que han migrado menos del umbral de 25 micras como celdas inmóviles y reemplace los valores numéricos por una coma.

A continuación, calcule la actividad locomotora como un porcentaje de células de la población de células rastreadas que se han movido entre dos puntos temporales. Además, calcule el tiempo de movimiento activo como un porcentaje del tiempo total que una celda ha migrado en relación con el período de tiempo del período de observación. A continuación, calcule la significación estadística utilizando la prueba U de Whitney de Man y muestre los datos de migración celular.

Un archivo de datos de seguimiento de celda típico se asemeja a una tabla en la que cada columna representa una celda de seguimiento. Las filas contienen la información de posición sobre el movimiento de la célula. A lo largo del tiempo, el comportamiento locomotor de las células se puede caracterizar por la actividad locomotora media de la población celular analizada y también por el tiempo de movimiento activo.

Este ejemplo muestra las actividades migratorias de 120 células de cuatro experimentos independientes. Cada diamante indica que una celda se ha movido entre al menos dos puntos de tiempo. Las líneas grises diferencian las celdas móviles y las que no se mueven.

El parámetro de la actividad de la locomotora se puede mostrar como un diagrama XY o un diagrama de caja. Para visualizar la dinámica de la población de células analizadas, un histograma muestra eficazmente el tiempo activo de esas mismas células. Este análisis del comportamiento migratorio de las líneas celulares de cáncer de mama MDA HER2 y M-D-A-N-E-O indica que ambas líneas celulares exhibieron una actividad locomotora espontánea similar.

El parámetro tiempo activo reveló un número ligeramente mayor de células M-D-A-H-E-R que se movían espontáneamente en comparación con las células de cáncer de mama M-D-A-N-O. La estimulación con 100 nanogramos por mililitro de EGF dio lugar a un aumento significativo de la actividad migratoria de MDA HER2, medido por el número de células en movimiento y el tiempo de movimiento activo. Curiosamente, las células M-D-A-N-E-O migraron en respuesta a la estimulación del EGF y mostraron un patrón activo de tiempo desplazado. El tratamiento con inhibidor de la fosfolipasa c gamma one uc 3 1 22 redujo tanto la migración espontánea como la inducida por el EGF tanto de M-D-E-E-R two como de MDAN.

Células EEO. El análisis del parámetro de tiempo activo reveló que el tratamiento de las células MDAN EEO con dos micromolares de U 7 3 1 2 2 resultó en una actividad locomotora marcadamente disminuida, atribuida principalmente a una mayor cantidad de células inmóviles. Una vez dominada, la migración de linfocitos y leucocitos a un colágeno tridimensional se puede registrar en aproximadamente dos horas, mientras que las células tumorales se registran durante la noche.