De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

El objetivo general de este procedimiento es medir la ley de difusión de lípidos y proteínas en las membranas de las células vivas para hacer esto. En primer lugar, la función de dispersión puntual del microscopio se calibra mediante la obtención de imágenes de perlas fluorescentes nanoscópicas. A continuación, se preparan vectores basados en liposomas, incluida una molécula de interés marcada con fluorescencia, y se introducen en células vivas mediante transfección o incorporación directa.

La obtención rápida de imágenes de la membrana plasmática de células vivas se realiza mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Finalmente, se calcula la función de correlación y se extrae la ley de difusión molecular mediante ajuste gaussiano. Los datos resultantes.

Identificar el modo de movimiento del lípido o proteína bajo investigación. La principal ventaja de esta técnica sobre la recuperación de fluorescencia convencional después del enfoque de fotoblanqueo o la espectroscopia clásica de correlación de fluorescencia de un solo punto es que permite medir la ley de difusión molecular. Sabemos que el conocimiento es prioritario del sistema.

También a diferencia de las metodologías clásicas de seguimiento de una sola partícula. Aquí, el desplazamiento mular se mide sin necesidad de extraer las trayectorias de las partículas. Como consecuencia, este metal se puede utilizar fácilmente en combinación con moléculas relativamente densas como, por ejemplo, las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente.

En general, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular celular, como por ejemplo, cómo el movimiento de las proteínas o los lípidos regula la estructura de la membrana plasmática y la organización funcional, la respuesta a estas y otras preguntas relacionadas estará disponible para todos y, mediante el uso de solo un microscopio comercial, la demostración del procedimiento general será realizada por zo, un estudiante de doctorado del laboratorio. Comience este protocolo calibrando la función de dispersión de puntos del sistema de imágenes. Comience diluyendo 10 microlitros de una solución de perlas fluorescentes en 90 microlitros de agua destilada previamente agregada a un tubo de centrífuga de 500 microlitros.

Sonicar la solución durante 20 minutos en un baño de sauna con un bisturí, cortar un trozo cuadrado de un centímetro de gel de rosas AGA al 3% y colocarlo en una placa de Petri. Deposite 10 microlitros de la solución de perlas fluorescentes diluidas en la parte superior del gel. Luego, con pinzas, invierta la pieza de gel en una placa de Petri de vidrio de dos centímetros.

De nuevo, usando fórceps. Empuja hacia abajo el trozo de gel para dispersar la gota. A continuación, encienda la configuración de adquisición, que consiste en un microscopio comercial de fluorescencia de reflexión interna total.

Equipado con una incubadora y una rápida cámara E-M-C-C-D conectada a una computadora que ejecuta una suite de aplicaciones, software fluorescente avanzado y / o software de adquisición de imágenes Solís. Coloque la muestra en el soporte de la platina del microscopio utilizando la pieza I y la luz transmitida. Concéntrate en el borde del gel.

A continuación, centre el gel sobre el objetivo y ajuste el enfoque para iniciar el procedimiento de alineación láser en el conjunto de aplicaciones Leica, el software fluorescente avanzado, seleccione la alineación automática y siga el procedimiento de alineación automática. Una vez que el láser se haya alineado en el software de adquisición y/o Solís, haga clic en el botón de configuración. Se abrirá una ventana.

Establezca la exposición de la cámara en 100 milisegundos, la EM ganada en 1000, la repetición en 100 y marque la casilla de verificación de transferencia de fotogramas. A continuación, haga clic en la ventana de guardado automático e inserte el nombre del experimento. Encuentre un campo de visión con puntos individuales aislados.

Concéntrese en un punto brillante, que generalmente representa un agregado de cuentas. A continuación, adquiera 100 fotogramas. Repita este paso cinco o seis veces para obtener imágenes de varios puntos individuales.

Importe las series adquiridas a un programa de procesamiento de datos como MATLAB y promedie la pila en el tiempo. A continuación, visualice la imagen de intensidad media medida. Acérquese a un punto fluorescente pequeño y brillante e identifique aproximadamente el centro como el píxel más brillante del punto.

Finalmente, seleccione el tamaño de la región de interés que desea dibujar alrededor de la partícula, generalmente una micra al lado para ajustarse a la distribución de intensidad seleccionada con una función gaussiana. Seleccione el comando gause fit. Inspeccione los residuos obtenidos para verificar la bondad del ajuste.

Por último, calibre la cámara como se describe en el documento adjunto. Una vez calibrado el sistema, es el momento de etiquetar las celdas para la adquisición de imágenes. Comience a preparar los liposomas necesarios para la incorporación de lípidos disolviendo un miligramo de DOPE, un miligramo de D-O-T-A-P y un miligramo de PPE ADO 4 88 cada uno en un tubo de microcentrífuga separado que contenga un mililitro de cloroformo.

A continuación, combine 0,5 mililitros de cada una de las soluciones DOPE y D-O-T-A-P con 25 microlitros de solución PPE ATO 4 88. Coloque el tubo en un evaporador centrífugo e inicie el centrifugado a 280 gs. Encienda la bomba de vacío y déjela girar durante 24 horas.

Al día siguiente, agregue 0,5 mililitros de tampón heis de 20 milimolares al tubo y tórtelo durante 15 minutos. A continuación, coloque el tubo en un baño sónico y sonique durante 15 minutos a 40 grados centígrados. Para preparar las células, lave tres veces un plato P 100 de ovario de hámster chino confluente o CHOK una celdas con 10 mililitros de PBS.

A continuación, añadir un mililitro de tripsina e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue nueve mililitros de D-M-E-M-F 12 suplementado con un 10% de FBS para suspender las células de siembra de 150 microlitros de esta solución que contiene células. En una placa de Petri con fondo de vidrio de 22 milímetros que contiene 800 microlitros del mismo medio.

Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Para la incorporación de lípidos, reemplace el medio celular con 500 microlitros de medio libre de suero e incube durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue dos microlitros de solución de liposomas e incube durante otros 15 minutos.

A continuación, lave las células con PBS y añada un nuevo DM EMF 12. Antes de tomar imágenes al menos 12 horas antes del experimento, encienda la incubadora de microscopios para que la etapa del microscopio y los componentes ópticos alcancen la temperatura experimental. El paso más difícil de este procedimiento es esa adquisición.

Para garantizar el éxito, asegúrese de optimizar todos los parámetros de adquisición del sistema. En estudio. El día del experimento, encienda el microscopio, espere a que las cámaras alcancen la temperatura de trabajo.

Para realizar el experimento, utilizaremos dos cámaras. La cámara uno se utilizará para la toma de imágenes y la cámara dos se utilizará para seleccionar la celda. Esta configuración permitirá el tiempo de adquisición más rápido posible en el software.

Para establecer los parámetros de las imágenes de luz transmitida. Introduzca 20 milisegundos Para el tiempo de exposición, introduzca uno para la ganancia EM de ambas cámaras. Luego abra la ventana de modo de contraste en el software y salió.

Haga clic en BF para seleccionar la opción de campo brillante. Coloque las muestras en el soporte mientras visualiza la muestra a través de los oculares. Enfoca la muestra.

A continuación, envíe manualmente la luz a la cámara uno y empuje suavemente las ranuras para que sólo se ilumine el ROI que se va a fotografiar. A continuación, mueva una celda a la región seleccionada y, utilizando el software, envíe la luz a la cámara dos. Luego, en el software, dibuje un ROI para generar una referencia.

Primero, para alinear el láser por software, seleccione alineación automática. A continuación, para iniciar el procedimiento de alineación automática, seleccione habilitar colimador. A continuación, abra la incubadora en la parte superior y colime el rayo láser.

Cuando el láser esté alineado en la esquina inferior izquierda de la ventana del software a la izquierda, haga clic en el botón 70 para establecer la profundidad de penetración en 70 nanómetros. Esto corresponderá a un ángulo de incidencia del láser en el cristal inferior de unos 70 grados en el conjunto de aplicaciones de Leica. Cuadro de texto de tiempo de exposición de software fluorescente avanzado.

Introduzca 70 milisegundos en el cuadro de texto EM gain. Ingrese 1000 para hacer lo mismo en la cámara dos. Abra la ventana de configuración e introduzca los mismos números en los cuadros de texto correspondientes.

A continuación, haga clic en el botón en vivo. La fluorescencia se enviará a la cámara uno y aparecerá una imagen de la muestra en la pantalla. Mueva la muestra hasta que una célula fluorescente alcance la región de referencia de interés.

Luego presione el botón en la parte frontal del cuerpo del microscopio para enviar la luz a la cámara dos y mueva la rueda de posición Z con precisión para enfocar la membrana celular en el software o el software. Abra la ventana de configuración y configure el tiempo de exposición mínimo alcanzable 1000 EM ganancia recortada modo de sensor 10 a la quinta repetición, y configure la opción de guardado automático para comenzar a adquirir la serie de imágenes. Haga clic en el icono de la cámara del software y espere a que finalice la adquisición.

A continuación, abra la ventana de configuración, desactive la ganancia EM y elimine la marca de verificación de la opción de modo recortado. Durante la adquisición, la temperatura de la cámara suele aumentar entre dos y tres grados. Por lo tanto, antes de adquirir imágenes de una nueva celda, espere hasta que se alcance la temperatura óptima de trabajo.

Una vez completadas las imágenes, siga las instrucciones del documento adjunto para calcular el desplazamiento cuadrático medio de las imágenes para obtener una variante marcada con fluorescencia de la molécula de interés. Las células CHOK one se marcaron con ADO 4 88 PPE o se transfectaron con una transferencia en el receptor o T-F-R-G-F-P y se obtuvieron imágenes mediante TIRF como se describe en este video. Como se puede ver aquí, la ley de difusión medida para ADO 4 88 PPE es plana, lo que indica una difusión mayoritariamente libre, como se ha demostrado anteriormente mediante fluorescencia de agotamiento de emisión estimulada, espectroscopia de correlación o mediciones de FCS estables después de la transfección con el T-F-R-G-F-P, la ley de difusión medida para T-F-R-G-F-P es inicialmente plana, permaneciendo por debajo de los 100 nanómetros de desplazamiento molecular promedio con un coeficiente de difusión aparente promedio de aproximadamente 0,7 micras cuadradas por segundo.

A esto le sigue una rápida disminución de la difusividad aparente hasta 0,2 micras cuadradas por segundo. El valor medido típicamente por FCS limitado por difracción. Es interesante notar que, como lo muestra este último ejemplo, el enfoque actual puede medir fácilmente el desplazamiento molecular promedio con una resolución de unas pocas decenas de nanómetros, incluso mediante el uso de etiquetas relativamente tenues y densas como GFP.

Además, la escala espacial en la que el coeficiente de difusión aparente comienza a disminuir establece el tamaño característico del confinamiento parcial de la proteína por el esqueleto de la membrana en alrededor de 120 nanómetros, de acuerdo con las estimaciones anteriores. Una vez dominado el procedimiento de análisis de datos y esa adquisición se puede lograr en pocos minutos. Creemos que esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular y molecular exploren fácil y cuantitativamente la regulación espacio-temporal de la difusión de proteínas y lípidos en muestras vivas.