Name: De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: Aprende a medir la ley de difusión de lípidos y proteínas en membranas celulares vivas mediante microscopía de fluorescencia total interna. Este método permite analizar dinámica molecular con equipos comerciales estándar.

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Este trabajo está financiado en parte por NIH-P41 P41-RRO3155 y NIH P50-GM076516 (subvención a EG), y Fondazione Monte dei Paschi di Siena (subvención a FB).

Calibración 1. Sistema <ol><li> Spread Function Point (PSF) de calibración <ol><li> Diluir 10 l de 30 nm solución de bolas fluorescentes (aproximadamente 5 mM) en 90 l de agua destilada y luego someter a ultrasonidos la solución durante 20 min. Cortar un cuadrado (1 cm x 1 cm) pieza de gel de agarosa (3%) y depósito de 10 l de la solución en la parte superior del gel. Volcar la pieza de gel en el cristal de fondo de un plato Petri 2 cm y exprimir la caída en el cristal. </li><li> A su vez en la configuración de la adquisición, se coloca la muestra en el soporte, ajuste la exposición de la cámara y EMgain (100 ms y 1000 son buenos parámetros pero optimizan según el sistema) y esperar a que la cámara se enfríe. </li><li> Ajuste la exposición de la cámara a 100 ms, cámara EMgain a 1000, el modo de adquisición al fotograma de transferencia, 100 repeticiones y auto ajuste de ahorro. </li><li> Usando el ocular y enfoque la luz transmitida en la frontera del gel y luego mover el objetivo hacia el centro del gel, ajustar el enfoque y STAta el procedimiento de alineación láser (en LAS AF, seleccione &quot;Configuración TIRF &#39;y siga el procedimiento de alineación automática). </li><li> Encuentra un campo de visión con manchas individuales aisladas, precisa centrarse en el punto más brillante (que por lo general representa los granos agregado) como referencia, adquirir 100 cuadros y repita el paso 5-6 veces con el fin de adquirir varios puntos individuales. </li><li> Importar la serie adquirida a un programa de procesamiento de datos y un promedio de la pila en el tiempo (Figura 1A) y seleccionar un único glóbulo aislado. Tenga cuidado de seleccionar los más pequeños para evitar agregados de partículas. </li><li> Montar la distribución seleccionada intensidad (un ejemplo de perfil único cuentas se presenta en la Figura 1B) con una función de Gauss con el comando &quot;gaussfit&quot; (en las herramientas ICS-Matlab en los Materiales en Matlab). Verificar la bondad del ajuste mediante la inspección de los residuos obtenidos (un ejemplo de perfil gaussiano equipada con los residuos correspondientes i se presentan Figura 1B). </li></ol></li><li> Calibración de la cámara <ol><li> Encienda la cámara y espere a que la cámara se enfríe. AJUSTE adquisición de la cámara, (es decir, para la cámara utilizada fijamos la exposición a 0,5 ms, cámara EMgain a 1000, el modo de adquisición de modo recortada, el tamaño ROI de 32 x 128, 10.000 repeticiones) y comenzar la adquisición del fondo de la cámara señal. </li><li> Importación adquirió serie del marco de un programa de procesamiento de datos. Calcular e inspeccionar la intensidad media en cada píxel con el fin de verificar que el fondo de la cámara es aproximadamente plana en la región seleccionada del chip. En el modo recortada, retire la primera y las últimas líneas horizontales (3 a 10 dependiendo del tamaño de la ROI) para cada trama porque el fondo de cámara está normalmente sesgado en las líneas fronterizas. </li><li> Crear un histograma de los valores (también definido de nivel digital, DL) en imágenes adquiridas Stack (con el comando &#39;hist&#39; en Matlab) y trazar el logaritmode resultar frecuencia (con el comando semilogy en Matlab). Un ejemplo de la distribución de DL para el fondo de la cámara se presenta en la Figura 2. NOTA: Si la cámara está funcionando bien, el gráfico mostrará un pico de aproximadamente gaussiana (un perfil parabólico en el diario de escala) que representa la distribución de los valores asociados al fotón cero seguido de un decaimiento exponencial (una recta con pendiente negativa en el diario de escala ) que representa la distribución de los valores asociados a 1 de fotones (Figura 2). En particular, el centro y la varianza de la función gaussiana representan el desplazamiento de la cámara y de error, respectivamente, mientras que la constante de desintegración de la parte exponencial representa una estimación de la DL asignado por la cámara para cada fotón único. En Matlab utilizar la sección &quot;CalibrateCamera&quot; de la escritura en los materiales de apoyo. </li><li> Repita la operación para toda la cámara seleccionada EMGain y Ganancia. </li></ol></li></ol> 2. EtiquetadaPreparación de células <ol><li> Para preparar los liposomas requeridas para la incorporación de lípidos 36, se disuelven por separado 1 mg de DOPE (1,2-dioleoyl- sn-glicero-3 fosfoetanolamina), 1 mg de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano), y 1 mg de PPE-ATTO488 en 1 ml de cloroformo. Mezclar 0,5 ml de solución de DOPE, 0,5 ml de solución de DOTAP, y 25 l de solución de PPE-ATTO488 y secar a vacío durante 24 horas. Añadir 0,5 ml de tampón HEPES 20 mM, vórtice durante 15 minutos y se somete a ultrasonidos durante 15 min a 40 ° C. </li><li> Para preparar la celda, lavar 3 veces con PBS un plato p100 de confluente CHO-K1 (ovario de hámster chino), añadir 1 ml de tripsina y almacenar en incubadora durante 5 min. Suspender células desprendidas adición de 9 ml de medio DMEM / F12 suplementado con 10% de FBS y SEED 150 l de solución de células en una placa de Petri que contiene 800 l del mismo medio. </li><li> Almacenar en incubadora durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Para la incorporación de lípidos, reemplace medio celular con 500l de medio libre de suero; después de 30 minutos, añadir 2 l de solución de liposomas; después de 15 minutos de lavado con PSB y añadir nuevo medio DMEM / F12 para imágenes. </li><li> Para la transfección, transfectar células según el protocolo Lipofectamine (las instrucciones del fabricante) utilizando el plásmido TfR-GFP y tienda de 24 horas en la incubadora antes de exponer. </li></ol> 3. Adquisición de Datos <ol><li> Preparación de instalación <ol><li> Con el fin de termostato el microscopio, 24 h antes del experimento encender la incubadora. </li><li> Con el fin de aplicar el tiempo de adquisición más rápido posible, el trabajo en el modo de sensor recortada (véase la introducción) y el uso de una primera cámara para obtener imágenes (cámara 1) y la segunda cámara para seleccionar la celda (cámara 2). Un esquema de la configuración de la instalación se presenta en la Figura complementario S1. Entonces, para alinear el turno dos cámaras en el microscopio y esperar a que las cámaras se enfríen. </li><li> Ubicado en ambas cámaras los parámetros para la imagen de luz transmitida (es decir, </em&gt;, 20 ms para el tiempo de exposición, 1 para EM Gain) y poner el microscopio en el modo Campo Claro. </li><li> Poner las muestras en el soporte y enfocar con el ocular, enviar la luz a la cámara 1 y empuje suavemente hacia las ranuras permitiendo que la luz sólo en el retorno de la inversión se utiliza para obtener imágenes de células (en este caso un ROI de 32 x 32 píxeles). </li><li> Mover una celda de la región seleccionada y enviar la luz a la cámara 2, a continuación, dibuje un retorno de la inversión en el software que controla la cámara 2 con el fin de tener una referencia. </li></ol></li><li> Imaging (Figura 3A) <ol><li> En primer lugar, alinear el láser TIRF acuerdo con el procedimiento de su configuración. En nuestra configuración, seleccione el &#39;setup TIRF&#39; e iniciar el procedimiento de alineación automática. Cuando está alineado el láser establecer 70 nm de profundidad de penetración (aproximadamente 70 °). </li><li> Establecer el tiempo de exposición a 70 ms y EMGain a 100 tanto en las cámaras 1 y 2; a continuación, seleccione una celda usando la cámara 1, a continuación, enviar la luz en la cámara 2 y enfocar con precisión la membrana celular. Ajuste la exposición mínima en caMera 2, 1000 EMGain, modo de sensor recortada, 10 5 repeticiones y autoguardado establecer como archivos FITS (Flexible Image Transport System, un formato que puede ser fácilmente administrado). </li><li> Iniciar la adquisición de grabar la serie de imágenes. Suelte la ganancia y el modo recortada para permitir la estabilización de temperatura antes de adquirir un nuevo celular, a continuación, repita los dos últimos pasos para la adquisición de 8-10 células. </li></ol></li></ol> 4. Cálculo del Mean Square Desplazamiento de imágenes (i MSD) NOTA: El siguiente protocolo se puede aplicar directamente a los datos en bruto. Al mismo tiempo, todo el protocolo es válido para adquisiciones de datos simulados tanto en Matlab y en SimFCS. El enlace a los tutoriales correspondientes se pueden encontrar en la sección &quot;Materiales&quot;. <ol><li> Cálculo por Matlab <ol><li> Importar la serie adquirida a Matlab usando la escritura ImportImageSeries. Calcular la intensidad media de cada imagen en el tiempo mediante el command significar en los primeros 2 dimensiones y el uso de parcela para ver el vector resultante. </li><li> Si más del 10% de photobleaching está presente, desechar la serie o eliminar la primera parte de ellos. Si es inferior, tratar de corregir el efecto sobre la función de correlación restando a cada imagen su intensidad media, como se muestra antes de 37. </li><li> Calcular el promedio de intensidad de cada píxel mediante el uso de media en la tercera dimensión y ver la imagen resultante. Se requiere una atención especial para evitar correlaciones de artefactos: NOTA. De hecho, como se muestra anteriormente para técnicas similares 38, los bordes de celda, así como de las vesículas de enfoque podría introducir una fuerte correlación. Si la inspección de la imagen promedio revela los bordes de celda o de vesículas de enfoque, tratar de excluir la región que participan de lo contrario descartar la adquisición. Para corregir el efecto de estas estructuras inmóviles restar la intensidad media temporal de cada píxel 39. </li><li> Calcular tél correlación espacio-temporal (G (ξ, χ, τ)) mediante el uso de la función CalculateSTICScorrfunc. Eliminar G (ξ, χ, 0) porque la correlación debido al ruido de un disparo en régimen de poca luz domina G (0,0,0); la correlación debido al domina el detector G (± 1,0,0), y el movimiento de las partículas durante el tiempo de exposición podría deformar G (ξ, χ, τ) para τ = 0 mediante el aumento de la cintura medido (este efecto desaparece para τ &gt; 0) 34. </li><li> Promedio de G (ξ, χ, τ&gt; 0) usando un tiempo de-bin logarítmica para reducir el ruido mediante el uso de la función &quot;LogBinStack&quot; en el material de apoyo y luego se ajusta el G resultante (ξ, χ, τ) usando la función &quot;gaussfit&quot; de las herramientas ICS-Matlab en los Materiales para recuperar el i MSD (la segunda columna de la matriz resultante). </li><li> Trazar la σ obtenido de la cintura (τ) 2 (i MSD) como una función del tiempo. Si los datos son demasiado ruidosos, tratar de aumentar el número de acqumarcos IRED, aumentan la potencia del láser, la media más G (ξ, χ, τ) juntos. </li></ol></li><li> Cálculo por SimFCS <ol><li> Abra los archivos adquiridos con ImageJ usando BIOFORMAT importador plugin y guardar serie adquirida como secuencia Tiff. </li><li> Abrir herramienta SimFCS y seleccione RICS y seleccione Archivo&gt; Importar imágenes múltiples (Figura suplementaria S2). </li><li> Seleccione Fit, introduzca los parámetros de adquisición correctos y cerrar la ventana de ajuste (Figura complementario S3). </li><li> Seleccione Pantalla&gt; Intensidad Media&gt; CH1 y verificar la presencia de photobleaching (que complementa la figura S4). </li><li> Si más del 10% de photobleaching está presente descarte la serie o si es posible la carga de nuevo la secuencia de imágenes de retirar la primera parte de la serie. </li><li> Si blanquear es inferior al 10% seleccione Herramientas&gt; i MSD&gt; Ajustar parámetros, reviso &#39;Uso de media móvil&#39;, situado en el panel de retorno de la inversión de la izquierda unúmero de marco para la atención de pagar de media móvil que el tiempo corresponsal es mayor que el tiempo de difusión característica (por partícula que se mueve a 1 m 2 s-1 un tiempo de 10 segundos es una buena media móvil) </li><li> Seleccione Herramientas&gt; IMSD&gt; Calcular i MSD (Figura S5) y en forma y exportar el i MSD del cojín de nota (Figura S6). </li></ol></li></ol> 5. Cálculo de la Ley de Difusión de la i MSD <ol><li> Montar los primeros puntos para extrapolar el intercepto (σ 0 2) (5 puntos suelen ser suficiente, pero más puntos se pueden instalar si muestran un comportamiento lineal) y comparar este valor con el PSF medido previamente 2. Si son comparables, se están siguiendo la dinámica de fluoróforos aisladas. Por el contrario, si σ 0 2 &gt;&gt; PSF 2 tratar de adquirir más rápido para asegurar quedinámica ocultos están presentes 34. </li><li> Calcular la difusividad aparente (app D) y el desplazamiento medio (R) utilizando las ecuaciones 3 y 4 (véase la introducción). </li><li> Parcela aplicación D como una función de R para obtener una ley de difusión comparable con lo que se mide con la variación lugar basado FCS 12 (Figura 3D). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Rastreo de partículas Individual (SPT) representa una de las estrategias más comunes para estudiar la dinámica molecular y tiene la gran ventaja de la medición de trayectorias de las partículas. Esto a su vez permite sondear el comportamiento de incluso pocas partículas marcadas en un sistema complejo. Sin embargo, para alcanzar esta ventaja SPT típicamente necesita una baja densidad de la sonda y etiquetas muy brillantes. Particularmente, para obtener alta resolución temporal (rango mu s) sonda inorgánico normalmente s...

A partir del modelo original "mosaico fluido" de Singer y Nicolson, la imagen de la membrana plasmática celular se ha actualizado continuamente durante las últimas décadas con el fin de incluir el papel emergente de citoesqueleto y lípidos dominios 1,2. Las primeras observaciones fueron obtenidos por la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) descubrimiento de que una fracción significativa de proteínas de la membrana es inmóvil 3-5. Estos estudios pioneros, aunque muy informativo, sufrieron de la relativamente pobre resolución en el espacio (micras) y el tiempo (segundos) de las configuraciones del FRAP. Además, al ser una medida promedio de conjunto, FRAP le falta en dar información sobre el comportamiento de una sola molécula. En este contexto, la posibilidad de etiquetar específicamente una única molécula con etiquetas muy brillantes (lo que permite el estudio del proceso de difusión de una molécula a la vez) ha sido muy exitosa. Particularmente, empujando elresolución en el tiempo del enfoque único de rastreo de partículas (SPT) de la escala de tiempo de microsegundos, Kusumi, et al. obtenido acceso a características desconocidas de la dinámica de lípidos y proteínas que contribuyeron en gran medida al reconocimiento del papel de esqueleto de la membrana actina basada en la fisiología de la membrana 6 , 7. Estos resultados generan la llamada el "piquete y la valla" modelo, en el que los lípidos y la proteína está regulada por la difusión esqueleto basado en actina. Sin embargo, con el fin de tener acceso a la enorme cantidad de información proporcionada por SPT muchos temas experimentales que abordar. En particular, el procedimiento de etiquetado se compone típicamente por muchos pasos como la producción, la purificación y la introducción de las especies marcadas en el sistema. Por otra parte, las grandes etiquetas, al igual que los puntos cuánticos o nanopartículas metálicas, a menudo se requieren para llegar a la escala de tiempo sub-milisegundo y la reticulación de las moléculas diana por la etiqueta no se podría evitar en muchos casos. Por último, muchas trayectoriastienen que ser registrado para adaptarse a criterios estadísticos y concomitantemente se requiere una baja densidad de la etiqueta para permitir el seguimiento. En comparación con SPT, espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), la superación de muchos de estos inconvenientes, representa un enfoque muy prometedor para estudiar la dinámica molecular. De hecho, FCS también funciona bien con etiquetas tenues y densas, lo que permite estudiar la dinámica de moléculas de proteínas etiquetadas fluorescentes en las células transfectadas transitoriamente. Además, permite alcanzar altas estadísticas en una cantidad limitada de tiempo. Por último, a pesar de la densidad de "alta" de etiquetas FCS proporciona información moléculas individuales. Gracias a todas estas propiedades, FCS representa un enfoque muy sencillo y se ha aplicado ampliamente para estudiar la dinámica de lípidos y proteínas tanto en membranas modelo y en las células vivas 8-10. Se han propuesto muchos enfoques diferentes para aumentar la capacidad de FCS para revelar los detalles de la difusión molecular. Por ejemplo, era shpropia que mediante la realización de FCS en áreas de observación de diferentes tamaños se puede definir una "ley de difusión FCS" características esclarecedoras ocultos de movimiento molecular 11,12. Además de ser variado en tamaño, la esfera de actividad también se duplicó 13, se trasladó en el espacio a lo largo de las líneas 14-20 o conjugados con cámaras rápidas 21,22. El uso de estos correlación 'espacio-temporal' enfoques, parámetros biológicos relevantes de varios componentes de la membrana se designarán cuantitativamente por ambas membranas modelo y las biológicas reales, por tanto, una visión que dé en la membrana organización espacial. Sin embargo, en toda la FRAP y aplicaciones FCS descrito hasta ahora el tamaño de la esfera de actividad representa un límite de la resolución espacial que no puede ser superada. Varios métodos de imagen super-resolución se han desarrollado recientemente para eludir este límite. Algunos se basan en la precisión de localización, como la microscopía óptica reconstrucción estocástico (TORMENTA) &lt;sup&gt; 23,24, microscopía de localización de fotoactivación (Palm) 25, PALM fluorescencia (FPALM) 26, y de una sola partícula de seguimiento de palma (sptPALM) 27: la cantidad relativamente grande de fotones requeridas en cada instantánea, sin embargo, limita la resolución de tiempo de estos métodos a por lo menos varios milisegundos, lo cual dificulta su aplicabilidad en vivo. En contraste, una alternativa prometedora para formación de imágenes de súper resolución haber sido abierto por modular espacialmente la emisión de fluorescencia con los métodos de agotamiento de la emisión estimulada (STED o transiciones reversibles saturables ópticos de fluorescencia (RESOLFT)) 28,29. Estos enfoques se combinan la conformación del volumen de observación muy por debajo del límite de difracción con la posibilidad de usar microscopios de barrido rápido y sistemas de detección. En combinación con el análisis de fluctuación de fluorescencia, microscopía STED permitió a la sonda directamente la dinámica espacio-temporales a nanoescala de lípidos y proteins en las membranas celulares en vivo 30,31. Las mismas cantidades físicas de microscopia basado en STED se pueden obtener por una espectroscopia de correlación de imagen espacio-temporal método modificado (STICS 32,33) que es adecuado para el estudio de la dinámica de las proteínas etiquetadas con fluorescencia de membrana y / o lípidos en células vivas y por un microscopio comercial. El protocolo experimental que se presenta aquí está compuesto por dos pasos. La primera de ellas requiere una imagen rápida de la región de interés en la membrana. Entonces, la pila resultante de imágenes se utiliza para calcular las funciones de correlación promedio espacio-temporales. Mediante el ajuste de la serie de funciones de correlación, la "ley de difusión 'molecular puede ser obtenida directamente de formación de imágenes en forma de una difusividad aparente (D app) - vs -Promedio trazado de desplazamiento. Esta parcela depende de manera crítica sobre el medio ambiente explorado por las moléculas y permite reconocer directamente los modos de difusión realesdel lípido / proteína de interés. En más detalles, como se indica anteriormente 34, la función de auto-correlación espacio-temporal de la serie de imagen adquirida depende fundamentalmente de la dinámica de las moléculas que se mueven en la serie de imágenes recogido (por favor, tenga en cuenta que el mismo razonamiento se puede aplicar en una adquisición de la línea donde se considera sólo una dimensión en el espacio). En particular, definimos la función de correlación como: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230"> (1) donde <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50"> representa la intensidad de fluorescencia medido en la posición x, y y en el tiempo t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8"> y <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> representa la distancia en la x yY. respectivamente, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> representa el intervalo de tiempo, y <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20"> representa la media. Esta función puede expresarse como: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230"> (2) donde 'N' representa el número medio de moléculas en el área de observación, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10"> representa la operación de convolución en el espacio, y <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50"> representa la autocorrelación de la cintura instrumental. Este último puede interpretarse como una medida de cómo están distribuidos los fotones de un solo emisor en el espacio debido a la configuración óptica / grabación (el llamado Point Spread Function, PSF, genRally bien aproximada por una función de Gauss). Finalmente, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50"> representa la probabilidad de encontrar una partícula a una distancia <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10"> y <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> después de un tiempo de retardo <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> . Si tenemos en cuenta una dinámica de difusión, en el que las partículas se mueven al azar en todas las direcciones y los flujos netos no están presentes, esta función también está bien aproximada por una función gaussiana donde la varianza puede ser identificado como el Mean Square Desplazamiento (MSD) de la partícula en movimiento . Por lo tanto, la cintura de la función de correlación (también referido como <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30"> ), Se puede definir como la suma de los trastornos musculoesqueléticos de partículas y la cintura instrumental y puede ser medida por un ajuste de GaussTing de la función de correlación para cada retardo de tiempo. La medida i MSD se puede utilizar para calcular una aparente difusividad de las moléculas que se mueven <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40"> y un desplazamiento medio <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40"> como: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170"> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170"> (4) Algunas consideraciones sobre la configuración experimental utilizado puede guiar al lector a través de las siguientes secciones. Con el fin de excitar selectivamente los fluoróforos en la membrana basal de las células que utilizaremos una iluminación reflexión interna total (TIR) ​​que viven, utilizando una fluorescencia TIR comercial (TIRF) microscopio (los detalles se pueden encontrar en la sección de materiales). Por otra parte, con el fin de recoger ªe fluorescencia vamos a utilizar un objetivo de gran aumento (100X NA 1,47, se requiere una alta apertura numérica para iluminación TIRF) y una cámara de EMCCD (tamaño físico del píxel en el chip 16 micras). Para llegar a un tamaño de píxel de 100 nm aplicamos una lente de aumento adicional de 1.6X. Como se discute más adelante, una resolución de tiempo por debajo de 1 mseg sería necesario para describir adecuadamente la dinámica de los lípidos de membrana rápido por debajo de 100 nm. Para llegar a esta resolución temporal que necesitamos para seleccionar una región de interés (ROI) más pequeño que todo el chip de la cámara (512 x 512). De esta manera, la cámara leer un número reducido de líneas de aumento de la resolución en el tiempo. Sin embargo, en este régimen de lectura de la hora marco estaría limitado por el tiempo requerido para cambiar los cargos de la exposición a la lectura del chip de la cámara y está normalmente en el orden de milisegundos para EMCCD 512 x 512 píxel. Para superar este límite, una tecnología emergente permite desplazar las líneas de retorno de la inversión sólo en lugar de todo el marco, won una reducción práctica efectiva del tamaño del chip expuesto (llamado Modo Sensor recortada en nuestra EMCCD). Para que esta configuración sea eficaz, el chip fuera de la ROI debe estar cubierto por un par de hendiduras montados en el camino óptico. Gracias a esta configuración una resolución de tiempo hasta 10 -4 segundo se puede lograr. Tenga en cuenta, sin embargo, que este enfoque puede combinarse con diversos montajes experimentales, como se explica en la sección de "discusión". Demostración del método que se proporcionará en células vivas, usando tanto un marcado ATTO488 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 fosfoetanolamina (ATTO488-PPE) y una variante de GFP marcado del receptor de transferrina (GFP TfR). En el caso de ATTO488-PPE este enfoque puede recuperar con éxito una aplicación casi constante D como una función del desplazamiento medio indica una difusión sobre todo libre, como se informó anteriormente 30,35. Por el contrario, TfR-GFP muestra una disminución D confinado-6. Además, en el último caso, es posible cuantificar la constante de difusión local y el área promedio de confinamiento durante muchos micras en el plano de la membrana.

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 etiquetado PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850725</tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Lípidos Polares, Inc.</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina-Estreptomicina-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals Software</td><td></td><td>el software se puede descargar aquí: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td></tr> <tr><td>DMI6000 con módulo TIRF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Lipofectamine</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>C-terminal GFP marcado Receptor de Tranferrina</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de látex, fluorescente amarillo-verde, 30 nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>SONICA Limpiadores ultrasónicos</td><td>SOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>Petri Placas</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Importador de bioformato para Matlab</td><td></td><td></td><td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td></tr> <tr><td>ICS-MatLab Tools</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td></tr><tr><td>Tutorial de simulación de Matlab https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tutorial</td><td></td><td></td> <td>de simulación de SimFCShttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

de fluorescencia fast imaging a la ley de difusión molecular en membranas de células vivas en un microscopio comercial

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Es cada vez más evidente que la distribución espacial y el movimiento de los componentes de la membrana, como lípidos y proteínas son factores clave en la regulación de muchas funciones celulares. Sin embargo, debido a la dinámica rápida y las diminutas estructuras involucradas, se requiere una resolución espacio-temporal muy alta para capturar el comportamiento real de las moléculas. Aquí presentamos el protocolo experimental para el estudio de la dinámica de las proteínas y los lípidos del plasma membrana fluorescencia marcado en células vivas con alta resolución espacial y temporal. En particular, este enfoque no es necesario realizar un seguimiento de cada molécula, pero calcula comportamiento de la población utilizando todas las moléculas en una región dada de la membrana. El punto de partida es una imagen rápida de una determinada región de la membrana. Después, una función de autocorrelación espacio-temporal completa se calcula la correlación de imágenes adquiridas a aumentar los retardos de tiempo, por ejemplo cada 2, 3, n repeticiones. Es posible demostrar que el anchodel pico de los incrementos espaciales función de autocorrelación en el aumento de retardo de tiempo como una función del movimiento de las partículas debido a la difusión. Por lo tanto, encajando de la serie de funciones de autocorrelación permite extraer la proteína real significa desplazamiento cuadrático de formación de imágenes (IMSD), que aquí se presenta en forma de difusividad aparente vs desplazamiento medio. Esto produce una vista cuantitativo de la dinámica promedio de moléculas individuales con una precisión nanométrica. Mediante el uso de una variante de GFP-etiquetados del receptor de transferrina (TfR) y un ATTO488 el nombre 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 fosfoetanolamina (PPE) es posible observar la regulación espaciotemporal de la difusión de proteínas y lípidos en regiones de membrana-micras de tamaño en el rango de tiempo-micro-para mili-segundos.

Con el fin de calibrar la cintura instrumental, la imagen de un solo cordón de nano-fluorescente puede ser medida como se describe en el Protocolo paso 1.1. Una imagen fluorescente típica de estas cuentas se presenta en la Figura 1. La instalación de distribución de intensidad mediante una función gaussiana 2D devuelve buenas residuos y permite la medición de la cintura instrumentales a 270 nm. Este valor está en buen acuerdo con el límite de difracción esperado estimado por la ecuación de Rayleigh. Est...

La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la ley de difusión de lípidos y proteínas en las membranas de las células vivas para hacer esto. En primer lugar, la función de dispersión puntual del microscopio se calibra mediante la obtención de imágenes de perlas fluorescentes nanoscópicas. A continuación, se preparan vectores basados en liposomas, incluida una molécula de interés marcada con fluorescencia, y se introducen en células vivas mediante transfección o incorporación directa.La obtención rápida de imágenes de la membrana plasmática de células vivas se realiza mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Finalmente, se calcula la función de correlación y se extrae la ley de difusión molecular mediante ajuste gaussiano. Los datos resultantes.Identificar el modo de movimiento del lípido o proteína bajo investigación. La principal ventaja de esta técnica sobre la recuperación de fluorescencia convencional después del enfoque de fotoblanqueo o la espectroscopia clásica de correlación de fluorescencia de un solo punto es que permite medir la ley de difusión molecular. Sabemos que el conocimiento es prioritario del sistema.También a diferencia de las metodologías clásicas de seguimiento de una sola partícula. Aquí, el desplazamiento mular se mide sin necesidad de extraer las trayectorias de las partículas. Como consecuencia, este metal se puede utilizar fácilmente en combinación con moléculas relativamente densas como, por ejemplo, las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente.En general, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular celular, como por ejemplo, cómo el movimiento de las proteínas o los lípidos regula la estructura de la membrana plasmática y la organización funcional, la respuesta a estas y otras preguntas relacionadas estará disponible para todos y, mediante el uso de solo un microscopio comercial, la demostración del procedimiento general será realizada por zo, un estudiante de doctorado del laboratorio. Comience este protocolo calibrando la función de dispersión de puntos del sistema de imágenes. Comience diluyendo 10 microlitros de una solución de perlas fluorescentes en 90 microlitros de agua destilada previamente agregada a un tubo de centrífuga de 500 microlitros.Sonicar la solución durante 20 minutos en un baño de sauna con un bisturí, cortar un trozo cuadrado de un centímetro de gel de rosas AGA al 3% y colocarlo en una placa de Petri. Deposite 10 microlitros de la solución de perlas fluorescentes diluidas en la parte superior del gel. Luego, con pinzas, invierta la pieza de gel en una placa de Petri de vidrio de dos centímetros.De nuevo, usando fórceps. Empuja hacia abajo el trozo de gel para dispersar la gota. A continuación, encienda la configuración de adquisición, que consiste en un microscopio comercial de fluorescencia de reflexión interna total.Equipado con una incubadora y una rápida cámara E-M-C-C-D conectada a una computadora que ejecuta una suite de aplicaciones, software fluorescente avanzado y / o software de adquisición de imágenes Solís. Coloque la muestra en el soporte de la platina del microscopio utilizando la pieza I y la luz transmitida. Concéntrate en el borde del gel.A continuación, centre el gel sobre el objetivo y ajuste el enfoque para iniciar el procedimiento de alineación láser en el conjunto de aplicaciones Leica, el software fluorescente avanzado, seleccione la alineación automática y siga el procedimiento de alineación automática. Una vez que el láser se haya alineado en el software de adquisición y/o Solís, haga clic en el botón de configuración. Se abrirá una ventana.Establezca la exposición de la cámara en 100 milisegundos, la EM ganada en 1000, la repetición en 100 y marque la casilla de verificación de transferencia de fotogramas. A continuación, haga clic en la ventana de guardado automático e inserte el nombre del experimento. Encuentre un campo de visión con puntos individuales aislados.Concéntrese en un punto brillante, que generalmente representa un agregado de cuentas. A continuación, adquiera 100 fotogramas. Repita este paso cinco o seis veces para obtener imágenes de varios puntos individuales.Importe las series adquiridas a un programa de procesamiento de datos como MATLAB y promedie la pila en el tiempo. A continuación, visualice la imagen de intensidad media medida. Acérquese a un punto fluorescente pequeño y brillante e identifique aproximadamente el centro como el píxel más brillante del punto.Finalmente, seleccione el tamaño de la región de interés que desea dibujar alrededor de la partícula, generalmente una micra al lado para ajustarse a la distribución de intensidad seleccionada con una función gaussiana. Seleccione el comando gause fit. Inspeccione los residuos obtenidos para verificar la bondad del ajuste.Por último, calibre la cámara como se describe en el documento adjunto. Una vez calibrado el sistema, es el momento de etiquetar las celdas para la adquisición de imágenes. Comience a preparar los liposomas necesarios para la incorporación de lípidos disolviendo un miligramo de DOPE, un miligramo de D-O-T-A-P y un miligramo de PPE ADO 4 88 cada uno en un tubo de microcentrífuga separado que contenga un mililitro de cloroformo.A continuación, combine 0,5 mililitros de cada una de las soluciones DOPE y D-O-T-A-P con 25 microlitros de solución PPE ATO 4 88. Coloque el tubo en un evaporador centrífugo e inicie el centrifugado a 280 gs. Encienda la bomba de vacío y déjela girar durante 24 horas.Al día siguiente, agregue 0,5 mililitros de tampón heis de 20 milimolares al tubo y tórtelo durante 15 minutos. A continuación, coloque el tubo en un baño sónico y sonique durante 15 minutos a 40 grados centígrados. Para preparar las células, lave tres veces un plato P 100 de ovario de hámster chino confluente o CHOK una celdas con 10 mililitros de PBS.A continuación, añadir un mililitro de tripsina e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue nueve mililitros de D-M-E-M-F 12 suplementado con un 10% de FBS para suspender las células de siembra de 150 microlitros de esta solución que contiene células. En una placa de Petri con fondo de vidrio de 22 milímetros que contiene 800 microlitros del mismo medio.Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Para la incorporación de lípidos, reemplace el medio celular con 500 microlitros de medio libre de suero e incube durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue dos microlitros de solución de liposomas e incube durante otros 15 minutos.A continuación, lave las células con PBS y añada un nuevo DM EMF 12. Antes de tomar imágenes al menos 12 horas antes del experimento, encienda la incubadora de microscopios para que la etapa del microscopio y los componentes ópticos alcancen la temperatura experimental. El paso más difícil de este procedimiento es esa adquisición.Para garantizar el éxito, asegúrese de optimizar todos los parámetros de adquisición del sistema. En estudio. El día del experimento, encienda el microscopio, espere a que las cámaras alcancen la temperatura de trabajo.Para realizar el experimento, utilizaremos dos cámaras. La cámara uno se utilizará para la toma de imágenes y la cámara dos se utilizará para seleccionar la celda. Esta configuración permitirá el tiempo de adquisición más rápido posible en el software.Para establecer los parámetros de las imágenes de luz transmitida. Introduzca 20 milisegundos Para el tiempo de exposición, introduzca uno para la ganancia EM de ambas cámaras. Luego abra la ventana de modo de contraste en el software y salió.Haga clic en BF para seleccionar la opción de campo brillante. Coloque las muestras en el soporte mientras visualiza la muestra a través de los oculares. Enfoca la muestra.A continuación, envíe manualmente la luz a la cámara uno y empuje suavemente las ranuras para que sólo se ilumine el ROI que se va a fotografiar. A continuación, mueva una celda a la región seleccionada y, utilizando el software, envíe la luz a la cámara dos. Luego, en el software, dibuje un ROI para generar una referencia.Primero, para alinear el láser por software, seleccione alineación automática. A continuación, para iniciar el procedimiento de alineación automática, seleccione habilitar colimador. A continuación, abra la incubadora en la parte superior y colime el rayo láser.Cuando el láser esté alineado en la esquina inferior izquierda de la ventana del software a la izquierda, haga clic en el botón 70 para establecer la profundidad de penetración en 70 nanómetros. Esto corresponderá a un ángulo de incidencia del láser en el cristal inferior de unos 70 grados en el conjunto de aplicaciones de Leica. Cuadro de texto de tiempo de exposición de software fluorescente avanzado.Introduzca 70 milisegundos en el cuadro de texto EM gain. Ingrese 1000 para hacer lo mismo en la cámara dos. Abra la ventana de configuración e introduzca los mismos números en los cuadros de texto correspondientes.A continuación, haga clic en el botón en vivo. La fluorescencia se enviará a la cámara uno y aparecerá una imagen de la muestra en la pantalla. Mueva la muestra hasta que una célula fluorescente alcance la región de referencia de interés.Luego presione el botón en la parte frontal del cuerpo del microscopio para enviar la luz a la cámara dos y mueva la rueda de posición Z con precisión para enfocar la membrana celular en el software o el software. Abra la ventana de configuración y configure el tiempo de exposición mínimo alcanzable 1000 EM ganancia recortada modo de sensor 10 a la quinta repetición, y configure la opción de guardado automático para comenzar a adquirir la serie de imágenes. Haga clic en el icono de la cámara del software y espere a que finalice la adquisición.A continuación, abra la ventana de configuración, desactive la ganancia EM y elimine la marca de verificación de la opción de modo recortado. Durante la adquisición, la temperatura de la cámara suele aumentar entre dos y tres grados. Por lo tanto, antes de adquirir imágenes de una nueva celda, espere hasta que se alcance la temperatura óptima de trabajo.Una vez completadas las imágenes, siga las instrucciones del documento adjunto para calcular el desplazamiento cuadrático medio de las imágenes para obtener una variante marcada con fluorescencia de la molécula de interés. Las células CHOK one se marcaron con ADO 4 88 PPE o se transfectaron con una transferencia en el receptor o T-F-R-G-F-P y se obtuvieron imágenes mediante TIRF como se describe en este video. Como se puede ver aquí, la ley de difusión medida para ADO 4 88 PPE es plana, lo que indica una difusión mayoritariamente libre, como se ha demostrado anteriormente mediante fluorescencia de agotamiento de emisión estimulada, espectroscopia de correlación o mediciones de FCS estables después de la transfección con el T-F-R-G-F-P, la ley de difusión medida para T-F-R-G-F-P es inicialmente plana, permaneciendo por debajo de los 100 nanómetros de desplazamiento molecular promedio con un coeficiente de difusión aparente promedio de aproximadamente 0,7 micras cuadradas por segundo.A esto le sigue una rápida disminución de la difusividad aparente hasta 0,2 micras cuadradas por segundo. El valor medido típicamente por FCS limitado por difracción. Es interesante notar que, como lo muestra este último ejemplo, el enfoque actual puede medir fácilmente el desplazamiento molecular promedio con una resolución de unas pocas decenas de nanómetros, incluso mediante el uso de etiquetas relativamente tenues y densas como GFP.Además, la escala espacial en la que el coeficiente de difusión aparente comienza a disminuir establece el tamaño característico del confinamiento parcial de la proteína por el esqueleto de la membrana en alrededor de 120 nanómetros, de acuerdo con las estimaciones anteriores. Una vez dominado el procedimiento de análisis de datos y esa adquisición se puede lograr en pocos minutos. Creemos que esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular y molecular exploren fácil y cuantitativamente la regulación espacio-temporal de la difusión de proteínas y lípidos en muestras vivas.

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