Name: Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprende a preparar pellets bacterianos a partir de hemocultivos positivos mediante centrifugación y lisis con cloruro de amonio. Este método permite identificación rápida por MALDI-TOF y pruebas de susceptibilidad antibiótica.

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Damos las gracias a los técnicos del laboratorio de Bacteriología del Centro Hospitalario Universitario de Lausana por su ayuda para poner en práctica las técnicas en el laboratorio.

Este protocolo ha sido desarrollado y validado después de los procesos de investigación y desarrollo y las normas éticas de nuestra institución antes de ser implementado como una herramienta rutinaria. 1 Preparación de un cultivo de sangre bacteriana Pellet por Amonio Procedimiento Cloruro de eritrocitos-lisis <ol><li> Preparación de una cultura positiva de sangre para su posterior centrifugación. <ol><li> Esterilizar la tapa hemocultivo. Añadir 70% de etanol en la tapa de la botella y quemarlo. NOTA: No realice este paso en una campana de flujo laminar. </li><li> Mover la botella a una campana de flujo laminar. Recoger 5 ml del cultivo de la sangre con una jeringa 20 G. </li><li> Añadir los 5 ml de cultivo de sangre en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 45 ml de agua estéril (H 2 O) y mezclar la muestra. </li></ol></li><li> Preparación de un cultivo de sangre sedimento bacteriano por lisis centrifugación. <ol><li> Centrifugar la muestra a 1000 xg durante 10 min a TA. </li><li> Remove el sobrenadante (que contiene principalmente H 2 O y células de la sangre) con una bomba de vacío de laboratorio. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de cloruro de amonio casero solución de lisis (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3). Divida el sedimento por raspado y agitando con vórtex el tubo y centrifugar la muestra a 140 xg durante 10 min a TA. </li><li> Descartar el sobrenadante que contiene principalmente los escombros células rojas de la sangre. <ol><li> Si el sedimento se mantuvo hemorrágico, resuspender el precipitado en 2 ml de H destilada estéril y 2 0 para lisar los glóbulos rojos más residuales y para lavar el sedimento. Centrifugar la muestra a 140 xg durante 10 min a TA y desechar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Resuspender el sedimento en 200 l de H 2 O </li></ol></li><li> Subcultura de cultivo de sangre en diversos medios de agar selectivo y no selectivo. <ol><li> Recoge 1 ml del cultivo de sangre con una jeringa de 20 G. </li><li> Inocular 1 gota de hemocultivo into cuatro cuadrantes en agar sangre, agar chocolate, agar McConkey y agar Schaedler. </li><li> Incubar a 37 ° C el agar sangre y placas de agar de chocolate en una atmósfera de 5% de CO 2, el agar McConkey en un ambiente normal y la placa de agar Schaedler en condiciones anaeróbicas. </li><li> Siga el crecimiento bacteriano en los distintos medios. </li><li> Compruebe la pureza bacteriana. </li></ol></li></ol> 2. identificación por MALDI-TOF MS <ol><li> La identificación directa del sedimento de sangre. <ol><li> Transferencia de 1 l de la pastilla de sangre en una placa de MALDI objetivo y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C. </li><li> Superposición de la muestra con ácido fórmico 1 l 70% y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C. </li><li> Superposición de la muestra con 1 l de matriz MALDI y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C (solución de α-ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo al 50%-un 2,5% de ácido trifluoroacético saturada). </li><li> Proceda a MALDI-TOF MS análisis con un sistema MALDI-TOF MS como se describe por los fabricantes. </li><li> Si la puntuación de identificación no es válido a nivel de especie (por ejemplo, con una puntuación &lt;2), lleve a cabo una extracción de proteínas de la muestra de sedimento de sangre. </li></ol></li><li> Identificación de la proteína después de la extracción del sedimento cultivo de sangre. <ol><li> Mezclar 20 l de la pastilla con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga a 13.000 xg durante 2 min a TA. </li><li> Descartar el sobrenadante y añadir 25 l de ácido fórmico al 70% y 25 l de acetonitrilo al 100% a la pastilla. Vortex vigorosamente para volver a suspender los pellets. Resuspender bolitas duras por romper hacia abajo con puntas de pipeta antes de vórtice. </li><li> Se centrifuga a 13.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferencia de 1 l del sobrenadante (que contiene proteínas extraídas) en una placa de MALDI objetivo y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C. Proceda como se describe en 2.1.2. </li></ol></li></ol> 3. bacteriana Identificación y Antibiótico Pruebas de Susceptibilidad con un Sistema Automatizado Microbiana <ol><li> Preparación de una suspensión bacteriana de identificación bacteriana y AST con un sistema automatizado microbiana. <ol><li> Preparar un tubo de plástico que contiene 3 ml de solución estéril de NaCl al 0,45% compatible con el sistema automatizado microbiana. </li><li> Añadir un volumen suficiente de la pastilla de cultivo de sangre en la solución de NaCl 0,45% para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8. Medir la turbidez usando una máquina de densitómetro. NOTA: El volumen del sedimento bacteriano cultivo de sangre varía entre 50 y 200 l para lograr una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8. </li></ol></li><li> Inocular las automatizados Gram-positivo (GP) o Gram-negativo (GN) tarjetas de identificación y las tarjetas AST automatizados para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias cocos Gram-positivos y Gram-negativos como se describe por el fabricante. NOTA: Identificación con GP o tarjetas GN no se aplica si MALDI-TOF MS valor de la puntuación de identificación es&gt; 2. Comprobar la pureza de la suspensión bacteriana mediante subcultivo la suspensión bacteriana en agar sangre (GP y GN) y agar MacConkey (GN) placas. </li></ol> 4. antibióticos Pruebas de Susceptibilidad por difusión con discos de ensayo El ensayo de difusión en disco es descrito por el Comité Europeo de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (EUCAST, Versión 3.0, abril de 2013, www.eucast.org). <ol><li> Preparación de una suspensión bacteriana para realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana mediante el ensayo de difusión en disco. <ol><li> Preparar un tubo de vidrio que contiene 3 ml de solución estéril de NaCl al 0,9%. </li><li> Añadir un volumen suficiente de la pastilla de cultivo de sangre en la solución de NaCl al 0,9% para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez McFarland de 0,5. Medir la turbidez usando una máquina de densitómetro. NOTA: El volumen del cultivo de sangresedimento bacteriano varía entre 50 y 200 l para lograr una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8. </li><li> Vórtex con la suspensión bacteriana. </li></ol></li><li> La inoculación de suspensión bacteriana sobre agar Mueller-Hinton (MH) o agar Mueller-Hinton agar-organismos fastidiosos (MHF) (MH suplementado con 5% de sangre desfibrinada de caballo y 20 mg / l de adenina dinucleótido nicotinamida-β). <ol><li> Sumergir un hisopo de algodón estéril en la suspensión bacteriana y retirar suavemente el exceso de fluido girando el hisopo en la pared interior del tubo de vidrio. </li><li> Corre la suspensión bacteriana de manera uniforme sobre toda la superficie de la placa de agar MH / MHF en muestras de secreciones en tres direcciones o mediante el uso de una placa de rotador automático. </li></ol></li><li> Aplicación de los discos antimicrobianos en placas de agar inoculadas. <ol><li> Aplicar de cerca los discos en la superficie de las placas de agar inoculadas secas manualmente o mediante un dispensador de disco de susceptibilidad. </li><li> Incubar la placa a la tempe apropiadaratura ambiente y como se describe en el método de difusión en disco EUCAST las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (versión 3.0, abril de 2013, www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5. automatizado PCR-basado de prueba de diagnóstico para la detección de MRSA <ol><li> Usando una micropipeta, transferir 50 l de la pastilla de cultivo de sangre en el frasco de reactivo de ejemplo proporcionado con el kit de prueba de MRSA automatizado de diagnóstico basado en la PCR y agitar durante 20 seg. </li><li> Usando una micropipeta de 1 ml, dispensar la muestra en el puerto de muestra del cartucho. Insertar el cartucho en el sistema de PCR automatizado e iniciar el ensayo como se describe por el fabricante. </li></ol>

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<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En comparación con los métodos de diagnóstico de hemocultivos positivos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano utilizando el cloruro de enfoque centrifugación lisis de amonio a reducir el tiempo para informar de identificación en un 16 a 24 horas y el tiempo de reportar AST por 24 a 48 horas (Figuras 1 y 3). Rápida introducción de la terapia antibiótica adecuada es fundamental para mejorar el pronóstico de los pacientes que sufren de infecciones del...

Infecciones del torrente sanguíneo y la sepsis en pacientes hospitalizados son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Por lo tanto, se observa la mortalidad relacionada con infecciones del torrente sanguíneo en aproximadamente 14% a 37% de los pacientes hospitalizados y puede aumentar hasta el 35% en las unidades de cuidados intensivos de los pacientes 1-3. La identificación rápida del agente infeccioso es fundamental para orientar el tratamiento antimicrobiano óptimo y para aumentar el éxito de la terapia antimicrobiana 4,5. El rápido análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo ya tiene un impacto significativo en la adaptación de la terapia antimicrobiana 6,7 pero la identificación precisa del agente infeccioso que se requiere para proporcionar el tratamiento antibiótico más adecuado a las pacientes. Por ejemplo, diferentes regímenes de tratamiento con antibióticos tienen que ser aplicadas tras bacteriemia con enterococos y estreptococos que son difíciles de distinguir por la tinción de Gram. Del mismo modo, la identificación de las especies LevEL es necesario para detectar enterobacterias Gram negativo que codifica un gen cromosómico ampC que confieren una mayor resistencia a β-lactámicos 8. Con un hemocultivo positivo, el enfoque de diagnóstico convencional es subcultura del agente infeccioso en diferentes placas de agar, que requiere varias horas de incubación adicional previa identificación con diversos enfoques, incluyendo pruebas bioquímicas, el crecimiento en diferentes medios selectivos y sistemas de identificación microbiana automatizados. El tiempo de los resultados de un enfoque de diagnóstico convencional es de aproximadamente 1 a 3 días. La aparición de la tecnología de desorción láser asistida por matriz / espectrometría de masas de tiempo de vuelo-ionización (MALDI-TOF) para la identificación rápida de microorganismos ha proporcionado una nueva herramienta para identificar rápidamente los microorganismos de colonias crecidas en placas de agar sino también directamente a partir de sangre positivo culturas (Figura 1) 9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar un agente infeccioso a partir de cultivos de sangre se ha reducido significativamente el tiempo a los resultados a unos pocos minutos en lugar de las horas y los días requeridos por los métodos tradicionales. Como se discutió por Croxatto et al. 13, la eficiencia de identificación MALDI-TOF se basa en diferentes parámetros, incluyendo la pureza y la cantidad de microorganismo. Estos dos criterios se obtienen fácilmente a partir de colonias discretas cultivadas en placas de agar, pero requiere un tratamiento de pre-analítica para el enriquecimiento bacteriana y purificación a partir de muestras complejas, tales como cultivo de sangre, que contienen múltiples componentes celulares y proteínas que pueden interferir con la identificación MALDI-TOF. Varios métodos de aislamiento de microorganismos a partir de cultivo de sangre se han utilizado en una serie de estudios que incluyen saponina u otro método detergentes suaves para la extracción bacteriana 9,14, el método de separador de suero 10, la lisis métodos de centrifugación 12 </sarriba&gt; y soluciones comercialmente, tales como el kit de sepsityper. Nuestro laboratorio de diagnóstico bacteriológico ha desarrollado una preparación sedimento bacteriano sencilla hemocultivo a base de cloruro de amonio-lisis de los eritrocitos, que permiten la identificación rápida de bacterias y levaduras por MALDI-TOF y los sistemas de identificación automáticos (Figura 2) 15. Esta preparación de pellets de hemocultivo también proporcionar una muestra para otras aplicaciones posteriores directos tales como la tinción de Gram, pruebas de diagnóstico basados ​​en PCR automatizados, como el POCT-PCR para la detección rápida de la meticilina-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos con sistemas automatizados de AST y / o por ensayos de difusión de disco en placas de agar (Figura 3). En este trabajo se describen los diferentes pasos para la preparación del sedimento bacteriano hemocultivos según ha explicado Prod&#39;hom et al. 15 (Figura 4). También vamos a desescriba los protocolos para tres de las principales aplicaciones que se pueden realizar en el sedimento de la cultura de la sangre: La identificación por MALDI-TOF 15, la identificación (ID) y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) con los sistemas automatizados 16 para enterobacterias y estafilococos y PCR automatizada prueba de diagnóstico basado en la detección de MRSA 17.

<table><tbody><tr><td>Aguja de 20 g</td><td>Terumo, Lovaina, Bélgica</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Falcon</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU</td>. <td>352070</td><td>Tubos de centrífuga de 50 ml Cloruro de</td></tr><tr><td>amonio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de potasio</td><td>Fluka, St. Louis, MO, EE. UU. &nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. &nbsp;</td><td>F0507</td><td>Inflamable, corrosivo</td></tr><tr><td>&#945;-Ácido ciano-4-hidroxicinámico</td><td>Fluka, St. Louis, MO, EE. UU.&nbsp;</td><td>70990</td><td>Toxicidad aguda</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. &nbsp;</td><td>271004</td><td>Inflamable, toxicidad aguda</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. &nbsp;</td><td>T6508</td><td>Corrosivo, toxicidad aguda</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 instrumento</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>27202</td><td>instrumento de sistema microbiano automatizado</td></tr><tr><td>Vitek 2 tarjeta Gram-positivo (GP)</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>21342</td><td>tarjeta de identificación GP&nbsp; automatizada</td></tr><tr><td>Vitek 2 tarjeta AST-P580</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>22233</td><td>sistema AST microbiano automatizado</td></tr><tr><td>Vitek 2 tarjeta Gram-negativo (GN)</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>21341</td><td>tarjeta de identificación GN&nbsp;</td></tr><tr><td>automatizada Vitek 2 tarjeta AST-N242</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>413391</td><td>sistema AST microbiano automatizado</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, EE. UU</td><td>. &nbsp; GXMRSA-100N-10 tecnología de</td><td>amplificación de ácidos nucleicos MRSA</td></tr><tr><td>Instrumento GeneXpert IV</td><td>Cepheid, Sunnyvale, CA, EE. UU.</td><td>Instrumento de tecnología de amplificación de ácidos nucleicos</td><td>GXIV-4-D</td></tr><tr><td>Instrumento Microflex LT MALDI-TOF MS Bruker</td><td>Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 acero objetivo BC</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>280799</td><td>Placa de objetivo MALDI</td></tr><tr><td>Densitómetro Instrumento Densicheck</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey agar</td><td>Biolife, Milán, Italia</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Agar Mueller-Hinton</td><td>Oxoid, Hampshire, Inglaterra</td><td>CM0337</td><td>Agar Mueller-Hinton (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar MHF</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>43901</td><td>Agar Mueller-Hinton agar organismos fastidiosos (MHF)</td></tr><tr><td>BD Agar Columbia III</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.</td><td>254071</td><td>agar sangre</td></tr><tr><td>BD agar chocolate</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.</td><td>254089</td><td>agar chocolate</td></tr><tr><td>BD Agar Schaedler</td><td>BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU</td>. <td>254084</td><td>Agar Schaedler</td></tr></tbody></table>

preparación de una cultura de pellets de sangre para rapid bacteriana identificación y prueba de susceptibilidad a los antibióticos

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Infecciones del torrente sanguíneo y sepsis son una causa importante de morbilidad y mortalidad. El resultado exitoso de los pacientes que sufren de bacteremia depende de una rápida identificación del agente infeccioso para guiar el tratamiento antibiótico óptimo. El análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo puede llevar a cabo con rapidez y ya afecta significativamente el régimen de antibióticos. Sin embargo, todavía se requiere la identificación precisa del agente infeccioso para establecer el tratamiento óptimo de destino. Se presenta aquí una preparación sedimento bacteriano simple y rápido de un cultivo de sangre positivo que puede ser utilizado como una muestra para varias aplicaciones posteriores esenciales tales como la identificación por MALDI-TOF MS, las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) por ensayo de difusión en disco o sistemas automatizados de AST y por PCR automatizado basado en pruebas de diagnóstico. El rendimiento de estos diferentes sistemas de identificación y AST aplicados directamente sobre los sedimentos bacterianos de cultivo de sangre es muy SIMilar con el rendimiento que se obtiene normalmente a partir de colonias aisladas cultivadas en placas de agar. En comparación con los métodos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano se reduce significativamente el tiempo para reportar tanto la identificación y AST. Así, siguiendo la positividad del cultivo de sangre, identificación por MALDI-TOF puede ser reportado en menos de 1 hora mientras que los resultados de AST por sistemas automatizados AST o ensayos de difusión en disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Del mismo modo, los resultados de un ensayo rápido basado en la PCR se pueden comunicar a los médicos a menos de 2 horas tras el informe de una bacteriemia. Juntos, estos resultados demuestran que la rápida preparación de un sedimento bacteriano cultivo de sangre tiene un impacto significativo en el tiempo de identificación y de respuesta AST y por tanto en el resultado exitoso de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

En el estudio realizado por Prod'hom et al. 15, sedimentos bacterianos obtenidos por cloruro de amonio lisis centrifugación de 122 hemocultivo positivo de 78 pacientes se analizaron por MALDI-TOF MS. Fuera de 122 hemocultivos positivos, 95 (77,9%) fueron correctamente identificados a nivel de especie y uno (0,8%) a nivel de género. Los 26 (21,3%) Bolitas de hemocultivo restantes no dieron ninguna identificación fiable por MALDI-TOF. Entre ellos, 21 eran bacterias gram positivas incluyendo 13 estrepto...

Una preparación rápida sedimento bacteriano de un cultivo de sangre positivo puede ser utilizado como una muestra para aplicaciones tales como la identificación por MALDI-TOF, la tinción de Gram, la prueba de susceptibilidad a los antibióticos y prueba basada en PCR. Los resultados pueden ser comunicados rápidamente a los médicos a mejorar el resultado de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar una pastilla bacteriana a partir de un hemocultivo positivo que pueda utilizarse como muestra para diversas aplicaciones. Esto se logra mezclando primero un hemocultivo positivo con agua estéril después de la centrifugación. El pellet se resuspende en cloruro de amonio para piojos de los glóbulos rojos después de una segunda ronda de centrifugación.El pellet se resuspende en agua. El paso final es utilizar el pellet obtenido para la identificación bacteriana mediante ionización por desorción láser asistida por matriz, tiempo de vuelo, tinción de Gram, pruebas de susceptibilidad a los antibióticos y/o pruebas basadas en PCR. En última instancia, los resultados obtenidos se pueden comunicar rápidamente a los médicos para mejorar el resultado de los pacientes que sufren infecciones del torrente sanguíneo.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el subcultivo bacteriano de hemocultivos positivos, es reducir la identificación bacteriana en aproximadamente seis a 24 horas y reducir el tiempo hasta los resultados de resistencia a los antibióticos en aproximadamente 24 horas. Este método puede ayudar a adaptar rápidamente el tratamiento antibiótico y mejorar el resultado de los pacientes que sufren infecciones del torrente sanguíneo. Aunque este método puede aplicarse a los métodos de identificación rutinarios, como la OV, y a los enfoques convencionales de pruebas de sostenibilidad antimicrobiana, también puede aplicarse a nuevas tecnologías destinadas a la mejora de los factores VUL y/o a los mecanismos resistentes, como las actividades de ESBL y CARBAPENEMASA.La demostración visual de este método es importante ya que la preparación bacteriana de PAL es crucial para obtener suficiente material microbiano para aplicaciones posteriores, la demostración del procedimiento estará a cargo de Christian Durel, Maria Cortesi, Maria ti y Kim Giza, todos ellos técnicos de laboratorio de mi laboratorio. Esterilice el tapón del hemocultivo añadiendo un 70%etanol en el tapón del frasco y quemándolo. A continuación, mueva el frasco a una campana de flujo laminar.Recoja cinco mililitros del hemocultivo con una jeringa de aguja de calibre 20. A continuación, añada los cinco mililitros de hemocultivo a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga 45 mililitros de agua estéril y mezcle la muestra. Centrifugar la muestra a 1000 Gs durante 10 minutos.A temperatura ambiente, retire el sobrenadante con una bomba de vacío de laboratorio. Luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de cloruro de amonio casero. Solución de lisis.Descomponga el gránulo raspando y agitando en vórtice antes de centrifusionar la muestra a 140 g durante 10 minutos A temperatura ambiente después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, que contiene principalmente restos de glóbulos rojos. Si el pellet permaneció hemorrágico Resus, suspenda el pellet en dos mililitros de agua estéril y destilada para piojos aún más los glóbulos rojos residuales y para lavar el pellet después de centrifugar la muestra como antes, deseche el sobrenadante, luego vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de agua y agite el tubo para la identificación directa del pellet de sangre. Primero, transfiera un microlitro del pellet a una placa objetivo MALDI y déjelo secar en una plataforma de calentamiento a 42 grados centígrados.Superponga la muestra con un microlitro de ácido fórmico al 70% y déjela secar en la plataforma de calentamiento. A continuación, superponga la muestra con un microlitro de Maldi Matrixx y, de nuevo, déjela secar en la plataforma de calentamiento. Proceda al análisis de maldi TOF MS con un sistema MALDI TOF MS tal y como lo describen los fabricantes.Si la puntuación de identificación no es válida a nivel de especie, realice una extracción de proteínas de la muestra de gránulos de sangre mezclando primero 20 microlitros del gránulo con un mililitro de etanol al 70%. A continuación, centrifugar la muestra a 13.000 Gs durante dos minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y añadir 25 microlitros de ácido fórmico al 70% y 25 microlitros de nitrilo acetoaceto al 100% al vórtice de pellets vigorosamente para resuspender el pellet tras la centrifugación a 13.000 Gs durante dos minutos. A temperatura ambiente, transfiera un microlitro del sobrenadante a una placa objetivo MALDI y déjelo secar en una plataforma de calentamiento a 42 grados centígrados.Para realizar la identificación bacteriana y las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos o una ST primero, prepare un tubo de plástico que contenga tres mililitros de solución estéril de cloruro de sodio al 0,45% compatible con el sistema microbiano automatizado. Agregue un volumen suficiente de la pastilla de cultivo de sangre a la solución y al vórtice para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8 medida con una máquina densitómetro. A continuación, inocule las tarjetas grampositivas o gramnegativas automatizadas para su identificación.También inocule las tarjetas automatizadas a ST para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de cocos grampositivos y bacterias gramnegativas según lo descrito por el fabricante. Realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos mediante ensayo de difusión en disco. Primero, prepare un tubo de vidrio que contenga tres mililitros de solución estéril de cloruro de sodio al 0,9%.A continuación, añada a la solución un volumen suficiente de la pastilla de hemocultivo para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez de McFarland de 0,5 medida por una máquina densitómetro. Agitar la suspensión bacteriana para inocular la suspensión bacteriana. Primero, sumerja un hisopo de algodón estéril en la suspensión bacteriana y elimine suavemente el exceso de líquido girando el hisopo en la pared interior del tubo de vidrio.A continuación, extienda la suspensión bacteriana de manera uniforme por toda la superficie de Mueller. Sugerencia y barrena o Sugerencia y barrena de Mueller para organismos fastidiosos mediante hisopado en tres direcciones o mediante el uso de un rotador de placa automatizado para la aplicación de discos antimicrobianos en placas de barrena inoculadas. En primer lugar, aplique los discos estrechamente sobre la superficie de las placas de barrena inoculadas secas de forma manual o utilizando un dispensador de discos de susceptibilidad.A continuación, incubar la placa a la temperatura y atmósfera adecuadas, tal y como se describe en el método de difusión en disco del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos para realizar la prueba diagnóstica automatizada basada en PCR. En primer lugar, utilice una micropipeta para transferir 50 microlitros del pellet de hemocultivo al vial de reactivo de muestra provisto con el kit de prueba de diagnóstico basado en PCR automatizada MSA. A continuación, agite el vial durante 20 segundos con una micropipeta de un mililitro.Dispense la muestra en el puerto de muestra del cartucho. Inserte el cartucho en el sistema de PCR automatizado e inicie el ensayo según lo descrito por el fabricante en el laboratorio de Lausana. El resultado se valida directamente y se transmite a los médicos gracias a la conectividad del sistema de PCR automatizado utilizado con un sistema de interfaz de laboratorio o LIS.Si un resultado no es válido, recomendamos repetir el ensayo después de diluir diez veces el gránulo bacteriano. Dado que esto a menudo se debe a los inhibidores de la PCR, la hemólisis de cloruro de amonio produjo un pellet de hemocultivo de muy alta calidad con pocos restos de eritrocitos en comparación con el control negativo sin cloruro de amonio. Antes y después de la preparación del hemocultivo se realizó tinción de Gram de hemocultivo positivo de Escher coli coagulasa Staphylococcus capita negativo y EA de disco estreptococo.La preparación bacteriana del gránulo mediante este enfoque permite concentrar el microorganismo entre 100 y 1000 veces. En general, hay varias aplicaciones posteriores que se pueden realizar a partir de la pastilla de hemocultivo, que se benefician de un tiempo reducido para obtener resultados sin reducción de la sensibilidad y la especificidad en comparación con los ensayos realizados en colonias aisladas. Una vez dominado el paté, la preparación se puede hacer en unos 30 minutos si se realiza correctamente.No olvide que trabajar con hemocultivo puede ser extremadamente peligroso y se deben tomar precauciones como trabajar con guantes y una capucha de flujo debajo de la laina al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo rápido para la identificación directa de Enterococcus faecalis y otras especies de Enterococcus en un hemocultivo positivo con un ácido péptido nucleico ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH ANP).

Un procedimiento de 1,5 horas para la identificación de Enterococcus Especies directamente los cultivos de sangre

El diseño de un esquema de flujo de trabajo sencillo de un día para el diagnóstico de patógenos bacterianos permite el reconocimiento rápido de infecciones del torrente sanguíneo. La inclusión de los ocho objetivos bacterianos clínicamente relevantes y sus perfiles de resistencia a los antibióticos ofrece al clínico una visión inicial en el mismo día, que puede conducir a una terapia más adecuada.

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

Fuente: Koeth, L. M., et. al., Un método de microdilución de caldo de referencia para pruebas de susceptibilidad in vitro a dalbavancina de bacterias que crecen aeróbicamente. J. Vis. Exp. (2015).Este video demuestra el método de microdilución en caldo para determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico lipoglicopéptido contra bacterias grampositivas. Cubre el aislamiento de colonias bacterianas, la dilución, la inoculación de pocillos de microplacas con diferentes...

Un método de microdilución en caldo para pruebas de susceptibilidad a antibióticos de bacterias grampositivas

La aplicación de láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas (MS) directamente a caldo de cultivo de sangre acelera la identificación de bacterias. El método presentado es un método rápido y fiable para la identificación de bacterias Gram negativas directamente desde el caldo de cultivo de sangre.

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

Prueba de sinergia antimicrobiana se utiliza para evaluar el efecto de dos o más antibióticos se usan en combinación y se realiza generalmente mediante uno de dos métodos: la matriz de tablero de ajedrez o el ensayo de tiempo de matar. Aquí, presentamos un automatizado, de inyección de tinta impresora-asistida tablero matriz sinergia técnica y un estudio clásico matar tiempo de sinergia.

Sinergia antimicrobiana prueba asistida por la impresora de inyección de tinta matriz tablero automatizado y el método Manual de tiempo de matar

Los antibióticos etiquetados fluorescentemente son herramientas poderosas que se pueden utilizar para estudiar múltiples aspectos de la resistencia a los antimicrobianos. Este artículo describe la preparación de antibióticos etiquetados fluorescentemente y su aplicación para estudiar la resistencia a los antibióticos en bacterias. Las sondas se pueden utilizar para estudiar mecanismos de resistencia bacteriana (por ejemplo, eflujo) por espectrofotometría, citometría de flujo y microscopía.

Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D2O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos del agua y la caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (ARG). El uso de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico) proporciona información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en aguas dulces de Mumbai, India.

Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

EUCAST ha desarrollado un protocolo de pruebas directas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) para hemocultivos automatizados. Sin embargo, su dependencia de la identificación microbiana basada en espectrometría de masas puede evitarse mediante el uso de un protocolo de preparación directa de inóculo en un sistema automatizado de identificación microbiana. Este enfoque puede proporcionar informes AST dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de la muestra.

Identificación microbiana directa mediante un sistema automatizado de identificación microbiana para facilitar el método EUCAST RAST sin espectrometría de masas

Aprende a preparar pellets bacterianos a partir de hemocultivos positivos mediante centrifugación y lisis con cloruro de amonio. Este método permite identificación rápida por MALDI-TOF y pruebas de susceptibilidad antibiótica.

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos (Video) | JoVE Journal

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