Módulo de iluminación solo plano y Aproximación Micro-capilar para un microscopio de campo amplio

El objetivo general de este procedimiento es realizar microscopía de iluminación de plano único utilizando un módulo de excitación de lámina de luz para microscopios invertidos y aplicarlo a esferoides celulares tridimensionales. Esto se logra utilizando primero una pipeta para transferir un esferoide celular desde el pocillo de una placa de microtitulación a un segundo pocillo para incubar después del lavado. A continuación, el esferoide S se introduce en un capilar rectangular.

El segundo paso es montar el módulo de iluminación de lámina de luz en la placa base de la mesa de posicionamiento del microscopio invertido. A continuación, el capilar que contiene el esteroide se coloca en un soporte de muestras especial para microscopía. El paso final es establecer la coincidencia entre la lámina de luz y el plano focal de la lente del objetivo del microscopio en la ruta de detección.

En última instancia, las mediciones de fluorescencia tridimensional se pueden realizar mediante la variación del plano focal dentro del esferoide celular para obtener información de imágenes individuales o Zacks sobre la absorción de fármacos o la estructura del esferoide S. La principal ventaja de esta técnica frente a los microscopios de lámina de luz existentes es que es rentable y muy versátil, ya que consiste en un módulo que se puede adaptar a un microscopio existente y proporciona un gran grado de libertad para la investigación. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la investigación de fármacos y agentes utilizados para la terapia y el diagnóstico, en particular, ya que la adaptación del sistema microfluídico permite la investigación de procesos rápidos en condiciones de flujo.

Ahora, este método de excitación, en combinación con cualquier técnica de detección, puede proporcionar información sobre los esteroides de células vivas en dosis de poca luz. También se puede aplicar a otros sistemas vivos como peces cipro, embriones de artila, así como muestras ópticas de tejido CLE. Para comenzar, agregue 50 microlitros de aeros calentado 1.5 aeros en medio de cultivo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y deje que se solidifique durante una o dos horas.

A continuación, siembre unas 150 células de cáncer de mama MCF siete en cada pocillo de la placa bruta de 96 pocillos preparada durante cinco a siete días, hasta un diámetro de unos 200 a 300 micrómetros en una incubadora al 5% de dióxido de carbono y a 37 grados centígrados. A continuación, incubar los esteroides celulares con el antibiótico antraciclina clorhidrato de doxorrubicina durante seis horas a una concentración que oscila entre dos micromolares y ocho micromolares en cultivo. Medio Después de la incubación, lavar las células OID con cultivo, medio o solución salina de equilibrio de Earl antes de la microscopía.

Utilice un microscopio invertido y monte el módulo de excitación de microscopía de iluminación de plano único o SPM en la placa base de la mesa de posicionamiento. Equipe el microscopio con una lente de objetivo de microscopio de aumento de 10 o 20 veces y un filtro de paso largo adecuado en la ruta de detección del microscopio. A continuación, monte una cámara integradora en el puerto de detección del microscopio.

Utilice un haz paralelo intercalado de un láser o un diodo láser con una longitud de onda de excitación de preferentemente 470 nanómetros y aplíquelo al módulo de espín. A continuación, gire la lente cilíndrica 90 grados, lo que transfiere la hoja de luz a una posición vertical para un ajuste axial de la cintura del haz de la hoja de luz. Coloque un capilar que contenga un líquido con un tinte fluorescente en el portamuestras.

Fije el portamuestras con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio. Alinee la posición del capilar de modo que esté centrado y la cintura del haz de la lámina de luz esté enfocada. Ajuste la cintura del haz variando la posición axial de la propia lente cilíndrica.

Gire la lente hacia atrás después del ajuste. Coloque el esteroide celular por separado o en grupos dentro de capilares rectangulares de vidrio de silicato bo con una sección transversal interna de 600 por 600 micrómetros y un espesor de pared de 120 micrómetros. Para lograr esto, tome el capilar vacío en posición vertical con el pulgar y el dedo medio y selle la abertura superior con el índice.

Acerque la abertura inferior al esferoide de la célula en su líquido circundante, libere el dedo índice del líquido de apertura superior con el esteroide adentro. Será absorbido inmediatamente por las fuerzas capilares. Ajuste la posición del esferoide S dentro del capilar lleno por gravitación.

Alternativamente, aplique el esteroide al capilar mediante pipeteo. Tenga cuidado de que la abertura de la punta de la pipeta sea, por un lado, lo suficientemente grande para el tamaño del esferoide S y, por otro lado, de tamaño menor o igual al diámetro interior del capilar. A continuación, coloque el capilar que contiene el esferoide S en un portamuestras especial de microscopía.

Fije el portamuestras con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio y alinee la posición del esteroide celular de modo que quede centrada y enfocada. Establezca la coincidencia entre la hoja de luz y el plano focal de la lente del objetivo del microscopio en la ruta de detección ajustando la posición del espejo de reflexión y la lente cilíndrica. Llene el capilar con suero de ternera fetal o FCS durante 30 minutos para apoyar la adhesión celular posterior de un esteroide celular a la superficie interna del vidrio.

Deje que el recubrimiento restante de FCS en el capilar agotado se seque durante al menos 12 horas después de introducir el esteroide celular en el capilar recubierto de FCS. Al igual que antes, deje el capilar en la incubadora durante dos a cuatro horas adicionales para provocar la adhesión celular del esteroide. A continuación, configure la parte flx del sistema microfluídico, incluida una trampa de burbujas.

Use una bomba peristáltica para llenar el tubo con un medio de cultivo que contenga el fármaco o agente colorante fluorescente. Primero sujete el capilar sin burbujas al tubo de eflujo y luego sujete el otro lado del capilar al tubo de drenaje. Ajuste la temperatura del líquido del baño de agua al valor deseado.

A continuación, ajuste la bomba peristáltica a la velocidad de bombeo deseada. Recoja el líquido bombeado en un recipiente con una configuración de circuito abierto para la adquisición y el análisis de datos. Ajuste la potencia del láser y el tiempo de integración para la adquisición de imágenes.

Establezca el incremento de la pila ZS en un valor entre cinco y 10 micrómetros, que es preferible para el análisis de datos tridimensionales. Como el espesor de la lámina de luz es de aproximadamente 10 micrómetros, se procede a realizar mediciones de imágenes individuales o Zacks por variación del plano focal dentro del esteroide celular. Se muestra una exploración de Zack de un esteroide mc de siete células previamente incubado con doxorrubicina de ocho micromolares durante seis horas.

Las imágenes proporcionan información detallada sobre la absorción y distribución celular de la doxorrubicina y su degradación. El producto dentro de la capa celular externa de la doxorrubicina fluorescente roja esteroide se localiza principalmente en el núcleo, mientras que en las áreas internas de sphe roid, el fluorescente verde presentado por un producto de degradación se vuelve dominante en la membrana celular. La absorción del fármaco quimioterapéutico doxorrubicina en la célula S de cáncer de mama humano mc seven nativo se representa para una sola capa celular seleccionada por spm.

Tras la aplicación de dos medios micromolares y de cultivo dentro del sistema de flujo, la fluorescencia roja y verde de la doxorrubicina y su producto de degradación aumentó continuamente tras la aplicación de dos doxorrubicina micromolares en el medio de cultivo dentro del sistema de flujo, la fluorescencia roja y verde de la doxorrubicina y su producto de degradación aumentaron continuamente. Una vez masterizado, solo se necesitan unos minutos desde el montaje del módulo de eliminación de láminas de luz hasta la grabación de imágenes fluorescentes de muestras en 3D. Al medir y determinar las condiciones de flujo, lo más importante es asegurarse de que la muestra se adhiera a la superficie interna del capilar y evitar que lleguen burbujas de aire a la muestra que puedan desprenderla del capilar.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la microscopía de iluminación de láminas de luz con el módulo versátil adaptable a varios microscopios.